層流潔凈手術(shù)室環(huán)境對(duì)體外受精-胚胎移植結(jié)局的影響

周 娜 黃 莉 董 梅 吳遠(yuǎn)菲 殷潛生 盧小娟 羅 銘 咼慶慶 李 荔

廣東省婦幼保健院生殖健康與不孕癥科(廣州，511442)

·臨床研究·

層流潔凈手術(shù)室環(huán)境對(duì)體外受精-胚胎移植結(jié)局的影響

周 娜 黃 莉 董 梅 吳遠(yuǎn)菲 殷潛生 盧小娟 羅 銘 咼慶慶 李 荔*

廣東省婦幼保健院生殖健康與不孕癥科(廣州，511442)

目的：對(duì)比本院生殖中心層流潔凈手術(shù)室改進(jìn)前后體外受精-胚胎移植結(jié)局的差異，以期為臨床工作提供理論依據(jù)。方法：層流潔凈手術(shù)室改進(jìn)前3267個(gè)生殖周期為A組，改進(jìn)后的3370個(gè)生殖周期為B組。按本中心常規(guī)輔助生殖方案進(jìn)行體外受精和胚胎移植，分析兩組的年齡、不孕年限、受精率、2PN卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、種植率、臨床妊娠率等指標(biāo)的差異。結(jié)果：A組受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、種植率、臨床妊娠率與B組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，兩組多胎率和流產(chǎn)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。校正年齡與不孕年限的影響后，B組受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、種植率、臨床妊娠率和多胎率仍顯著高于A組(P<0.05)，流產(chǎn)率低于A組(P<0.05)。結(jié)論：層流潔凈手術(shù)室的建立對(duì)于提高臨床妊娠結(jié)局具有重要意義，值得在生殖中心和醫(yī)院中推廣。

層流潔凈手術(shù)室；體外受精；胚胎植入

現(xiàn)代輔助生殖技術(shù)(ART)已廣泛應(yīng)用于不孕癥的治療，盡管數(shù)十年來(lái)ART技術(shù)已有了很大提高，但妊娠率仍有待提高[1]。在ART和胚胎移植(ET)過(guò)程中，除胚胎質(zhì)量、移植技術(shù)、子宮內(nèi)膜等主要因素影響外，客觀(guān)物理?xiàng)l件也對(duì)妊娠結(jié)局有影響。既往有研究發(fā)現(xiàn)外環(huán)境，如季節(jié)對(duì)胚胎種植率和妊娠率有顯著的影響，春季的妊娠成功率顯著高于夏秋季節(jié)[2]，實(shí)驗(yàn)室的微環(huán)境對(duì)胚胎質(zhì)量與著床也有重要影響。2013年5月，本院生殖中心將普通門(mén)診手術(shù)室(雅士AHU-1恒溫恒濕潔凈室內(nèi)機(jī)，ISO 7級(jí))改進(jìn)為層流潔凈手術(shù)室(德國(guó)WOLF衛(wèi)生型潔凈空氣凈化系統(tǒng)，ISO 8級(jí))。本研究對(duì)比分析手術(shù)室改進(jìn)前后，體外受精-胚胎移植胚胎質(zhì)量及其妊娠結(jié)局的差異，以期為臨床工作提供依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象

2011年1月～2015年5月本院生殖中心共6637個(gè)體外受精-胚胎移植周期，按照手術(shù)室改進(jìn)前后的時(shí)間，分為A組和B組。其中A組為2011年1月～2013年5月共3902個(gè)周期，其中635例因故取消胚胎移植，故最終A組有3267個(gè)周期。B組為2013年6月～2015年5月共5357個(gè)周期，其中1987個(gè)周期因故取消胚胎移植，故最終B組有3370個(gè)周期。兩組共計(jì)6637個(gè)周期。取消胚胎移植的原因包括：卵巢過(guò)度刺激綜合征、胚胎質(zhì)量差、卵巢低反應(yīng)、異常受精或不受精、自然妊娠及個(gè)人原因等因素。

