復(fù)方醋酸地塞米松乳膏抑菌劑含量測(cè)定及其抑菌效力評(píng)價(jià)

林琳

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，老年病教研室，黑龍江 哈爾濱 150000)

復(fù)方醋酸地塞米松乳膏抑菌劑含量測(cè)定及其抑菌效力評(píng)價(jià)

林琳Δ

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，老年病教研室，黑龍江 哈爾濱 150000)

目的 建立高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方醋酸地塞米松乳膏中抑菌劑的含量, 并評(píng)價(jià)抑菌劑使用的合理性。方法 采用HPLC方法，以外標(biāo)法測(cè)定羥苯乙酯含量。參照《中國藥典》2015年版抑菌劑效力檢查法；采用大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉共5 種試驗(yàn)菌株進(jìn)行抑菌劑效力測(cè)定。結(jié)果 羥苯乙酯在6.63～132.6 μg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系Y=4 216.2X+0.320 8，r=0.999 7，平均回收率為99.2%。不同批次的供試品的抑菌效力因抑菌劑含量不同而效果不一。結(jié)論 本方法結(jié)果準(zhǔn)確,重復(fù)性好,可用于復(fù)方醋酸地塞米松乳膏中羥苯乙酯含量的測(cè)定。目前抑菌劑的使用存在隨意性,需加強(qiáng)研究和監(jiān)管。

復(fù)方醋酸地塞米松乳膏；羥苯乙酯；含量測(cè)定；抑菌效力

復(fù)方醋酸地塞米松乳膏為皮膚外用藥，具有抗炎、抗過敏的作用，因其適用于各種皮炎、濕疹等常見病[1-3]，且療效迅速確切，深受患者歡迎，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《中國藥典》2015年版二部[4]。不同于口服制劑，軟膏劑多為多劑量包裝，在使用過程中，不可避免的接觸外來物，為了防止污染，多數(shù)制劑中都添加適宜的抑菌劑。通過調(diào)查發(fā)現(xiàn)市售多個(gè)廠家不同批次的復(fù)方醋酸地塞米松乳膏中都使用羥苯乙酯(尼泊金乙酯)作為抑菌劑，但處方中均未給出具體含量。本文采用HPLC法測(cè)定復(fù)方醋酸地塞米松乳膏中羥苯乙酯的含量，然后對(duì)不同含量抑菌劑的樣品進(jìn)行抑菌劑效力測(cè)定，對(duì)樣品中抑菌劑添加量使用的合理性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑：羥苯乙酯對(duì)照品(100847-201203，純度100%，購自中國食品藥品檢定研究院)。甲醇為色譜純；其余試劑均為分析純。菌種:細(xì)菌包括金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B) 26003]、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[CMCC(B) 10104]、大腸埃希菌(Escherichiacoli)[CMCC(B) 44102]，真菌包括白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F) 98001]、黑曲霉(Aspergillusniger)[CMCC(F) 98003]，均購自中國食品藥品檢定研究院，菌種傳代3次后使用。

培養(yǎng)基：沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基(SDB)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA)、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB)、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(TSA)、pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液均購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。各培養(yǎng)基經(jīng)適用性試驗(yàn)，結(jié)果全部符合《中國藥典》2015年版相關(guān)要求。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器：1260型全自動(dòng)高效液相色譜儀配DAD檢測(cè)器(安捷倫)；AB304S型電子天平(上海梅特勒一托利多儀器有限公司)；BT-25S型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)；TU1801紫外分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；BSC-1300ⅡA2生物潔凈安全柜(上海蘇凈實(shí)業(yè)有限公司)；SPX-150B-Z型恒溫培養(yǎng)箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)； BS210S電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]YXQ-LS-100A型立式壓力蒸氣滅菌器(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 抑菌劑含量測(cè)定方法

① 色譜條件：色譜柱：Hypersil ODS C18柱(250 mm×4.6 mm，0.5μm)；流動(dòng)相：甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(35:65)；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長為256 nm。

② 溶液的制備：精密稱取羥苯乙酯對(duì)照品13.26 mg,置100 mL 量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。取供試品內(nèi)容物約2.0 g，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加甲醇適量，70 ℃水浴加熱，時(shí)時(shí)振搖，至樣品完全溶解，加甲醇稀釋至刻度，放冷，置冰浴中冷卻2 h以上，取出后用0.22 μm微孔濾膜迅速濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

③ 線性關(guān)系考察：精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5、1.0、2.0、4.0、10.0 mL，用甲醇定容至10 mL，分別進(jìn)樣，計(jì)算峰面積，以羥苯乙酯濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)X，峰面積為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

