應(yīng)用近紅外光譜技術(shù)快速鑒別鐵皮石斛的產(chǎn)地

顧玉琦++劉瑞婷++壽國(guó)忠

摘要：采用近紅外漫反射光譜技術(shù)結(jié)合簇類獨(dú)立軟模式方法（SIMCA）建立了預(yù)測(cè)模型，并對(duì)5個(gè)產(chǎn)地的鐵皮石斛進(jìn)行了快速鑒別研究。光譜數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)Savitzky-Golay（S-G）平滑、1階Savitzky-Golay（S-G）求導(dǎo)和均值中心化組合光譜預(yù)處理和波段選擇優(yōu)化后，所建的SIMCA模型為最佳模型。所建模型的識(shí)別率和拒絕率均為100%，而且5個(gè)產(chǎn)地鐵皮石斛的模型也能拒絕其他3種石斛金釵石斛、紫皮石斛和金石斛。研究表明，模型合理，能夠成功實(shí)現(xiàn)鐵皮石斛產(chǎn)地快速鑒別，為不同產(chǎn)地的鐵皮石斛的快速鑒別提供了一種新的方法。

關(guān)鍵詞：鐵皮石斛；近紅外漫反射；產(chǎn)地鑒別

中圖分類號(hào)： O657.33文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）05-0365-04

鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）是蘭科石斛屬多年生附生草本植物，是傳統(tǒng)名貴珍稀中藥材，具有益胃生津、滋陰清熱等功效[1]。鐵皮石斛的主要化學(xué)成分包含多糖、氨基酸、生物堿、礦物元素、菲類、聯(lián)芐類和茐酮化合物等[2]。

不同產(chǎn)地的鐵皮石斛價(jià)格和藥用價(jià)值差異很大。2013年12月，位于浙江省臨安市的天目山鐵皮石斛和位于云南省的廣南鐵皮石斛已經(jīng)通過(guò)國(guó)家質(zhì)檢總局批準(zhǔn)實(shí)施地理標(biāo)志產(chǎn)品保護(hù)[3]；2014年5月，浙江省樂(lè)清市和廣西省容縣均被授予“中國(guó)鐵皮石斛之鄉(xiāng)”的稱號(hào)。目前，在市場(chǎng)上有許多不法商家和企業(yè)，用非地理標(biāo)志產(chǎn)品和非“中國(guó)鐵皮石斛之鄉(xiāng)”的鐵皮石斛以次充好，以謀取高額利益。面對(duì)如此混亂的市場(chǎng)，非常需要研究1種快速鑒定鐵皮石斛產(chǎn)地的技術(shù)。

在以前不同產(chǎn)地鐵皮石斛的研究中，多以理化試驗(yàn)、紫外分光光度法、高效液相色譜等技術(shù)進(jìn)行試驗(yàn)研究[4-7]，這些方法技術(shù)耗時(shí)、耗力、成本高、須要專業(yè)技術(shù)人員操作。與以上技術(shù)相比，近紅外光譜分析技術(shù)具有分析速度快、成本低、光譜測(cè)量方便、樣品前處理簡(jiǎn)單，且能夠最大限度地保留不同產(chǎn)地樣本間的微小差異等優(yōu)點(diǎn)[8]，目前該技術(shù)已被用于麥冬、當(dāng)歸、人參、白芷、黃芪等藥材的產(chǎn)地鑒別，效果較好[9-13]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究利用近紅外光譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)對(duì)不同種類的石斛進(jìn)行快速鑒別，均獲得較好的結(jié)果[14-17]，但是該方法用于同一品種石斛不同產(chǎn)地的鑒別研究尚未見(jiàn)報(bào)道。主要原因是石斛產(chǎn)地之間的差異主要是受到地理位置、氣候條件、栽培技術(shù)等多因素影響，這種差異較石斛品種間差異小，因此產(chǎn)地鑒別比品種鑒別困難。本研究利用近紅外漫反射光譜法結(jié)合簇類獨(dú)立軟模式（soft independent modeling of class analogy，SIMCA）法對(duì)5個(gè)產(chǎn)地的鐵皮石斛進(jìn)行鑒別分析，旨在為石斛產(chǎn)地的快速鑒別提供新的方法。

1材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用的材料為來(lái)自安徽霍山、浙江樂(lè)清、浙江天目山、廣西容縣、云南龍陵的鐵皮楓斗，分別收集20、30、30、30、30個(gè)批次。所有樣品來(lái)源于中國(guó)石斛博物館。樣品用中藥粉碎機(jī)粉碎，分別過(guò)40、60、80目篩，取約2 g樣品在上述條件下進(jìn)行測(cè)量。隨機(jī)把140份石斛樣本劃分為84份校正集和56份驗(yàn)證集，其中安徽霍山、浙江樂(lè)清、浙江天目山、廣西容縣、云南龍陵分別為12、18、18、18、18份作為校正集樣品，剩余的樣品作為驗(yàn)證集。