1.2 研究方法

1.2.1 手術(shù)室日常潔凈環(huán)境管理 研究期間均使用丹麥K-system公司生產(chǎn)的超凈工作臺(tái)，Thermo Scientific Forma CO2培養(yǎng)箱，使用美國(guó)AIM公司的HTF液、美國(guó)IS公司的10%SSS液、美國(guó)AIM公司的IVCONE液、10%SSS液作為序列培養(yǎng)基，層流潔凈手術(shù)室和胚胎培養(yǎng)室的新風(fēng)機(jī)組每日檢查一次，濾網(wǎng)定期進(jìn)行更換清洗，高效濾網(wǎng)每2年更換一次；中效濾網(wǎng)每周檢查一次，每半年更換一次；粗效濾網(wǎng)每2天清洗一次，每3個(gè)月更換一次。排風(fēng)機(jī)組的中效、高效過(guò)濾器每年更換一次。回風(fēng)口過(guò)濾器每年更換一次。每年由廣東省疾病與預(yù)防控制中心對(duì)手術(shù)室和胚胎培養(yǎng)室進(jìn)行一次全面的環(huán)境衛(wèi)生和消毒效果監(jiān)測(cè)，包括懸浮粒子、沉降菌、溫濕度、壓差、噪音、光照、換氣次數(shù)、甲醛、苯、TVOC等。科室每月定期對(duì)手術(shù)室和胚胎培養(yǎng)室進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)監(jiān)測(cè)，且胚胎培養(yǎng)室凈化系統(tǒng)一直保持為ISO 7級(jí)。生殖中心近年來(lái)無(wú)明顯人員流動(dòng)，可忽略人員技術(shù)熟練度的影響。

1.2.2 ART流程和妊娠結(jié)局評(píng)估 所有患者均行本院生殖中心的常規(guī)治療方案，包括控制性超排卵，卵子采集與孵育，體外受精顯微操作，胚胎培養(yǎng)與植入等。其中控制性超排卵采用促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑黃體期方案或短方案調(diào)節(jié)與促性腺激素/人絨毛促性腺激素方案。通過(guò)陰道B超檢測(cè)卵泡發(fā)育情況，待其成熟后取卵并孵育、受精。受精后第3天觀(guān)察胚胎卵裂數(shù)，并對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)分級(jí)。選擇1～3個(gè)優(yōu)質(zhì)胚胎植入，并給予黃體支持。胚胎移植后2周測(cè)血hCG，7周后行B超檢查，見(jiàn)到孕囊即診斷為臨床妊娠。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，連續(xù)型變量(如年齡、不孕年限等)采用均數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行描述，組間比較采用t檢驗(yàn)；分類(lèi)變量(如受精率、臨床妊娠率等)采用百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用logistic回歸和一般線(xiàn)性模型多因素分析，校正混雜因素后分析改進(jìn)層流潔凈手術(shù)室對(duì)各項(xiàng)妊娠指標(biāo)的影響。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況比較

A組共有3267個(gè)周期接受胚胎移植，患者年齡32.0±4.5歲，不孕年限4.7±3.4年；B組共3370個(gè)周期接受胚胎移植，患者年齡32.0±4.6歲，不孕年限4.6±3.2年。兩組年齡與不孕年限無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=-0.71,P=0.475；t=1.61,P=0.1081，P>0.05)，具有可比性。

2.2 層流潔凈手術(shù)室改進(jìn)前后生育指標(biāo)的比較

比較層流潔凈手術(shù)室改進(jìn)前后的生育指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，改進(jìn)環(huán)境后(A組)的受精率(IVF)為78.5%，顯著高于改進(jìn)前(B組)66.3%；同時(shí)改進(jìn)后卵裂率、2PN卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、種植率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率均顯著優(yōu)于改進(jìn)前；兩組多胎率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

