雞蛋中常見食源性致病菌的生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型研究

趙　格，宋　雪，趙建梅，王　娟，曲志娜，黃秀梅，劉鮮鮮，王君瑋（中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，農(nóng)業(yè)部畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（青島），山東青島　266032）

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雞蛋中常見食源性致病菌的生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型研究

趙格，宋雪，趙建梅，王娟，曲志娜，黃秀梅，劉鮮鮮，王君瑋
（中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，農(nóng)業(yè)部畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（青島），山東青島266032）

摘要：為快速預(yù)測(cè)雞蛋中常見食源性致病菌的生長(zhǎng)規(guī)律，以不同溫度下貯存的不同狀態(tài)的雞蛋為試材，以Gompertz方程擬合沙門氏菌、致病性大腸桿菌和空腸彎曲桿菌在蛋內(nèi)的生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示，Gompertz模型能很好地模擬不同溫度下三種致病菌的生長(zhǎng)情況（R＞0.98）。蛋殼完好時(shí)接種致病菌后，在4°C低溫和22～25°C常溫貯存條件下，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的蛋內(nèi)容物中均檢測(cè)不到致病菌，但在32°C高溫20 d后，都不同程度地分離到了致病菌。蛋殼輕微裂紋時(shí)，低溫條件下，只有空腸彎曲桿菌接種組未分離到菌；室溫條件下，致病性大腸桿菌和沙門氏菌從一開始即可侵入到蛋內(nèi)，空腸彎曲桿菌在20 d時(shí)可直接檢測(cè)到較多的菌量；高溫條件下，致病菌在3 d后便均可快速繁殖。本模型的構(gòu)建可以為常見食源性致病菌在雞蛋內(nèi)的定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：食源性致病菌；雞蛋；不同溫度；生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型

我國(guó)是禽蛋生產(chǎn)與消費(fèi)大國(guó)，2000年年產(chǎn)量為2 243.3萬噸，超過世界總產(chǎn)量的40%，全國(guó)人均18.1 kg，超過發(fā)達(dá)國(guó)家水平。其中禽蛋產(chǎn)量的85%為雞蛋，雞蛋消費(fèi)在我國(guó)食品消費(fèi)中占重要地位［1-2］。因食用被致病菌污染的禽蛋引起的食物中毒事件在我國(guó)時(shí)有發(fā)生。據(jù)統(tǒng)計(jì)，1991—1996年由蛋類引起的食物中毒為166起，中毒人數(shù)為4 207人［3］。家禽及其產(chǎn)品是主要食源性致病菌，如沙門氏菌、致病性大腸桿菌和彎曲桿菌的主要細(xì)菌庫(kù)源和傳播載體［4-6］。沙門氏菌由于可在母雞體內(nèi)垂直傳播，向來被認(rèn)為是禽蛋中最常攜帶的致病菌。事實(shí)上，除了垂直傳播外，養(yǎng)殖環(huán)境和貯存環(huán)境也都會(huì)直接或間接地影響禽蛋中致病微生物的攜帶，從而影響其質(zhì)量。

微生物預(yù)測(cè)模型能夠定量描述在特定環(huán)境條件下食源性微生物的生長(zhǎng)、殘存和死亡動(dòng)態(tài)，確保產(chǎn)品在生產(chǎn)、運(yùn)輸和貯藏過程中的安全和穩(wěn)定［7］。對(duì)雞蛋中常見致病菌的生長(zhǎng)模型進(jìn)行預(yù)測(cè)，可以為雞蛋的質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，特別是定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供數(shù)據(jù)支持，而定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估可以更有效地指導(dǎo)生產(chǎn)和消費(fèi)。目前國(guó)內(nèi)對(duì)常見食源性致病菌在雞蛋內(nèi)的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型并沒有相關(guān)研究。因此本研究通過擬合不同溫度條件下沙門氏菌、致病性大腸桿菌和空腸彎曲桿菌在蛋殼完好和蛋殼微裂的蛋內(nèi)生長(zhǎng)情況，建立初級(jí)預(yù)測(cè)模型，旨在對(duì)污染致病菌的雞蛋內(nèi)容物中致病菌的存活情況做出較為科學(xué)的預(yù)測(cè)，為監(jiān)控雞蛋的質(zhì)量安全和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供有效的數(shù)據(jù)支撐和參考。

