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    兩種不同試劑盒檢測手段對肝移植患者他克莫司血液濃度的影響

    2016-07-24 17:36:52周臺玲張浩張朝鋒
    中國生化藥物雜志 2016年12期
    關鍵詞:克莫司血藥濃度肝移植

    周臺玲,張浩,張朝鋒

    (舟山醫(yī)院 檢驗中心,浙江 舟山 316000)

    兩種不同試劑盒檢測手段對肝移植患者他克莫司血液濃度的影響

    周臺玲Δ,張浩,張朝鋒

    (舟山醫(yī)院 檢驗中心,浙江 舟山 316000)

    目的 探討兩種不同試劑盒檢測手段對肝移植他克莫司血液濃度的影響。方法 選取2013年2月~2016年8月在舟山醫(yī)院肝病科接受他克莫司檢測的肝移植患者81例,用藥后12采集患者空腹上肢靜脈血,分別采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測試劑盒和酶增強免疫法(EMIT)檢測試劑盒對全血樣本他克莫司血液濃度進行檢測,觀察、比較2種檢測手段的測定結果及相關性。結果 ELISA法具有較好的日內及日間精密度和準確度,RSD均<5%,其中在低濃度區(qū)間時檢測的精密度稍差;EMIT法具有較好的日內及日間精密度和準確度,RSD均<5%,其中在低濃度區(qū)間檢測的精密度稍差;采用ELISA檢測試劑盒測得的他克莫司血藥濃度(5.19±0.73)μg/L明顯低于采用EMIT試劑盒測得的結果(8.29±1.14)μg/L,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);2種試劑盒檢測結果的相關系數r=0.9176,檢測結果呈正相關關系;他克莫司血藥濃度<2.0 μg/L時,ELISA試劑盒的測定結果(1.116±0.125)μg/L明顯低于EMIT試劑盒的測定結果(1.507±0.201)μg/L,具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論 ELISA檢測試劑盒和EMIT檢測試劑盒均可用于肝移植患者他克莫司血液濃度的監(jiān)測,且相關性較好,但二者測定的他克莫司血液濃度差異顯著,需各自建立治療窗范圍進行判斷,檢測結果不可相互替換。

    他克莫司血藥濃度;肝移植;酶聯(lián)免疫吸附法;酶增強免疫法

    肝移植后的1年生存率高達85%,是治療終末期肝病的主要外科手段[1]。雖然肝臟受到免疫系統(tǒng)攻擊的概率相對較小,但術后仍需長期服用免疫抑制劑來防止免疫排斥并發(fā)癥。他克莫司(又名FK506)是從鏈霉菌屬大環(huán)內酯類抗生素,能夠通過抑制白細胞介素-2(Interleukin-2,IL-2)的釋放來抑制T淋巴細胞的功能,發(fā)揮強力的免疫制作用[2],是防治肝移植后排斥反應的一線藥物[3]。但是由于治療窗狹窄、穩(wěn)態(tài)谷濃度(C0)水平與毒性反應、排斥反應具有相關性、藥物動力學具有較大的個體差異[4]等原因,導致FK506使用中劑量較低容易出現(xiàn)排斥反應,劑量稍高容易產生毒性,因此,對FK506的血藥濃度進行監(jiān)測使其處于安全有效的治療范圍尤為重要[5]。目前,臨床上FK506的血藥濃度監(jiān)測方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、酶增強免疫法(enzyme-multipliedimmuno assay technique,EMIT)、微粒子酶免疫法(microparticle enzyme immunoassay assay,MEIA)、化學發(fā)光微粒子免疫分析法(chemiluminescence microparticle immunoassay assay,CMIA)等免疫學手段以及高效液相色譜-質譜聯(lián)用法(high performance liquid chromatography-mass spectrometry,HPLC-MS)[6]等,各種監(jiān)測手段有其自身的優(yōu)勢和特點,臨床使用時應注意選擇。本次主要探討ELISA法和EMIT法兩種不同試劑盒檢測手段對肝移植FK506血液濃度的影響,現(xiàn)報告如下。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料 選取自2013年2月~2016年8月來舟山醫(yī)院進行FK506檢測的肝移植患者81例作為研究對象,其中男性44例,女性37例,年齡20~69歲,平均年齡(44.32±6.12)歲,體質量為51~77 kg,平均體質量(66.36±9.43)kg,服藥時間為3~120月。本試驗經患者知情同意,并獲得醫(yī)院倫理委員會批準。