④ 精密度考察：在①色譜條件下，精密吸?、趯?duì)照品溶液20 μL注入液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6次。

⑤ 穩(wěn)定性考察：?、陧?xiàng)下供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、12 h時(shí)進(jìn)樣。

⑥ 重復(fù)性考察：?、陧?xiàng)下供試品溶液5份，分別精密吸取20 μL，按照色譜條件測(cè)定，結(jié)果羥苯乙酯峰面積的RSD為1.4%。

⑦ 回收率試驗(yàn)：精密稱取復(fù)方醋酸地塞米松乳膏(批號(hào))約2 g，共取9份，置50 mL量瓶中，按不同濃度分別精密加入對(duì)照品溶液1.0，2.0和3.0 mL，平行加入3份，加甲醇適量，70 ℃水浴加熱，時(shí)時(shí)振搖，至樣品完全溶解，加甲醇稀釋至刻度，放冷，置冰浴中冷卻2 h以上，取出后用0.22 μm微孔濾膜迅速濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2 抑菌效力測(cè)試方法

① 細(xì)菌培養(yǎng)物的制備：將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌接種在TSA培養(yǎng)基斜面上，將其置于的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱溫度設(shè)置到35 ℃，24 h后,用適量無菌0.9%氯化鈉溶液洗脫各培養(yǎng)基表面的培養(yǎng)物，采用比濁法制成每mL含菌數(shù)約為108cfu的菌懸液。

② 真菌培養(yǎng)物的制備：白色念珠菌接種到SDA斜面上，將其置于的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱溫度設(shè)置到25 ℃，48 h后,用適量無菌0.9%氯化鈉溶液洗脫培養(yǎng)基表面的培養(yǎng)物，制備成濃度為108cfu/mL的菌懸液。

黑曲霉采用SDA，同樣置溫度設(shè)為25 ℃培養(yǎng)箱中，不同白色念珠菌的是培養(yǎng)時(shí)間為7 d。孢子懸液的制備方法如下：取新鮮培養(yǎng)物，使用0.05%(mL/mL) 聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液作為洗脫液，并用無菌試管收集孢子懸液，用適量上述洗脫液稀釋并制成每1 mL含孢子數(shù)108cfu的孢子懸液。

1.2.3 微生物計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)：因?yàn)閺?fù)方醋酸地塞米松乳膏對(duì)真菌，特別是白色念珠菌有抑制作用。因此，細(xì)菌計(jì)數(shù)試驗(yàn)時(shí)可采用常規(guī)法，真菌的抑制作用可以用薄膜過濾法來消除。

① 供試液的制備：取樣品約10 g，置錐形瓶中，加無菌十四烷酸異丙酯30 mL，充分振搖使溶解，加入預(yù)先在40 ℃保溫的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(pH 7.0)至100 mL，振搖5-10 min，萃取，靜置，油水分層后，取水層作為1:10的供試液。

② 細(xì)菌計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)：取供試液1 mL和試驗(yàn)菌(<100 cfu)的，分別注入同一平皿中，立即傾注TSA，按常規(guī)法測(cè)定其菌落數(shù)。

③ 真菌計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)：取“1.2.2項(xiàng)下②”項(xiàng)下菌懸液(<100 cfu)，加1mL供試液作為試驗(yàn)菌液, 用無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(pH 7.0)至100 mL，通過薄膜過濾器后，用沖洗液沖洗2次，每次200 mL，轉(zhuǎn)膜貼至平板上,測(cè)定菌數(shù)。

1.2.4 抑菌效力試驗(yàn)

① 供試液制備：供試品的制備方法同“1.2.3”項(xiàng)下“①”。4個(gè)廠家共5批樣品，平行制備5份。

② 供試品接種：取上述供試液，置于無菌試管中，直接接種100 μL 的“2.2. 1”項(xiàng)下的制備好的菌懸液，最終含菌量為105～106cfu/mL，密封搖勻，置于培養(yǎng)箱(25 ℃)中培養(yǎng)待用。

③ 存活菌數(shù)測(cè)定：根據(jù)《中國藥典》抑菌效力判定標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的間隔時(shí)間，于供試品接種的2、7、14、28 d，分別取“1.2.4”項(xiàng)“①”中接種的各供試品1 mL，稀釋成適當(dāng)?shù)南♂尲?jí)，分別采用上文驗(yàn)證后的微生物計(jì)數(shù)方法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 線性關(guān)系考察 得回歸方程Y=4216.2X+0.3208，相關(guān)系數(shù)r=0.9997，結(jié)果顯示對(duì)照品溶液在6.63～132.6 μg/mL線性范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性。

