紅蕓豆植物凝集素長(zhǎng)期陰道給藥對(duì)小鼠陰道上皮細(xì)胞的影響

王靜靜 秦 普 姚婭婷 楊 姚 張 田 王敏康

云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、云南省生物質(zhì)能與環(huán)境生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、生物能源持續(xù)開發(fā)利用教育部工程研究中心(昆明, 650500)

·基礎(chǔ)研究·

紅蕓豆植物凝集素長(zhǎng)期陰道給藥對(duì)小鼠陰道上皮細(xì)胞的影響

王靜靜 秦 普 姚婭婷 楊 姚 張 田 王敏康*

云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、云南省生物質(zhì)能與環(huán)境生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、生物能源持續(xù)開發(fā)利用教育部工程研究中心(昆明, 650500)

目的：觀察長(zhǎng)期陰道使用紅蕓豆植物凝集素(RKBL)對(duì)小鼠陰道上皮細(xì)胞的影響。方法：使用不同濃度的RKBL注入小鼠陰道連續(xù)給藥4個(gè)月后斷頸處死小鼠，取其陰道及周圍組織，制作石蠟切片并經(jīng)蘇木精染色，顯微鏡下觀察陰道組織的形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果：小鼠陰道在濃度≤2.5mg/只的RKBL處理后，無(wú)炎癥病變，陰道粘膜上皮細(xì)胞形態(tài)完好無(wú)破損，皮下組織形態(tài)正常。而當(dāng)給藥濃度提高到5mg/只時(shí)，陰道黏膜淺層上皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡化。結(jié)論：濃度≤2.5mg/只的RKBL長(zhǎng)期使用不會(huì)引起陰道黏膜上皮細(xì)胞及皮下組織的不良反應(yīng)。

紅蕓豆；植物凝集素；殺微生物劑；小鼠；陰道上皮細(xì)胞；切片

殺微生物劑是一種作用于陰道或直腸內(nèi)，可以殺死病原體的天然或合成材料，可以防止人類免疫缺陷病毒(HIV)和其他性傳播疾病(STDs)的感染[1]。近幾年的研究顯示，殺微生物劑作為一種新型預(yù)防STDs的藥劑，越來(lái)越受到人們的關(guān)注。目前國(guó)內(nèi)外所面臨的STDs包括艾滋病(AIDS)的威脅越來(lái)越嚴(yán)峻，僅具備避孕作用的藥物便顯現(xiàn)出了局限性[2]。所以尋找高效、安全，兼具抗STDs功能的殺微生物劑[3]成為研究熱點(diǎn)。在植物凝集素(PHA)抗HIV能力方面，Balzarini等[4]的研究表明，來(lái)源于幾種植物的甘露糖結(jié)合型凝集素可抑制HIV的復(fù)制，另外，N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合型凝集素可防止HIV進(jìn)入T淋巴細(xì)胞。這兩類凝集素在體外培養(yǎng)中還可以阻止人類T淋巴細(xì)胞病毒在細(xì)胞間傳播[5]。蕓豆植物凝集素(KBL)還可有效凝集包括人類在內(nèi)的不同種動(dòng)物的精子，從而達(dá)到避孕的目的。實(shí)驗(yàn)證明低濃度PHA能使絕大部分精子失去游動(dòng)能力，高濃度則會(huì)使精子完全失去活力[6]。KBL因具備上述特性，將有可能發(fā)展成為一種既能凝集精子、抑制受精，又能阻止HIV病毒進(jìn)入細(xì)胞的局部使用的殺微生物劑[7]。利用PHA阻斷STDs，旨在陰道內(nèi)建立一道精液與陰道黏膜上皮之間保護(hù)屏障，在凝集精子、發(fā)揮避孕作用的同時(shí)，也可阻止病毒穿越屏障感染細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)以不同濃度的紅蕓豆植物凝集素(RKBL)注入小鼠陰道內(nèi)，觀察不同濃度的RKBL長(zhǎng)期作用于陰道內(nèi)壁，是否會(huì)損壞陰道上皮黏膜細(xì)胞，以期為KBL作為陰道內(nèi)殺微生物劑進(jìn)入臨床使用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑的制備

