禽流感滅活疫苗H5N2 D7株與H5N1 Re-6株對(duì)鴨的免疫效果研究

朱建翠，彭南秀，譚　海，陳耀棠，張　楨，王　令，何日文，楊建宇，陳裕華，朱家輝，張海明，曾樹河，齊　敏，鄭麗蘭，黃　森，楊穗娟，鐘卓玲，張志茂（.廣州市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，廣東廣州　50440；. 廣州市番禺區(qū)動(dòng)物防疫監(jiān)督所，廣東廣州　5499；. 廣州市番禺區(qū)石樓鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，廣東廣州　5447）

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禽流感滅活疫苗H5N2 D7株與H5N1 Re-6株對(duì)鴨的免疫效果研究

朱建翠1，彭南秀1，譚海1，陳耀棠2，張楨1，王令1，何日文1，楊建宇1，陳裕華1，朱家輝1，張海明1，曾樹河3，齊敏1，鄭麗蘭1，黃森1，楊穗娟1，鐘卓玲1，張志茂1
（1.廣州市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，廣東廣州510440；2. 廣州市番禺區(qū)動(dòng)物防疫監(jiān)督所，廣東廣州511499；3. 廣州市番禺區(qū)石樓鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，廣東廣州511447）

摘要：為評(píng)價(jià)禽流感滅活疫苗（H5N2亞型，D7株）和重組禽流感病毒滅活疫苗（H5N1亞型，Re-6株）對(duì)鴨的免疫效果，根據(jù)獸醫(yī)流行病學(xué)中利用比較率判斷疫苗應(yīng)用效果的樣本量計(jì)算方法，得出所需的最小樣本量；以田間試驗(yàn)的方式，常規(guī)養(yǎng)殖白鴨300只、番鴨240只，并對(duì)其進(jìn)行隨機(jī)分組；按程序免疫，從10日齡首免后2周開始，每周采集血清測(cè)定抗體效價(jià)，直至出欄（白鴨45日齡、番鴨66日齡）。結(jié)果顯示，10日齡白鴨和番鴨的母源抗體分別為3.02 log2和0 log2，需進(jìn)一步開展研究，以確定最佳首免時(shí)間。首免后2周，無論是白鴨還是番鴨，H5N2 D7株疫苗組抗體HI效價(jià)和抗體合格率均高于H5N1 Re-6株疫苗組；首免后3～5周，兩種疫苗對(duì)白鴨和番鴨的HI效價(jià)均＞4 log2，抗體合格率均≥70%。二免后1周至出欄，兩種疫苗對(duì)白鴨和番鴨均產(chǎn)生較好的免疫效果，HI效價(jià)均＞7 log2，抗體合格率均＞80%。是否采用對(duì)應(yīng)亞型的血凝抑制抗原對(duì)抗體的檢測(cè)結(jié)果有較大影響。研究表明：免疫兩種疫苗后均能產(chǎn)生較好的免疫抗體，但相對(duì)而言，H5N2 D7株疫苗較H5N1 Re-6株疫苗更適合于鴨的免疫；在鴨等水禽中推廣使用該疫苗將能更有效地防控高致病性禽流感。

關(guān)鍵詞：鴨；禽流感；滅活苗；H5N1；H5N2；免疫效果；比較

以往研究表明，鴨是禽流感病毒的貯存庫，所有A型流感的HA亞型（H1～H15）和NA亞型（N1～N9）都曾在鴨體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)［1］，因此鴨被認(rèn)為在禽流感的傳播擴(kuò)散和生物學(xué)進(jìn)化中起了十分重要的作用［2-4］。以往認(rèn)為，鴨僅僅是禽流感病毒的攜帶者，但20世紀(jì)90年代中期以來，家鴨在亞洲的多起禽流感疫情中發(fā)病死亡的事實(shí)，說明鴨不僅僅是流感病毒的貯存庫，還是對(duì)禽流感高度易感的禽類［5］。