2.3 校正年齡與不孕年限后的各種指標(biāo)比較

既往研究發(fā)現(xiàn)年齡與不孕年限是影響體外授精妊娠成功率的影響因素。因此本次研究采用多變量logistic回歸分析控制年齡與不孕年限的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在控制了年齡與不孕年限的影響后，與改進(jìn)前相比，手術(shù)室改進(jìn)后妊娠率、多胎率和流產(chǎn)率校正后OR分別為1.61、1.15和0.64，對(duì)應(yīng)回歸系數(shù)分別為0.476、0.14和-0.446，存在邊際顯著性，說(shuō)明手術(shù)室環(huán)境的改善對(duì)于妊娠結(jié)局的影響基本獨(dú)立于孕婦的年齡及不孕年限。采用一般線(xiàn)性模型做協(xié)方差校正孕婦年齡與不孕年限的影響后發(fā)現(xiàn)，手術(shù)室環(huán)境改善后受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、種植率均有明顯改善，見(jiàn)表2。

表1 手術(shù)室改進(jìn)前后的體外受精-胚胎種植結(jié)局比較(%)

*一般線(xiàn)性模型校正邊際估計(jì)值△校正年齡、不孕年限OR值

3 討論

本研究對(duì)比分析了升級(jí)為層流潔凈手術(shù)室前后的體外受精-胚胎種植結(jié)局指標(biāo)，以6000多個(gè)生殖周期的大樣本數(shù)據(jù)說(shuō)明改善手術(shù)室空氣質(zhì)量對(duì)于改善胚胎質(zhì)量，提升妊娠結(jié)局具有顯著作用。臨床胚胎實(shí)驗(yàn)室和手術(shù)室是體外受精-胚胎移植技術(shù)中的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對(duì)IVF結(jié)局具有重要影響。良好的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境應(yīng)包括空氣質(zhì)量、溫度、培養(yǎng)液成分和pH值及光線(xiàn)等多項(xiàng)指標(biāo)，以期為胚胎提供接近生理?xiàng)l件的發(fā)育環(huán)境。而手術(shù)室環(huán)境，特別是其空氣質(zhì)量對(duì)于提高體外受精、胚胎種植成功率有著尤為重要的作用[3]。早在1993年，Johnson等[4]就已報(bào)告了實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的不穩(wěn)定性與鼠類(lèi)胚胎發(fā)育的關(guān)系。其后各種科技條件的成熟與進(jìn)步，包括使用高效分子空氣過(guò)濾、化學(xué)氣體過(guò)濾等方法，都促進(jìn)了胚胎種植實(shí)驗(yàn)室與手術(shù)室條件的穩(wěn)定改善。Voorhis等[5]于2010年報(bào)道了美國(guó)70%的高效輔助生殖中心均使用層流潔凈手術(shù)室，這一結(jié)果極大促進(jìn)了該技術(shù)在全球范圍的發(fā)展與推廣應(yīng)用。本生殖中心2013年6月以前采用的是雅士AHU-1恒溫恒濕潔凈室內(nèi)機(jī)，僅能過(guò)濾塵埃和細(xì)菌，無(wú)法凈化室內(nèi)有害物質(zhì)。改進(jìn)后的凈化系統(tǒng)為德國(guó)WOLF衛(wèi)生型潔凈空氣凈化系統(tǒng)，其QUATTRO管道式UVC殺菌空氣凈化裝置可瞬間殺滅流動(dòng)空氣中霉菌、芽孢、病毒和細(xì)菌，可達(dá)99.9%以上的殺滅率；同時(shí)，新潔凈系統(tǒng)的等離子動(dòng)態(tài)殺菌除化學(xué)污染裝置-靜電吸附凈化器，能有效去除揮發(fā)性有機(jī)成份及化學(xué)污染物、消除塵粒。因?yàn)樾〉碾x子與離子團(tuán)有更多機(jī)會(huì)與空氣中的雜質(zhì)和氣體發(fā)生碰撞反應(yīng)，使較小的微粒凝結(jié)成較大的氣溶膠微粒被高中效過(guò)濾器攔截，或在重力的作用下自由落體并沉淀，由此達(dá)到去除有機(jī)揮發(fā)物、消除塵粒、凈化空氣的目的。本研究首先對(duì)比分析了改為層流潔凈手術(shù)室前后6000多個(gè)生殖周期的胚胎培養(yǎng)及妊娠結(jié)局，發(fā)現(xiàn)受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、種植率、妊娠率等各項(xiàng)指標(biāo)均有了顯著性的改善，說(shuō)明了層流潔凈手術(shù)室對(duì)輔助生殖技術(shù)的顯著影響。與本研究的結(jié)果一致，Esteves，F(xiàn)orman，Munch，Karagouga等[6-9]另外至少4項(xiàng)研究也在不同種族和地區(qū)得到了類(lèi)似的結(jié)果。