RKBL由本實(shí)驗(yàn)室從紅蕓豆中提取，然后濃縮至所需濃度，采用雙縮脲法測(cè)定其蛋白質(zhì)含量。設(shè)置高中低3個(gè)藥物處理組，蛋白含量分別為250mg/ml、125mg/ml和50mg/ml,每只小鼠注入0.02ml。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及取材

體重約為20～24g的雌性小白鼠(昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)入)在室溫21～24℃條件下飼養(yǎng)，光照條件為12L:12D，自由攝食和飲水，動(dòng)物適應(yīng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物體重?zé)o顯著差異。陰道給予不同濃度的RKBL。按王昌梅[6]等的劑量設(shè)定，48只雌性小白鼠隨機(jī)分為4組，每組12只。其中一組為對(duì)照組，采用陰道注入的給藥方式注射0.02 ml磷酸緩沖液。另外3組為實(shí)驗(yàn)組，即高、中、低劑量組，均采用同樣方式注入含量分別為250 mg/ml、125 mg/ml和50 mg/ml的RKBL，每只注入0.02 ml，即5 mg/只、2.5 mg/只和1 mg/只。每48 h給一次藥，連續(xù)給藥4個(gè)月后先進(jìn)行血樣采集，然后處死小鼠并分離臟器，同時(shí)分離陰道及周圍組織；固定在10%中性甲醛固定液中，待組織切片。

1.3 顯微觀察

石蠟包埋和切片步驟參照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行。每組隨機(jī)抽取6個(gè)小鼠陰道樣本連續(xù)切片(厚度為10 μm)，用蘇木精-伊紅(HE)染色，鏡檢觀察，觀察的切片均來(lái)自陰道的中部，每只小鼠材料觀察4～5張切片并拍照記錄。

2 結(jié)果

2.1 陰道黏膜上皮給藥后觀察

肉眼觀察，經(jīng)過(guò)3種濃度的RKBL長(zhǎng)期作用，小鼠陰道粘膜均未出現(xiàn)明顯異常及充血、水腫或其他明顯病理改變，肉眼未觀察到陰道粘膜上皮出現(xiàn)毒理效應(yīng)。在光學(xué)顯微鏡下觀察到，中劑量組和低劑量組小鼠陰道粘膜表面的上皮細(xì)胞無(wú)破損現(xiàn)象，層次清晰，排列有序，沒(méi)有炎癥、增生、病變現(xiàn)象；而高劑量組(圖1G、H)陰道粘膜淺層上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜完整，胞質(zhì)出現(xiàn)空泡化現(xiàn)象；中劑量組和低劑量組與對(duì)照組切片比較均未出現(xiàn)明顯差異(圖1A-1H)。

3 討論

目前市面上還沒(méi)有一種安全有效的的殺微生物劑產(chǎn)品。 現(xiàn)階段很多已經(jīng)進(jìn)人體臨床試驗(yàn)的藥物一般都是凝膠劑型或生物黏附劑型[9-12]。常見的殺精子劑為壬苯聚醇-9，但壬苯聚醇-9會(huì)引起陰道上皮細(xì)胞的破損，而陰道上皮的損傷又將會(huì)增加包括HIV在內(nèi)的病毒的感染風(fēng)險(xiǎn)。并且已有實(shí)驗(yàn)證明壬苯聚醇-9會(huì)引起直腸上皮的明顯大片脫落[13]。世界衛(wèi)生組織(WHO)在2001年就已發(fā)布報(bào)告，稱含壬苯聚醇-9的殺精子劑不但不能起到預(yù)防HIV的作用，反而會(huì)增高HIV感染的風(fēng)險(xiǎn)[13]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，在對(duì)小鼠進(jìn)行長(zhǎng)期陰道注入濃度≤2.5mg/只的RKBL后，光學(xué)顯微鏡下陰道組織及上皮細(xì)胞完整，無(wú)破損、裂解現(xiàn)象。細(xì)胞排列有序，層次清晰，沒(méi)有出現(xiàn)炎癥或組織增生現(xiàn)象。與對(duì)照組沒(méi)有明顯差異。由此可見，濃度≤2.5mg/只的RKBL不會(huì)引起小鼠陰道上皮細(xì)胞的不良反應(yīng)，應(yīng)用于陰道是安全的。之前也有實(shí)驗(yàn)證明蕓豆PHA對(duì)婦女陰道無(wú)刺激，不會(huì)產(chǎn)生任何不適感[14]。并且已有實(shí)驗(yàn)表明一些PHA能夠抑制HIV整合酶的作用，其中RKBL在一定程度上可以抑制HIV-1整合酶[15-16]。PHA與其他臨床上用于抗AIDS的藥物共用時(shí)，幾乎不影響其它藥物的抗病毒活[15-16]。本實(shí)驗(yàn)室以往的研究發(fā)現(xiàn)，低濃度RKBL能有效地凝集精子，高濃度則直接致死精子，因此RKBL可有效抑制受精。此外，每天對(duì)小鼠陰道注射RKBL(≤2.5 mg/只)，連續(xù)注射4個(gè)月，不會(huì)影響小鼠的正常攝食和行為，并且不會(huì)影響小鼠的尿液生化指標(biāo)和臟器系數(shù)，但對(duì)小鼠的一些血液學(xué)和生化指標(biāo)影響不明確(本實(shí)驗(yàn)室未發(fā)表資料)。