疫苗免疫是防止禽流感疫情發(fā)生的最有效手段之一，而免疫后抗體水平的高低則是評(píng)估實(shí)際免疫效果的重要指標(biāo)［6］。目前我國使用較多的是H5N1禽流感疫苗。我國華南地區(qū)自2013年起，將重組禽流感病毒滅活疫苗（H5N1亞型Re-6株，以下簡(jiǎn)稱Re-6株疫苗）作為政府采購的強(qiáng)制免疫苗，但其對(duì)水禽的免疫效果并不十分理想，臨床上常發(fā)生免疫失?。?］。為此，我國科研工作者利用從野鴨中分離到的H5N2亞型自然弱毒株，研制出水禽專用禽流感滅活疫苗（H5N2亞型D7株，以下簡(jiǎn)稱D7株疫苗），俗稱水禽專用苗。由于D7株疫苗投入生產(chǎn)使用僅一年多時(shí)間，養(yǎng)殖戶對(duì)其免疫效果了解不多，對(duì)其免疫效果的反饋好壞不一，對(duì)其實(shí)際免疫效果的報(bào)道也較少。鑒于此，本研究通過田間試驗(yàn)，用D7株疫苗和Re-6株疫苗分別免疫白鴨和番鴨，定期采集血清測(cè)定HI抗體效價(jià)，研究兩種疫苗免疫后HI抗體消長規(guī)律及其差異，比較兩種疫苗的免疫效果，為指導(dǎo)臨床使用提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物。2日齡白鴨（品種為櫻桃谷）和番鴨，購自廣州市番禺區(qū)某種鴨場(chǎng)。在選定的養(yǎng)殖場(chǎng)按當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖戶常規(guī)方法飼養(yǎng)至出欄（白鴨45日齡、番鴨66日齡）。

1.1.2試驗(yàn)疫苗。禽流感滅活疫苗（H5N2亞型，D7株），批號(hào)：2014036，廣州市華南農(nóng)大生物藥品有限公司生產(chǎn)；重組禽流感病毒滅活疫苗（H5N1亞型，Re-6株），批號(hào)：201516，哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司生產(chǎn)。

1.1.3檢測(cè)試劑。H5N2亞型HI試驗(yàn)抗原和陽性血清，批號(hào)：20150507，廣州市華南農(nóng)大生物藥品有限公司生產(chǎn)；H5N1亞型HI試驗(yàn)抗原（Re-6株）和陽性血清，批號(hào)：2015032，哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn)。

1.2方法

1.2.1樣本量計(jì)算方法。根據(jù)獸醫(yī)流行病學(xué)中利用比較率判斷疫苗應(yīng)用效果的樣本量計(jì)算公式［8］計(jì)算樣本數(shù)量。式中，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α設(shè)定為0.05，

Zα為標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布的1-α/2百分位值，是置信水平為1-α?xí)r所對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布的臨界值，Z0.05=1.96；Zβ為與檢驗(yàn)效度（把握度）1-β有關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布的（1-β）百分位值。本研究設(shè)定β為0.20，把握度1-β為80%，Z0.2=0.84；P1為群體1的預(yù)期流行率；P2為群體2的預(yù)期流行率；P為群體1和群體2預(yù)期流行率的平均值：（p1+p2）/2；q=1-p，q1=1-p1，q2=1-p2。通過比較上一年使用不同疫苗的鴨血清抗體監(jiān)測(cè)的結(jié)果，初步估計(jì)Re-6株疫苗的抗體合格率p1=40%、D7株疫苗的合格率p2=70%，計(jì)算得最小樣本量n=42（雙尾檢驗(yàn)），即每組最少需要42只實(shí)驗(yàn)鴨子。綜合考慮養(yǎng)殖過程中有15%～20%的死淘率，以及樣本的代表性、均衡性、抽血失敗等問題，將樣本量確定為白鴨每組75只、番鴨每組60只。

1.2.2分組和接種。將新購進(jìn)的2日齡白鴨和番鴨，各隨機(jī)分成4組，各組免疫程序見表1。

表1　各組別鴨子的免疫程序

1

1血。白鴨的B1、B3組于首免后2周至出欄，B2、B4組于二免后1周至出欄，每周每組翅靜脈采血50份；番鴨的F1、F3組于首免后2周至出欄，F(xiàn)2、F4組于二免后1周至出欄，每周每組翅靜脈采血40份。采血量1 mL/只，分離血清-20 ℃保存待檢。