既往研究發(fā)現(xiàn)年齡與不孕年限會(huì)影響人工授精胚胎發(fā)育與妊娠結(jié)局，因此本研究通過(guò)多因素分析的方法控制了年齡與不孕年限的混雜因素影響。結(jié)果顯示受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率在校正了混雜因素的影響后，潔凈手術(shù)室環(huán)境對(duì)于指標(biāo)的改善仍然存在顯著性?xún)?yōu)勢(shì)。但是，另一方面，種植率的優(yōu)勢(shì)在校正混雜因素影響后不再顯著了，分析原因可能是年齡與不孕年限對(duì)子宮內(nèi)環(huán)境影響較大造成[10]。通過(guò)層流的方法對(duì)手術(shù)室內(nèi)的空氣進(jìn)行改造，對(duì)進(jìn)入孵箱的氣體進(jìn)行過(guò)濾可高效改善妊娠率和種植率。除手術(shù)室內(nèi)空氣質(zhì)量的改善對(duì)于提高輔助生殖技術(shù)成功率有顯著改善外，既往研究發(fā)現(xiàn)維持手術(shù)室內(nèi)穩(wěn)定的環(huán)境溫度也有重要的作用。既往有研究報(bào)道季節(jié)變化所致的溫度改變雖然沒(méi)有顯著影響妊娠率的改變，但對(duì)于胚胎質(zhì)量卻有顯著影響[11]。卵細(xì)胞在24℃的環(huán)境下會(huì)在較短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)紡錘絲變性，如果暴露時(shí)間超過(guò)4h，超過(guò)半數(shù)的染色體結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生不可逆性分解，最終對(duì)胚胎存活產(chǎn)生影響。在臨床實(shí)踐中，技術(shù)人員在打開(kāi)孵育箱進(jìn)行觀(guān)察和操作的過(guò)程中可能會(huì)引起胚胎環(huán)境的顯著變化。因此，臨床胚胎實(shí)驗(yàn)室不僅要保證良好的空氣質(zhì)量，還要保證溫度穩(wěn)定性。

綜上，本研究數(shù)據(jù)說(shuō)明改善輔助生殖手術(shù)室環(huán)境對(duì)于提高體外受精-胚胎種植妊娠率的改善作用。層流潔凈手術(shù)室的建立對(duì)于提高臨床療效具有重要意義，值得在生殖、診療機(jī)構(gòu)中推廣應(yīng)用。

[1] Ajduk A, Zernicka-Goetz M. Quality control of embryo development[J]. Mol Aspects Med, 2013, 34(5): 903-918.

[2] Worrilow KC, Huynh HT, Bower JB, et al. A retrospective analysis: seasonal decline in implantation rates (IR) and its correlation with increased levels of volatile organic compounds (VOC) [J]. Fertil Steril, 2002, 78(Suppl 1): 39.