使用儀器：微型近紅外光譜儀SmartEye1700（尼邇光電科技有限公司），DFT-100大德不銹鋼中藥粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司），凱豐實(shí)驗(yàn)室電子天平稱重精密電子秤（KF-0040）（中國(guó)凱豐基團(tuán)有限公司），不銹鋼篩盤（頂歷醫(yī)療器械有限公司）。

1.2光譜采集

試驗(yàn)所用微型近紅外光譜儀，光譜掃描范圍為1 000～1 650 nm，分辨率為8 cm-1，掃描次數(shù)為50次，由于樣品為不透明的粉末狀顆粒，所以試驗(yàn)采用積分球的漫反射采樣方式。為了保證儀器能量的穩(wěn)定，每次掃描光譜前，儀器需預(yù)熱 30 min。在試驗(yàn)過(guò)程中，濕度基本保持不變，室內(nèi)溫度保持在25 ℃左右。將樣品置于采樣窗口區(qū)域，以儀器內(nèi)置背景為參比，100% SpectralonTM標(biāo)準(zhǔn)白板為參考。每個(gè)樣本在不同時(shí)間、不同位置分別采集3次，取其平均光譜作為該樣品的原始光譜。

1.3光譜數(shù)據(jù)預(yù)處理

在建立SIMCA模型之前，為消除基線漂移、高頻隨機(jī)噪聲和光散射等因素對(duì)樣品光譜的影響，需要對(duì)光譜進(jìn)行預(yù)處理以獲得有用信息。樣本粒徑的大小和均勻度都會(huì)對(duì)光的漫反射有一定影響；同時(shí)樣本的密實(shí)度也會(huì)影響光的傳播，因此需要對(duì)樣本的原始光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理。為消除光譜數(shù)據(jù)在采集時(shí)首端與末端產(chǎn)生的部分噪音，截取 1 100～1 630 nm波段的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。本試驗(yàn)分別采用無(wú)處理、多元散射校正（multiplicative signal correction，MSC）、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量（standard normal variate，SNV）、S-G平滑+1階S-G求導(dǎo)、S-G 平滑+1階S-G導(dǎo)數(shù)加均值中心化等組合預(yù)處理方法對(duì)樣本的原始光譜進(jìn)行預(yù)處理，最后選出最佳的光譜預(yù)處理方法為S-G平滑+1階S-G導(dǎo)數(shù)加均值中心化。

1.4數(shù)據(jù)分析方法

主成分分析（principal component analysis，PCA）是把多個(gè)指標(biāo)轉(zhuǎn)換為幾個(gè)綜合指標(biāo)的1種統(tǒng)計(jì)方法，沿著協(xié)方差最大的方向由高維數(shù)據(jù)空間向低維數(shù)據(jù)空間投影，所得的主成分向量相互正交，它可以將樣本在高維空間的分布通過(guò)低維空間來(lái)展現(xiàn)[18]。

近紅外光譜吸收弱、譜帶較寬且重疊嚴(yán)重，因此采用化學(xué)計(jì)量學(xué)中的多變量數(shù)據(jù)分析方法進(jìn)行分析。本研究使用SIMCA法結(jié)合近紅外光譜技術(shù)對(duì)鐵皮石斛的5個(gè)產(chǎn)地進(jìn)行鑒別。

SIMCA法在光譜色譜的定性分析中得到了廣泛的應(yīng)用。在本研究中，首先針對(duì)某一產(chǎn)地樣本的光譜數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行主成分分析，建立這個(gè)產(chǎn)地的主成分回歸模型，然后依據(jù)該模型對(duì)未知樣品進(jìn)行識(shí)別，即分別試探將該未知樣本與各樣本的模型進(jìn)行擬合，以確定未知樣本的產(chǎn)地[19]。模型質(zhì)量的評(píng)價(jià)使用識(shí)別率、拒絕率等指標(biāo)。

識(shí)別率=識(shí)別自身類樣本個(gè)數(shù)該類樣本的總個(gè)數(shù)×100%；（1）

拒絕率=拒絕其它類樣本個(gè)數(shù)其它樣本的總個(gè)數(shù)×100%。（2）

原始試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)Imethod 2000軟件（儀器自帶軟件）獲取，再通過(guò)Matlab（R2008a）程序進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與建模。

2結(jié)果與分析

2.1樣品粒度對(duì)近紅外光譜的影響

以浙江樂(lè)清產(chǎn)地的樣品為例，研究樣品粒度對(duì)近紅外光譜的影響。取浙江樂(lè)清產(chǎn)地的鐵皮石斛為樣品，采用中藥粉碎機(jī)粉碎樣品，將粉碎的樣品通過(guò)不同目數(shù)的篩網(wǎng)，形成一系列粒徑大小不同的樣品：樣品粒徑40、60、80目。研究發(fā)現(xiàn)，近紅外吸收強(qiáng)度與樣品粒徑大小有關(guān)（圖1）。隨著樣品粒徑的增加，樣品反射光譜[lg（1/R）]越大，吸收強(qiáng)度增大，近紅外吸收強(qiáng)度與樣品粒徑大小正相關(guān)；樣品越細(xì)，光譜穩(wěn)定性越好[20]。