1.2.5HI抗體效價(jià)測(cè)定。按照《高致病性禽流感診斷技術(shù)》（GB/T18936-2003）中的血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗(yàn)技術(shù)進(jìn)行。免疫D7株疫苗組用H5N2亞型HI試驗(yàn)抗原和陽性血清檢測(cè)，免疫Re-6株疫苗組用H5N1亞型HI試驗(yàn)抗原和陽性血清檢測(cè)；挑選部分血清交叉使用抗原進(jìn)行檢測(cè)。HI效價(jià)≥4 log2的判定為合格。

1.2.6數(shù)據(jù)整理和分析。對(duì)檢測(cè)結(jié)果用EXCEL、SPSS20.0等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計(jì)分析。

2　結(jié)果

2.1母源抗體測(cè)定情況

2日齡時(shí)，白鴨的母源抗體HI效價(jià)幾何平均值（GMT）為6.24 log2，番鴨為6.68 log2；10日齡時(shí)，白鴨GMT降至3.02 log2，番鴨GMT為0 log2，算術(shù)均值為1.41 log2。詳見表2。

表2　試驗(yàn)鴨母源抗體測(cè)定情況

2.2兩種疫苗對(duì)白鴨的免疫效果比較

2.2.1兩種疫苗免疫白鴨后的抗體消長情況。對(duì)白鴨進(jìn)行1次免疫時(shí)，免疫后2周（24日齡），D7株疫苗組和Re-6株疫苗組均有抗體產(chǎn)生，HI效價(jià)分別為4.35 log2、3.11 log2。隨后抗體水平逐漸升高，于免疫后4周（38日齡）時(shí)達(dá)到最高，后稍有下降；對(duì)白鴨二次免疫后1周，兩種疫苗的抗體HI效價(jià)GMT均＞6 log2，且逐漸升高，直至出欄時(shí)，GMT仍保持在8 log2以上。詳見圖1。

圖1　兩種疫苗不同免疫次數(shù)的白鴨抗體HI效價(jià)變化及95%置信區(qū)間分布

2.2.2兩種疫苗免疫白鴨后的抗體合格率比較。無論是僅進(jìn)行一次免疫，還是二次免疫，D7株疫苗組和Re-6株疫苗組白鴨的抗體合格率的變化基本一致，僅在一次免疫后2周時(shí)，D7株疫苗組的抗體合格率（70%）高于Re-6株疫苗組（24%），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pearson x2= 21.24，P＜0.01），詳見表3。

表3　不同免疫次數(shù)兩種疫苗免疫白鴨的抗體合格率比較

2.3兩種疫苗對(duì)番鴨免疫效果比較

2.3.1兩種疫苗免疫番鴨的抗體消長情況。僅進(jìn)行一次免疫時(shí)，首免后2周（24日齡），兩種疫苗均有抗體產(chǎn)生，但D7株疫苗組HI效價(jià)（3.34 log2）高于Re-6株疫苗組（2.17 log2），首免后3～7周，兩種疫苗HI效價(jià)消長基本一致并穩(wěn)定在5～6 log2之間。二次免疫后1周（38日齡）起，兩種疫苗HI效價(jià)GMT均穩(wěn)定在7 log2以上的高水平，至第4周略有下降。具體變化趨勢(shì)見圖2。

圖2　兩種疫苗不同免疫次數(shù)的番鴨抗體HI效價(jià)變化及95%置信區(qū)間分布

2.3.2兩種疫苗免疫番鴨后抗體合格率比較。兩種疫苗組番鴨的抗體合格率的變化基本一致。一次免疫后2周時(shí)，D7株疫苗組的抗體合格率（46.67%）高于Re-6株疫苗組（15.79%），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pearson x2= 7.70，P＜0.01）；二次免疫后4周，Re-6株疫苗組的抗體合格率（100%）高于D7株疫苗組（88.57%），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pearson x2=6.21，P=0.01），詳見表4。

2.4不同亞型抗原對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

2.4.1不同亞型抗原對(duì)抗體合格率的影響。選取173份免疫了D7株疫苗的鴨血清和175份免疫了Re-6株疫苗的鴨血清，分別用H5N2亞型抗原和H5N1亞型抗原進(jìn)行交叉HI試驗(yàn)，結(jié)果不同亞型抗原交叉血凝試驗(yàn)結(jié)果有較大差異。用對(duì)應(yīng)的抗原檢測(cè)時(shí)，抗體合格率明顯高于用非對(duì)應(yīng)抗原檢測(cè)的合格率（p＜0.01）。具體結(jié)果見表5。