1　材料與方法

1.1材料

雞蛋是山東青島某蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)當(dāng)天的新鮮雞蛋。沙門氏菌、致病性大腸桿菌O157：H7和空腸彎曲桿菌是本實(shí)驗(yàn)室保存的。選用胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（青島海博生物）對(duì)沙門氏菌和O157：H7進(jìn)行培養(yǎng)和計(jì)數(shù)，選用改良Skirrow氏瓊脂基礎(chǔ)對(duì)彎曲桿菌進(jìn)行培養(yǎng)和計(jì)數(shù)。

對(duì)新鮮的雞蛋模擬帶病原的泄殖腔污染或糞便污染，然后置于不同溫度下，模擬不同的貯存環(huán)境。在不同時(shí)間內(nèi)，檢測(cè)蛋內(nèi)容物中致病菌的數(shù)量，預(yù)測(cè)致病微生物在不同狀態(tài)下的雞蛋內(nèi)生長(zhǎng)模型。

1.2雞蛋的模擬污染

新鮮的雞蛋經(jīng)酒精和紫外消毒，排除自身蛋殼攜帶菌的污染后，一部分雞蛋制作輕微裂紋（小勺圓底部分輕輕敲打雞蛋，以看不到明顯裂紋，但聽到聲音變化為標(biāo)準(zhǔn)），然后同蛋殼完好的雞蛋一起快速滾過108CFU/mL的沙門氏菌、O157：H7和空腸彎曲桿菌的菌液，室溫置24 h進(jìn)行感染，模擬帶病原的泄殖腔污染或糞便污染。然后再次用酒精和紫外線去除未感染入內(nèi)的菌，模擬工廠對(duì)收集的雞蛋進(jìn)行清潔滅菌處理。不處理的作為對(duì)照。將雞蛋分組置于低溫＜8 °C（4 °C）、常溫22～25 °C、高溫＞30 °C（32 °C）下貯存。

1.3致病菌計(jì)數(shù)

分別在模擬感染1 d、3 d、5 d、10 d、20 d和30 d后，每組取3枚雞蛋進(jìn)行相應(yīng)菌落計(jì)數(shù)。先將雞蛋表面消毒，然后將雞蛋打入滅菌的，帶有玻璃珠的三角瓶，充分混勻，取5 mL梯度稀釋，取100 μL涂布計(jì)數(shù)平板，沙門氏菌和大腸桿菌37 °C培養(yǎng)，彎曲桿菌42 °C厭氧培養(yǎng)。

1.4生長(zhǎng)模型的建立

應(yīng)用Curve Expert1.4軟件擬合各致病菌在蛋內(nèi)不同溫度下的生長(zhǎng)曲線。分別將在不同溫度下獲得的三種致病菌的生長(zhǎng)數(shù)據(jù)，用軟件中Gompertz模型擬合它們的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)，得到相應(yīng)的初級(jí)預(yù)測(cè)生長(zhǎng)模型，這是一個(gè)非線性模型。

圖1　蛋殼完好時(shí)32°C貯存條件不同致病菌在蛋內(nèi)的生長(zhǎng)曲線

2　結(jié)果

2.1常見致病菌在溫度較低時(shí)不易侵入蛋殼完好的雞蛋

在蛋殼完好的情況下，感染三種不同致病菌以及不感染對(duì)照組在低溫（4 °C）和常溫（22～25 °C）貯存條件下各個(gè)時(shí)間點(diǎn)（1 d、3 d、5 d、10 d、20 d 和30 d）在蛋內(nèi)容物中都檢測(cè)不到致病菌，但是在高溫（32 °C）時(shí)，到20 d和30 d，感染致病菌的三組都不同程度地分離到了致病菌，將獲得的致病菌生長(zhǎng)數(shù)據(jù)用Gompertz模型擬合其生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)模型（圖1）?？梢娫诘皻ね旰玫那闆r下，即使受過致病菌污染，若及時(shí)清潔，不管在室溫還是冷藏環(huán)境貯存1個(gè)月，也是沒有問題的。但當(dāng)溫度較高時(shí)，到第20天，致病菌就會(huì)進(jìn)入蛋內(nèi)開始繁殖。