    納入標準[7]:①器官移植、接受FK506治療時間>3個月;②服藥劑量為0.1~0.2 mg/(kg·d),分為2次/d,每隔12h口服一次;③肝腎功能無異常。

    排除標準:①年齡<18歲的患者;②肝臟移植時間<3個月的患者;③服用其他免疫抑制劑或其FK506血藥濃度有影響藥物的患者;④未規(guī)律服用藥物的患者。

    1.2 方法

    1.2.1 儀器與試劑:SYVA Viva-E臨床化學分析儀,西門子醫(yī)療診斷公司產品;Synergy H1全功能酶標儀,美國伯騰儀器有限公司(BioTek)產品;MM-1(MM-2)-微量振蕩器,江蘇省金壇市友聯(lián)儀器研究所產品;5417C小型臺式高速離心機,德國艾本德股份公司產品;Emit? 2000FK506檢測試劑盒,西門子醫(yī)療診斷公司產品;人FK506ELISA檢測試劑盒,上海喬羽生物科技有限公司產品;FK506(標準品)(愛爾蘭Astellas Pharma Co. Limited,國藥準字H20090691)。

    1.2.2 血液樣本采集:所有患者于用藥后12 h的次日清晨,采集空腹上肢靜脈血5 mL,將血液平均分為2份置于含有乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-2K)的抗凝管中備用。

    1.2.3 定標和質控:酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)根據0、0.3、1.0、3.0、10、30.0 μg/L 6個濃度的FK506標準液繪制標準曲線,隨行低(2.0 μg/L)、中(5.0 μg/L)、高(15.0 μg/L)三個濃度的FK506質控樣品進行控制;酶增強免疫法(EMIT)根據0、2.5、5.0、10.0、20.0 30.0 μg/L 6個濃度的FK506標準液繪制標準曲線,隨行低(5.0 μg/L)、中(9.8 μg/L)、高(19.0 μg/L)3個濃度的FK506質控樣品進行控制。

    1.2.4 樣本藥物濃度測定:①ELISA法:按照ELISA試劑盒說明書的步驟處理樣本并進行檢測,吸取各濃度FK506標準液+各濃度FK506質控樣品+25 μL血液樣本,置于離心管中,滴加150 μL消化液混勻,分別在室溫及75 ℃水浴箱內進行孵育15 min后離心,取上清液置于酶標微孔板內;分別滴加50 μLFK506單克隆抗體,孵育30 min,加入50 μL酶標試劑,孵育60 min,洗板,加入50 μL顯色劑,避光顯色10 min,加入終止液終止反應,立即采用酶標儀在450/630 nm雙波長下測定各孔吸光度,繪制標準曲線,計算樣本濃度值。②EMIT法:將200 μL甲醇+50 μL預處理液+各濃度FK506標準液+各濃度的FK506質控樣品+200 μL樣本,依次置于離心管中,混勻,靜置沉淀,離心,取上清液采用臨床化學分析儀檢測樣本濃度。

    1.2.5 精密度(CV)及回收率測定:同日內,采用ELISA法測定低(2.0 μg/L)、中(5.0 μg/L)、高(15.0 μg/L)3個濃度的質控樣品各5份,采用EMIT法測定低(5.0 μg/L)、中(9.8 μg/L)、高(19.0 μg/L)3個濃度的質控樣品各5份,計算日內CV平均值、相對標準偏差(RSD)以及回收率;連續(xù)5 d,不同日間,分別采用ELISA法和EMIT法測定相應質控樣品,計算日間CV平均值、RSD以及回收率。

    1.2.6 2種方法測定FK506血藥濃度相關性比較:分別計算2種方法測定的血液FK506血藥濃度,對其進行比較,并觀察2種結果的相關性。

    1.2.7 不同F(xiàn)K506血藥濃度范圍內2種方法測量數據比較:將測定的FK506血藥濃度分為<0.2、2.0~8.0、8.0~14.0、14.0~20.0、>20.0 μg/L 5個水平,觀察比較在各個血藥濃度水平上2種檢測方法的檢測結果。