表4　不同免疫次數(shù)兩種疫苗免疫番鴨抗體合格率比較

表5　不同亞型抗原交叉血凝試驗(yàn)結(jié)果

2.4.2不同亞型抗原交叉檢測(cè)的抗原性差異系數(shù)。用抗原性差異系數(shù)R計(jì)算公式［9］分析兩種抗原交叉檢測(cè)對(duì)結(jié)果的影響，發(fā)現(xiàn)D7株疫苗與Re-6株疫苗的抗原性差異系數(shù)R為0.62，表明兩毒株間抗原性有小的差異，見表6。

注：r1：甲血清對(duì)乙抗原的HI效價(jià)/甲血清對(duì)甲抗原的HI效價(jià)；r2：乙血清對(duì)甲抗原的HI效價(jià)/乙血清對(duì)乙抗原的HI效價(jià)

表6　不同亞型抗原性差異系數(shù)

3　討論

廣州市地處珠江三角洲河網(wǎng)區(qū)，水系發(fā)達(dá)，是國內(nèi)主要的水禽生產(chǎn)和消費(fèi)區(qū)，2015年廣州水禽年出欄量達(dá)3 179萬只。如何有效防控水禽禽流感已成為廣州地區(qū)禽流感防控的重要課題。

3.1母源抗體對(duì)于保護(hù)出生不久的動(dòng)物免受疫病感染具有十分重要的作用

由于疫苗免疫抗體的產(chǎn)生需要一定的時(shí)間，所以只有當(dāng)母源抗體水平很低甚至為零時(shí)才進(jìn)行免疫。這會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)一段免疫空檔期，增加了動(dòng)物疫病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)［10］，因此選擇合適的首免時(shí)間十分重要。在本研究中，2日齡時(shí)，白鴨和番鴨的母源抗體水平均＞6 log2，但到10日齡時(shí)，白鴨和番鴨的母源抗體水平已分別降至3.02 log2和0 log2，低于有效保護(hù)水平。對(duì)于番鴨來說，此時(shí)進(jìn)行首免已明顯偏遲，最佳的首免時(shí)間有待進(jìn)一步研究。

3.2一般情況下，HI抗體效價(jià)在4～5 log2時(shí)能抵御禽流感野毒的侵襲，起到保護(hù)作用，而低于4 log2時(shí)保護(hù)力很差［10］

本次研究發(fā)現(xiàn)，首免后2周，僅白鴨D7株疫苗組抗體HI效價(jià)＞4 log2，且抗體合格率達(dá)到70%。番鴨雖未達(dá)到起保護(hù)作用的抗體水平，但D7株疫苗組的免疫效果仍然優(yōu)于Re-6株疫苗組；而首免3周后，無論是白鴨還是番鴨，兩種疫苗均能達(dá)到具有保護(hù)效力的抗體水平，抗體合格率也均達(dá)到合格標(biāo)準(zhǔn)（≥70%）。二次免疫組的抗體效價(jià)和抗體合格率都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于同期僅一次免疫組的水平，說明二次免疫效果明顯優(yōu)于一次免疫。廣州市白鴨出欄時(shí)間一般為40～45天，部分養(yǎng)殖戶僅進(jìn)行一次免疫，相對(duì)于Re-6株疫苗，D7株疫苗能更早達(dá)到保護(hù)水平，因此更適合于白鴨的禽流感防控。對(duì)養(yǎng)殖時(shí)間較長的番鴨而言，推廣D7株疫苗和10日齡前首免，31日齡加強(qiáng)免疫1次的免疫程序更為合適。

3.3研究發(fā)現(xiàn)，D7株疫苗產(chǎn)生的抗體能更早達(dá)到保護(hù)水平，且抗體持續(xù)時(shí)間更長，對(duì)鴨的免疫效果明顯好于Re-6株疫苗，更適合水禽使用