2.2常見致病菌短時(shí)間內(nèi)即可侵入蛋殼微裂的雞蛋并進(jìn)行繁殖

輕微的蛋殼破裂在實(shí)際生活中并不容易發(fā)現(xiàn)。本研究同樣模擬了輕微的蛋殼裂紋感染三種不同致病菌，在低溫（4 °C）、常溫（22～25 °C）和高溫（32 °C）貯存條件下各個(gè)時(shí)間點(diǎn)（1 d、3 d、5 d、10 d、20 d和30 d）蛋內(nèi)容物中致病菌的生長(zhǎng)情況見圖2～4。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低溫情況下，除空腸彎曲桿菌感染組未分離到菌外，其余三組都不同程度地分離到致病菌，對(duì)照組也檢測(cè)到微量細(xì)菌。室溫情況下，致病性大腸桿菌和沙門氏菌從一開始即可侵入到蛋內(nèi)進(jìn)行繁殖。大腸桿菌從第10天開始高速繁殖，而沙門氏菌從第3天就開始高速繁殖，說明沙門氏菌更容易穿過有抑菌效應(yīng)的蛋清（蛋清中有占蛋白含量3.5%左右的溶菌酶）；空腸彎曲桿菌在前期的幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)中均未檢測(cè)到，但是20 d后檢測(cè)到較多的菌量，說明空腸彎曲桿菌不易穿過有抑菌效果的蛋清，但是一旦穿過，便可快速繁殖；對(duì)照組在10 d以后也可以檢測(cè)到相對(duì)較多的細(xì)菌，說明10 d后環(huán)境中的細(xì)菌也可以入侵裂紋的雞蛋。高溫情況下，大腸桿菌5 d后開始快速繁殖，沙門氏菌3 d后便可快速繁殖，空腸彎曲桿菌10 d后開始進(jìn)入快速繁殖階段，同樣環(huán)境中的細(xì)菌在10 d后也可以入侵裂紋的雞蛋。

3　討論

圖2　蛋殼裂紋時(shí)4°C貯存條件不同致病菌在蛋內(nèi)的生長(zhǎng)曲線

圖3　蛋殼裂紋時(shí)22°C貯存條件不同致病菌在蛋內(nèi)的生長(zhǎng)曲線

圖4　蛋殼裂紋時(shí)32°C貯存條件不同致病菌在蛋內(nèi)的生長(zhǎng)曲線

雞蛋在排出時(shí)若是受到染病雞的泄殖腔或者雞糞的污染，蛋殼表面的保護(hù)膜會(huì)直接被雞糞腐蝕掉或者經(jīng)過隨后的人手摩擦或冷藏也會(huì)很快被破壞，這樣蛋殼表面污染的致病菌就可以侵入到蛋內(nèi)。本研究就是模擬雞蛋在受致病菌污染的情況下，同時(shí)模擬不同的貯存條件，通過Gompertz方程來擬合常見食源性致病菌在蛋內(nèi)的生長(zhǎng)曲線，從而預(yù)測(cè)它們?cè)谔囟顟B(tài)下的生長(zhǎng)模型，便于更好地控制雞蛋的質(zhì)量安全，為雞蛋的品質(zhì)評(píng)價(jià)和貨架期預(yù)測(cè)提供了數(shù)據(jù)支撐。