本研究結(jié)果表明，對(duì)小鼠進(jìn)行陰道注射RKBL 2.5 mg/只的劑量是安全的，按昆明小鼠體重為40 g估算，即小鼠安全劑量為62.5 mg/kg體重，按動(dòng)物與人體間的等效劑量換算[17]，可推算其對(duì)應(yīng)的成人劑量為5.1 mg/kg。按人類女性體重為50 kg估算，人類的安全劑量為253.1 mg/人。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室以往研究結(jié)果及人體應(yīng)用實(shí)踐，擬定的人體使用劑量是安全劑量的1/16～1/10。這也說(shuō)明了RKBL在人類女性陰道使用具有很高的安全性。在開發(fā)避孕和抑菌抗病毒凝膠中，KBL濃度僅為5mg/ml, 按每次避孕劑量3～4ml計(jì)算，實(shí)際使用量為15～20mg，不足壬苯醇醚類避孕殺精劑濃度的50%。另外， KBL還可促進(jìn)陰道乳酸菌的增殖，維護(hù)陰道和腸道的益生菌平衡[18]?；谏鲜鰞?yōu)點(diǎn)，筆者認(rèn)為KBL既適合于具有避孕作用的陰道內(nèi)殺微生物劑，也適合于直腸使用，在臨床應(yīng)用中具有廣闊的前景。

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[責(zé)任編輯：王麗娜]

The influence of vaginal injected red kidney bean lectin for a long time on vaginal epithelial cells of mice

WANG Jingjing, QIN Pu, YAO Yating, YANG Yao, ZHANG Tian, WANG Minkang*

SchoolofLifeSciences，YunnanNormalUniversity；KeyLabofYunnanProvinceforBiomassEnergyandEnvironmentalBiotechnology；EngineeringResearchCenterofSustainableDevelopmentandUtilizationofBiomassEnergy，MinistryofEducation, 650500

*Correspondingauthor：wangmk1998@163.corn

Objective: To explore the influence of vaginal injected red kidney bean lectin(RKBL) on vaginal epithelial cells of mice. Method: Mice were injected vagina of different concentrations of RKBL for four months continually, and all mice were decapitated after four months administration and their vagina and surrounding tissues were fixed in formaldehyde solution. In order to investigating their histological changes, the vaginas tissues were done paraffin section and hematoxylin eosin stained. Result: When concentrations of RKBL at 2.5mg or below injected in each mouse for four months administration, vaginal mucous membrane were non hyperemia inflammation expression, and the vaginal epithelial cells or tissues remained intact and normal form. While the concentration of RKBL increased to 5 mg, vaginal mucosa epithelial cells had changed with cavitation. Conclusion: When the concentrations of RKBL at 2.5mg or below by vaginal injected for a long time, there is no any side effect on vaginal epithelial cells or subcutaneous tissue.

Red kidney bean; Lectin; Microbicides; Mice; Vaginal epithelial cells; Slice

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31160244); 科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新基金項(xiàng)目(13C26215305477); 云南省教廳重大專項(xiàng)(ZD2011008); 生物能源持續(xù)開發(fā)利用教育部工程研究中心及云南省生物質(zhì)能與環(huán)境生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合開放基金項(xiàng)目(20100506)等

2016-06-13

2016-08-20

10.3969/j.issn.1004-8189.2016.11

*通訊作者：wangmk1998@163.com