這與國內(nèi)學(xué)者的研究結(jié)論［11-12］基本一致。這可能是由于D7株疫苗毒株分離于禽流感的天然宿主鴨，為自然弱毒，免疫原性好，屬于我國近年來主要流行的2.3.2分支，較Re-6株疫苗抗原譜更廣［10］，故而對(duì)水禽有較為理想的免疫保護(hù)效果。

3.4本次研究發(fā)現(xiàn)，免疫不同亞型疫苗，但未采用同源的HI抗原進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)的合格率會(huì)低于采用同亞型HI抗原的檢測(cè)結(jié)果

建議使用D7株疫苗的地區(qū)在進(jìn)行水禽抗體監(jiān)測(cè)時(shí)，應(yīng)詳細(xì)記錄養(yǎng)殖戶使用的疫苗類型，并采用相對(duì)應(yīng)的HI抗原進(jìn)行檢測(cè)。

3.5由于受國家有關(guān)HPAI 研究要求的限制，本次研究未進(jìn)一步做攻毒保護(hù)試驗(yàn)

吳濤等［13］用5株2010年以后分離的高致病性禽流感流行毒株對(duì)免疫了D7株疫苗的鴨進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)，結(jié)果顯示疫苗對(duì)5株高致病性禽流感流行毒株的攻擊均可產(chǎn)生良好的免疫保護(hù)作用，并可有效阻止排毒，研究認(rèn)為推廣使用D7株水禽專用疫苗對(duì)于水禽的高致病性禽流感防控將發(fā)揮重要作用。

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（責(zé)任編輯：朱迪國）

Comparison of the Immune Efficacy of Avian Influenza Inactivated Vaccine H5N2（D7 stain）and H5N1（Re-6 stain）in Ducks

Zhu Jiancui1，Peng Nanxiu1，Tan Hai1，Chen Yaotang2，Zhang Zhen1，Wang Ling1，He Riwen1，Yang Jianyu1，Chen Yuhua1，Zhu Jiahui1，Zhang Haiming1，Zeng Shuhe3，Qi Min1，Zheng Lilan1，Huang Sen1，Yang Suijuan，Zhong Zhuoling1，Zhang Zhimao1

（1.Guangzhou Animal Health Inspection Institution，Guangzhou，Guangdong 510440；2. Panyu District Animal Epidemic Prevention Supervision Institution of Guangzhou City， Guangzhou，Guangdong 511499；3.Shilou Town Animal Husbandry and Veterinary Station of Panyu District，Guangzhou，Guangdong 511447）

Abstract：To evaluate the immune efficacy of the inactivated avian influenza virus（AIV）H5N2 subtype vaccine（D7 stain）and H5N1 subtype vaccine（Re-6 stain）in ducks，300 white ducks and 240 muscovy ducks were divided into 4 groups respectively，immunized with H5N2 D7 or H5N1 Re-6 inactivated vaccine with given immunization program and raised conventionally. Serum samples were collected each week from two weeks after immunization to the time for marketing. And then the hemagglutinin inhibition（HI）antibody was detected. The results showed that the time for the first immunization for ducks may be questionable as the maternal antibody titer of white ducks and muscovy ducks were 3.5 log2and 1.4 log2，respectively. Two weeks after the first immunization，the HI titers of H5N2 D7 vaccine groups were higher than that of H5N1 Re-6 vaccine group，both for white ducks and muscovy ducks. The HI titers of two kindsof vaccines were all higher than 4 log2，as the qualified rates were higher than 70% both for white ducks and muscovy ducks 3～5 weeks after the first immunization.Since one week after the second immunization till time for marketing，the two vaccines showed good immune effect with antibodies HI titer all ＞7 log2and qualified rates ≥80% in the two kinds of ducks. Besides，there was great influence on the result of the antibody detection using non-corresponding HI subtypes. This study showed that the H5N2 vaccine（D7 stain）was more suitable for ducks and more important for prevention and control of HPAI in waterfowl in China ，although the two kind of vaccines could produce relatively good antibody titers.

Key words：duck；avian influenza；inactivated vaccine；H5N1；H5N2；immune efficacy；comparison

中圖分類號(hào)：S851.38

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1005-944X（2016）06-0063-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2016.06.019

通訊作者：譚 海，何日文