    2 結果

    2.1 ELISA法檢測FK506的CV及回收率試驗 結果顯示,ELISA法具有較好的日內及日間精密度和準確度,RSD均<5%,其中在低濃度區(qū)間時檢測的精密度稍差,見表1。

    表1 ELISA法檢測FK506的CV及回收率試驗結果Tab.1 CV and recovery of tacrolimus tested by ELISA

    2.2 EMIT法檢測FK506的CV及回收率試驗 結果顯示,EMIT法具有較好的日內及日間精密度和準確度,RSD均<5%,其中在低濃度區(qū)間時檢測的精密度稍差,見表2。

    表2 EMIT法檢測FK506的CV及回收率試驗結果Tab.2 CV and recovery of tacrolimus tested by EMIT (±s)

    2.3 2種方法檢測FK506血藥濃度差異性分析 通過ELISA法測得的FK506血藥濃度為(5.19±0.73)μg/L,通過EMIT法測得的FK506血藥濃度為(8.29±1.14)μg/L,EMIT法測定值明顯高于ELISA法,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

    表3 2種方法檢測FK506血藥濃度差異性分析結果Tab.3 Results of two methods used to analyze FK506 plasma concentration (±s)

    *P<0.05,與ELISA法比較comparedwithELISA。

    2.4 2種方法檢測FK506血藥濃度相關性分析結果 對每一個血液樣本,以ELISA法測定值為X軸,以EMIT法測定值為Y軸,據此繪制散點圖,見圖1,得到的線性回歸方程為:Y=1.1578X+2.3691,相關系數r=0.9176,表明2種檢測方法的檢測結果呈正相關關系。

    圖1 ELISA與EMIT法相關性(n=81)Fig.1 Correlation between ELISA and EMIT (n=81)

    2.5 不同F(xiàn)K506血藥濃度范圍內2種方法測量數據比較FK506血藥濃度<2.0μg/L時,ELISA法的測定結果明顯低于EMIT法的測定結果,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);FK506血藥濃度為2.0~14.0μg/L時,ELISA法的測定結果稍低于EMIT法的測定結果,差異無統(tǒng)計學差異;FK506血藥濃度為>20μg/L時,ELISA法的測定結果稍高于EMIT法的測定結果,差異無統(tǒng)計學差異,見表4。

    表4 不同F(xiàn)K506血藥濃度范圍內2種方法測量數據比較Tab.4 Comparison of measurement data of two methods in FK506 plasma concentration range (±s)

    *P<0.05,與ELISA法比較comparedwithELISA

    3 討論

    近年來,隨著器官移植技術的發(fā)展,F(xiàn)K506在臨床上的應用越來越廣泛。FK506是新型的強效免疫抑制劑,能夠與細胞性蛋白質FKBP12結合形成復合物,抑制鈣調神經磷酸酶,阻斷T細胞中鈣離子依賴型信息傳導通路,從而抑制T細胞活化和B細胞增殖,防止移植排斥相關的淋巴細胞產生,發(fā)揮防治排斥反應的作用。監(jiān)測FK506血藥濃度、制訂個體化用藥方案對于減小其毒副作用,獲得最佳免疫抑制效果具有重要意義[8-9]。ELISA法和EMIT法是常用的免疫學檢測方法。ELISA法屬于競爭性的酶聯(lián)免疫測定法,F(xiàn)K506自血漿蛋白中游離出來,與抗體結合形成復合物,之后加入的過氧化物酶(HRP)-FK506能競爭性與抗體結合,置換出血樣中游離的FK506,再經過顯色,使用酶標儀即可測出血樣中FK506濃度。該法具有準確性好、迅速、靈敏度高、特異性強等特點[10],但是需全程手工操作,過程較為復雜,易受環(huán)境影響[11]。EMIT法也稱為酶放大免疫法,原理為抗體結合位點競爭性抑制,試劑中用葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)標記的FK506競爭性的與抗體結合,使抗體失活,無法與血液中FK506形成復合物,未結合的G6PDH可以促進抗體試劑中的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸還原,從而被SYVAViva-E臨床化學分析儀檢測到,反映出血樣中FK506濃度[12-13],具有預處理步驟簡單、快速、自動化程度高的特點[14]。