目前國(guó)內(nèi)對(duì)食源性致病菌在食品中的預(yù)測(cè)生長(zhǎng)模型研究較多，在雞蛋內(nèi)還未有相關(guān)研究。通過本研究所建立的生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型，可以看出蛋殼完好的雞蛋即使受過致病菌污染，但若清潔及時(shí)，室溫或冷藏貯存1個(gè)月是沒有問題的。但在溫度較高時(shí)，第20天就會(huì)有致病菌侵入蛋內(nèi)。蛋殼裂紋的雞蛋一旦污染大腸桿菌和沙門氏菌，這兩種致病菌當(dāng)天就可以侵入蛋內(nèi)。但是冷藏條件下，致病菌繁殖很慢，而在室溫或者高溫條件下，沙門氏菌從第3天就可快速繁殖，大腸桿菌稍微滯后；空腸彎曲桿菌對(duì)裂紋雞蛋的入侵是滯后的，冷藏條件下根本就不入侵，在室溫20 d或高溫10 d時(shí)才能在蛋內(nèi)檢測(cè)到，但是菌量已經(jīng)很高，說明空腸彎曲桿菌不易入侵雞蛋，但一旦侵入蛋內(nèi)，便迅速繁殖。另外不感染對(duì)照組在非冷藏狀態(tài)下10 d后也可以檢測(cè)到蛋內(nèi)有細(xì)菌入侵，說明環(huán)境中的細(xì)菌也可入侵裂紋雞蛋?？梢娡旰玫牡皻な请u蛋抵御細(xì)菌感染的天然屏障，冷藏是較好的貯存方式。

以上研究結(jié)果表明：在收獲雞蛋后，最好先清潔后再貯存。因?yàn)榧幢闶俏廴具^致病菌的雞蛋，在清潔滅菌后，繼續(xù)貯存一個(gè)月后都未能在蛋內(nèi)檢測(cè)到致病菌。在貯藏時(shí)首選冷藏方式。因?yàn)榧词沟皻?/p>

裂紋，冷藏條件下，致病菌也難以侵入蛋內(nèi)進(jìn)行繁殖。在食用時(shí)建議食用熟雞蛋。因?yàn)槌刭A存時(shí)間過長(zhǎng)，環(huán)境中的細(xì)菌都有可能進(jìn)入雞蛋，尤其是有些不易發(fā)現(xiàn)的微裂紋雞蛋，更極易被細(xì)菌污染。

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（責(zé)任編輯：朱迪國(guó)）

Study on Predictive Modeling of Food-borne Pathogens Growth in Eggs

Zhao Ge，Song Xue，Zhao Jianmei，Wang Juan，Qu Zhina，Huang Xiumei，Liu Xianxian，Wang Junwei
（China Animal Health and Epidemiology Center，Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Livestock and Poultry Products（Qingdao），Ministry of Agriculture，Qingdao，Shandong 266032）

Abstract：To rapidly predicate food-borne bacterial growth modeling in eggs，the growth curves of salmonella，enteropathogenic Escherichia coli and campylobacter jejuni in eggs stored under different temperatures were fit by Gompertz equation. The results showed that the Gompertz modeling could commendably predict the bacterial growths under three kinds of temperatures （R＞0.98）. When the pathogens inoculated on the intact shells，pathogens could not be detected in the eggs stored under low temperature 4 °C and room temperature 22～25 °C，but could be detected after 20 days under 32 °C high temperature. When the pathogens were inoculated on the shells with slight crack，only campylobacter jejuni could not be isolated from eggs under low temperature；under room temperature，salmonella and enteropathogenic Escherichia coli could invade in eggs at the beginning，and campylobacter jejuni could be directly detected a lot until 20 days. Under high temperature，each pathogen could rapidly grow after 3 days. This study may provide a theoretical reference for quantitative microbial risk assessment of food-borne pathogen in eggs.

Key words：food-borne pathogens；egg；different temperatures；predictive modeling of growth

中圖分類號(hào)：S851.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1005-944X（2016）06-0068-04

DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2016.06.020

基金項(xiàng)目：國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估重大專項(xiàng)-2015年（GJFP2015007）

通訊作者：王君瑋