2.2 精密度考察 測(cè)得羥苯乙酯峰面積的RSD為0.46%，表明儀器精密度良好。

2.3 穩(wěn)定性考察 測(cè)得羥苯乙酯峰面積的RSD為1.1%，表明在12 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.4 重復(fù)性考察 算得羥苯乙酯峰面積的RSD為1.4%，表明方法重現(xiàn)性良好。

2.5 回收率試驗(yàn) 平均回收率為99.2%，RSD為1.6%，結(jié)果表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.6 樣品含量測(cè)定 文中對(duì)市售的6個(gè)批號(hào)的樣品按照上述色譜條件進(jìn)行羥苯乙酯含量的測(cè)定，含量在0.04%～0.11%，不同廠家的羥苯乙酯含量相差較大，同一廠家不同批號(hào)的樣品含量也不同。見表1。

表1 羥苯乙酯的含量測(cè)定結(jié)果(%)

2.7 微生物計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)結(jié)果 驗(yàn)證結(jié)果表明，細(xì)菌計(jì)數(shù)試驗(yàn)時(shí)采用常規(guī)法，真菌的計(jì)數(shù)試驗(yàn)采用薄膜過濾法，回收率高于70%，符合規(guī)定。見表2。

表2 計(jì)數(shù)方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.8 抑菌效力試驗(yàn)結(jié)果 通過查閱皮膚給藥制劑抑菌效力判斷標(biāo)準(zhǔn)，其中要求細(xì)菌的2 d減少的lg值不小于2,7 d減少的lg值不小于3,28 d試驗(yàn)菌增加數(shù)量不超過0.5 lg；真菌的14 d減少的lg值不小于2，28 d試驗(yàn)菌增加數(shù)量不超過0.5 lg。由表4 結(jié)果可知，5個(gè)批次的樣品抑制真菌的能力都符合標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定，14 d后基本上無菌落生長，28 d后也無復(fù)生長的現(xiàn)象。但樣品中不同濃度的羥苯乙酯對(duì)細(xì)菌的抑制能力從表3中來看，2號(hào)作為低濃度抑菌劑的代表，其抑菌效力無法滿足實(shí)際需要，達(dá)不到A類產(chǎn)品的規(guī)定要求， 而5號(hào)樣品濃度略高，基本能符合抑菌力檢查的規(guī)定。另外3個(gè)批次的樣品抑菌效力大大超過了規(guī)定的lg值，提示有過量添加的可能性。5批次樣品的測(cè)定結(jié)果見表3、4。

表3 樣品抑菌效力測(cè)定結(jié)果(細(xì)菌)

表4 樣品抑菌效力測(cè)定結(jié)果(真菌)

3 討論

參考相關(guān)文獻(xiàn)[5-8]文中先后比較了甲醇-水、乙腈-水和甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液作為流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)乙腈-水作為流動(dòng)相時(shí)峰形較寬，調(diào)整使用了不同比例的甲醇-水作為流動(dòng)相，結(jié)果分離度偏小，故采取加入磷酸鹽的方法。試驗(yàn)證明甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(35:65)作為流動(dòng)相對(duì)主成分和羥苯乙酯有良好的分離效果。

文中試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)同一廠家不同批次的抑菌劑添加量差別較大，有的相差一倍以上，存在隨意性。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)不同廠家抑菌劑添加量不同，存在過度使用的問題。分析其原因可能生產(chǎn)廠家對(duì)合理使用抑菌劑主觀重視程度不夠，認(rèn)為只要能達(dá)到效果，量多量少差別不大。但本文試驗(yàn)表明，抑菌劑的添加量不足，則會(huì)達(dá)不到對(duì)細(xì)菌的抑菌效果，如添加量過大雖然可以保證抑菌效力，但其潛在的毒性也需引起重視[9-12]。故藥企需要按照新版藥典(通則1121)的要求，采用含不同種類不同濃度抑菌劑的樣品多次試驗(yàn)，甚至可以采用復(fù)方組成，找到最佳配比[13-15]，保證用藥安全。

抑菌劑作為軟膏處方中必要的組成部分應(yīng)該引起藥企和監(jiān)管部門的重視，《中國藥典》2015 年版已經(jīng)將抑菌效力由原來的指導(dǎo)原則[16]升級(jí)為抑菌效力檢查法(通則1121)的要求。但國內(nèi)大多數(shù)的軟膏劑的說明書僅標(biāo)注抑菌劑名稱，對(duì)其含量諱莫如深。除了部分滴眼液外，藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)抑菌劑的檢驗(yàn)也存在缺失現(xiàn)象。建議在日常監(jiān)管和國家評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)中，積極探索軟膏劑抑菌劑的檢驗(yàn)方法，深入研究，了解抑菌劑的使用現(xiàn)狀，為制訂更為科學(xué)嚴(yán)格的藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)夯實(shí)基礎(chǔ)。

[1] 謝桂群.復(fù)方醋酸地塞米松乳膏治療PICC 相關(guān)濕疹的療效觀察[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2013，29(4)：611-612.