    本研究選取81例接受FK506治療的肝移植患者,分別采用ELISA和EMIT試劑盒對靜脈血樣本中FK506血液濃度進行檢測,結果顯示,ELISA法和EMIT法檢測均具有較好的日內及日間精密度和準確度,RSD均<5%,在低濃度區(qū)間時檢測的精密度稍差,2種方法的監(jiān)測結果均復合《中國藥典》生物標本分析方法RSD<15%的要求[15],表明ELISA檢測試劑盒和EMIT檢測試劑盒均可用于肝移植患者FK506血液濃度的監(jiān)測。

    2種方法測得的FK506血藥濃度平均值符合正態(tài)分布,采用配對樣本t檢驗對檢測結果差異性分析結果顯示,EMIT法測定的FK506血藥濃度值明顯高于ELISA法(P<0.05),不同F(xiàn)K506血藥濃度范圍內2種方法測量數據比較結果顯示,F(xiàn)K506血藥濃度<2.0 μg/L時,ELISA法的測定結果明顯低于EMIT法的測定結果(P<0.05),2種檢測方法的原理不同,樣本提取過程、代謝產物識別過程、人工操作過程、樣本內源性物質較差反應等均可以對檢測結果造成影響,形成偏差,導致2種檢測方法對相同樣本的檢測結果存在差異,尤其是血藥濃度處于<2.0 μg/L水平時,差異較為明顯。以ELISA法測定值為X軸,以EMIT法測定值為Y軸,繪制散點圖,采用線性回歸對2種方法檢測FK506血藥濃度的相關性進行分析,結果顯示,2種檢測結果的相關系數r為0.9176,表明2種檢測方法的相關性以及一致性較好,但是由于2種檢測方法的測定結果存在差異,故在臨床使用時應各自建立治療窗范圍,結合各自特點相對固定的采用一種方式進行檢測,不適合頻繁交叉檢測。

    綜上所述,ELISA檢測試劑盒和EMIT檢測試劑盒均可用于肝移植患者FK506血液濃度的監(jiān)測,且相關性較好,但二者測定的FK506血液濃度差異顯著,需各自建立治療窗范圍進行判斷,檢測結果不可相互替換。

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    (編校:師維康)

    Effect of two different kits on blood concentration of tacrolimus in liver transplantation

    ZHOU Tai-lingΔ, ZHANG Hao, ZHANG Zhao-feng

    (Inspection Center, Zhoushan Hospital, Zhoushan 316000, China)

    ObjectiveTo investigate the effect of two different detection methods of reagent kits on blood concentration of Tacrolimus in liver transplantation.Methods81 cases of liver transplantation patients

    Tacrolimus testing in Zhoushan Hospital from February 2013 to August 2016 were selected, fasting venous blood of upper limb were collected 12h after treatment, blood concentrations of Tacrolimus in whole blood samples were detected by Enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)kit and Enzyme enhanced immunoassay(EMIT)kit respectively, the results of the two methods were observed and compared.ResultsThe intra day and inter day precision and accuracy of ELISA method were good, RSD<5%, in the low concentration range, the precision of detection was slightly worse; the intraday and inter day precision and accuracy of ELISA method were good, RSD<5%, in the low concentration range, the precision of detection was slightly worse; the Tacrolimus blood concentration measured by ELISA (5.19±0.73) μg/L test kit was significantly lower than that measured by EMIT kit (8.29±1.14) μg/L, the difference was statistically significant (P<0.05); correlation coefficient of the detection results of two kinds of reagent kit was r = 0.9176, the detection results were positively related; the determination results of ELISA kit (1.116±0.125) μg/L were obviously lower than that of EMIT kit (1.507±0.201) μg/L when Tacrolimus blood concentration <2g/L, with significant difference (P<0.05).ConclusionELISA detection kit and EMIT kit can be used to monitor the blood concentration of Tacrolimus in liver transplantation patients, and the correlation was good, but the blood concentrations of Tacrolimus were significantly different between the two kits, need to establish their own of therapeutic window to judge,the test results can not be replaced with each other.

    tacrolimus blood concentration; liver transplantation; enzyme linked immunosorbent assay; enzyme enhanced immunoassay

    10.3969/j.issn.1005-1678.2016.12.056

    周臺玲,通信作者,女,本科,檢驗技師,研究方向:臨床醫(yī)學檢驗,E-mail:17192263362@163.com。

    R322.4+7

    A

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