[3] Khoudja RY, Xu Y, Li T, et al. Better IVF outcomes following improvements in laboratory air quality [J]. J Assist Reprod Genet, 2013, 30(1): 69-76.

[4] Johnson JE, Boone WR, Bernard RS. The effects of volatile compounds (VC) on the outcome of in vitro mouse embryo culture [J]. Fertil Steril, 1993, 1993(Suppl 1): 98-99.

[5] Van Voorhis BJ, Thomas M, Surrey ES, et al. What do consistently high-performing in vitro fertilization programs in the U.S. do? [J]. Fertil Steril, 2010, 94(4): 1346-1349.

[6] Esteves SC, Bento FC. Implementation of air quality control in reproductive laboratories in full compliance with the Brazilian Cells and Germinative Tissue Directive [J]. Reprod Biomed Online, 2013, 26(1): 9-21.

[7] Forman M, Sparks AET, Degelos S, et al. Statistically significant improvements in clinical outcomes using engineered molecular media and genomically modeled ultraviolet light for comprehensive control of ambient air (AA) quality [J]. Fertil Steril, 2014, 102(3): 91.

[8] Munch EM, Sparks AE, Duran HE, et al. Lack of carbon air filtration impacts early embryo development [J]. J Assist Reprod Genet, 2015, 32(7): 1009-1017.

[9] Karagouga G, Fredrickson JR, Morbeck DE. Interaction of air quality and culture environment: role of protein concentration and oil quality on effects of volatile organic compounds (VOCS) on embryo development [J]. Fertil Steril, 2014, 3(102): 212.

[10] Wu Y, Kang X, Zheng H, et al. Effect of Paternal Age on Reproductive Outcomes of In Vitro Fertilization [J]. Plos One, 2015, 10(9): 135734.

[11] 田英. 季節(jié)變化和氣象因素對(duì)體外受精-胚胎移植結(jié)局的影響[D]. 鄭州：鄭州大學(xué), 2009：42-44.

[責(zé)任編輯：董 琳]

Influence of environment of laminar flow surgery room on IVF-ET outcome

ZHOU Na, HUANG Li, DONG Mei, WU Yuanfei, YIN Qiansheng, LU Xiaojuan, LUO Ming, GUO Qingqing, LI Li*

DepartmentofReproductiveHealthandInfertility,GuangdongWomenandChildrenCareHospital,Guangdong, 511442

Objective: To compare the outcome of IVF-ET before and after improving the environment of laminar flow surgery room. Method: The data of 6637 fresh IVF/ICSI-ET cycles from 2011 to 2015 were retrospectively analyzed. The cycles were divided into group A (before improving environment, n=3267) and group B (after improving environment, n=3370). The pregnancy outcomes including age, infertility duration, fertilization rate, cleavage rate, good quality embryo rate, implantation rate, and clinical pregnancy rate were compared between the two groups. Result: The fertilization rate, cleavage rate, good quality embryo rate, implantation rate, and pregnancy rate in group B was significantly higher than those in group A (P<0.05), but the multiple pregnancy rate and abortion rate were not significantly different (P>0.05). After adjusting the effect of age and infertility duration, the rates of fertilization, cleavage, good quality embryo, implantation, clinical pregnancy and multiple pregnancy in group B were significantly higher than those in group A, while abortion rate in group B was significantly lower than that in group A (P<0.05). Conclusion: Improvement of the environment of laminar flow surgery room can significantly improve the outcomes of IVF-ET, which is worth of promotion in other assisted reproductive technology center.

Lamina flow; In vitro fertilization and embryo transfer (IVF-ET)

廣州市科技創(chuàng)新委員會(huì)項(xiàng)目(201510010290)

2015-12-07

2016-08-23

10.3969/j.issn.1004-8189. 2016.10

*通訊作者：lili-1406@163.com

*Correspondingauthor:LILi,Email:lili-1406@163.com