[2] 高瑩，甄甄，張勤，等. 0.025%醋酸地塞米松乳膏聯(lián)合膚樂霜治療嬰幼兒濕疹、特應(yīng)性皮炎的隨機(jī)對(duì)照研究[J].北京醫(yī)學(xué)，2015，37(2)：145-147.

[3] 邱艷紅. 糖皮質(zhì)激素類藥物的臨床使用情況分析[J].海峽藥學(xué)，2015，27(4)：220-221.

[4] 國家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國藥典(四部)[S].2015年版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社：23-24.

[5] 林琪珊，洪淑華，余良鐘. 復(fù)方醋酸地塞米松乳膏有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定及其雜質(zhì)的確定[J].中國藥房，2013，24(9)：843-845.

[6] 簡(jiǎn)炎林,鄒國芳. 醫(yī)院制劑中防腐劑羥苯乙酯的含量測(cè)定[J].中國藥房，2009，20(13)：1016-1017.

[7] 焦旭雯，張雷，陳華. HPLC 法測(cè)定麥芽糖鐵糖漿中防腐劑的含量[J].中國生化藥物雜志，2015，35(11)：169-171.

[8] 孫蒙，閆小玉，畢開順，等. HPLC 測(cè)定 11 種中藥口服液中 6 種防腐劑的含量[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18(3)：76-79.

[9] 李中東，張?jiān)栖?，郭燕萍，?羥苯酯類防腐劑的不良反應(yīng)[J].中國藥物警戒，2012，9(5)：303-305.

[10] 林忠洋，馬萬里，齊跡，等.對(duì)羥基苯甲酸酯類防腐劑的人體暴露[J].化學(xué)進(jìn)展，2015，27(5)：614-622.

[11] 成海平. 藥品研發(fā)中防腐劑的應(yīng)用及質(zhì)控[J].中國新藥雜志，2005， 14(8) : 954 -956.

[12] 吳朝陽.淺談注射劑中抑菌劑引起的不良反應(yīng)[J].中國醫(yī)學(xué)工程，2012，20(3) : 180-181.

[13] 傅蓉， 王超， 趙曉冬，等. 左氧氟沙星滴眼液抑菌劑劑量篩選與抑菌效力研究[J].藥物分析雜志，2013，33(12)：2056-2060.

[14] 劉艷，牟衛(wèi)偉，王麗英，等. 硝酸毛果蕓香堿滴眼液抑菌劑濃度篩選與抑菌效力研究[J].中國藥事，2014，28(12)：1313-1317.

[15] 丁勃，徐曉潔，謝元超.氫溴酸加蘭他敏口服液添加抑菌劑篩選與抑菌效力研究[J].藥物分析雜志，2011，31(12)：2312-2317.

[16] 國家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國藥典(二部)[S].2010年版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：附錄215-216.

(編校：王冬梅)

Determination of the antibacterial agent content of compound dexamethasone acetate cream and its antibacterial effect evaluation

LIN LinΔ

(Department of Geriatrics, The Second Affiliated Hospital Harbin Medical University, Harbin 150000, China)

ObjectiveTo establish a HPLC method to determine the antiseptics in compound dexamethasone acetate cream and evaluate the usage rationality of antimicrobial preservatives. MethodsThe content of ethyl hydroxybenzoate was calculated by external standard with HPLC.The effectiveness of antimicrobial preservatives was measured according to the preservative effectiveness test in ChP(2015edition) by inoculating 5 kinds of test microorganisms includingPseudomonasaeruginosa,Escherichiacoli,Staphylococcusaureus,CandidaalbicansandAspergillusniger. ResultsThe linear ranges of ethyl hydroxybenzoate was 6.63-132.6 μg/mL(r=0.999 7).The average recoveries was 99.2%.The samples from different batche had different antimicrobial effectiveness due to the content of ethyl hydroxybenzoate. ConclusionThe described method can be used in the determination of the preservatives of ethyl hydroxybenzoate in compound dexamethasone acetate cream. At present the use of antibacterial agent is arbitrary, it is necessary to strengthen research and supervision.

compound dexamethasone acetate cream;ethyl hydroxybenzoate;content determination;antimicrobial effectiveness

林琳，通信作者，女，碩士，住院醫(yī)師，研究方向：心血管病用藥，E-mail: 2198176768@qq.com。

R927.1

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.04.59