2.2不同樣品粒度的SIMCA模型的建立和評(píng)價(jià)

以浙江樂(lè)清產(chǎn)地的樣品為例，研究不同樣品粒度SIMCA模型的建立和評(píng)價(jià)。對(duì)40、60、80目3種不同樣品粒度的近紅外光譜，使用校正集樣品建立SIMCA模型，用驗(yàn)證集檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷目煽啃越Y(jié)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)80目的光譜所建模型的效果優(yōu)于40、60目；大于60目目篩的樣品均勻性和光譜的重現(xiàn)性好 （表1）。因此，80目的光譜建立的模型效果最好，本試驗(yàn)采用80目篩的鐵皮石斛樣品進(jìn)行測(cè)定。

2.3近紅外漫反射光譜

為消除光譜數(shù)據(jù)在采集時(shí)首端與末端產(chǎn)生的部分噪音，記錄了1 100～1 630 nm波段的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。近紅外光譜反映的是C-H、O-H等含氫基團(tuán)的倍頻和合頻吸收，鐵皮石斛中含有多糖、生物堿、氨基酸等大量化學(xué)成分，這些成分的含氫基團(tuán)都能在近紅外區(qū)域產(chǎn)生倍頻與合頻吸收（圖2）。此外，所有樣品在1 140～1 240 nm和1 360～1 500 nm附近有明顯的吸收峰，這2個(gè)區(qū)域分別為C-H第3組合頻和C-H第2組合頻區(qū)域（圖2）[21]。不同產(chǎn)地鐵皮石斛的光譜曲線趨勢(shì)相似，在部分區(qū)域有明顯區(qū)別，具有一定的特征性和指紋性，這一差異為鐵皮石斛不同產(chǎn)地的鑒別奠定了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

在1 142、1 410、1 480 nm處有顯著的吸收峰（圖3），其中1 142 nm光譜特征吸收峰是官能團(tuán)芳烴（ArCH）的C-H伸縮振動(dòng)基頻的二級(jí)倍頻譜帶；1 410 nm光譜特征吸收峰是官能團(tuán)亞甲基的C-H亞甲基的C-H組合頻（伸縮振動(dòng)基頻的一級(jí)倍頻譜帶和彎曲振動(dòng)基頻吸收譜帶）；1 480 nm處光譜特征吸收峰是官能團(tuán)聚酰胺11非鍵合N-H伸縮振動(dòng)基頻的一級(jí)倍頻譜[21]。

2.4PCA分析

本研究通過(guò)比較不同光譜預(yù)處理方法、波長(zhǎng)范圍和主因子數(shù)對(duì)建模精度的影響，對(duì)5個(gè)產(chǎn)地的鐵皮石斛建立不同的模型。5個(gè)產(chǎn)地鐵皮石斛的最優(yōu)預(yù)處理方法為S-G平滑、1

階S-G導(dǎo)數(shù)和均值中心化，5個(gè)產(chǎn)地鐵皮石斛的最優(yōu)波長(zhǎng)范圍為1 100～1 630 nm。用主成分分析法對(duì)校正集樣本進(jìn)行分析，基于樣本的主成分得分圖能夠更直觀地揭示樣本的內(nèi)部特征和聚類信息。X軸表示樣本的第一主成分得分（PC1），Y軸表示樣本第二主成分得分（PC2），Z軸表示樣本第二主成分得分（PC3），5個(gè)產(chǎn)地的鐵皮石斛樣本在該示意圖中有明顯的分類趨勢(shì)（圖4），再次說(shuō)明利用近紅外光譜判別鐵皮石斛的產(chǎn)地是可行的。

2.55個(gè)產(chǎn)地鐵皮石斛的SIMCA分類模型

通過(guò)交互驗(yàn)證（cross-validation）來(lái)確定上述鐵皮石斛的5個(gè)產(chǎn)地模型的最佳主成分?jǐn)?shù)，即在預(yù)測(cè)殘差平方和（prediction residual error sum of square，PRESS）變化不大的情況下選取比較小的主成分?jǐn)?shù)。在不同的主成分?jǐn)?shù)下，5個(gè)產(chǎn)地的模型的預(yù)測(cè)殘差平方和見(jiàn)圖5。因此，不同模型主因子數(shù)的選取結(jié)果為：安徽霍山產(chǎn)地取主因子數(shù)為4，提取4個(gè)主成分的貢獻(xiàn)率已達(dá)全光譜貢獻(xiàn)率的97.89%；浙江樂(lè)清模型取主因子數(shù)為2，提取2個(gè)主成分的貢獻(xiàn)率已達(dá)全光譜貢獻(xiàn)率的 97.92%；浙江天目山、廣西容縣、云南龍陵的模型取主因子數(shù)都為3，提取3個(gè)主成分的貢獻(xiàn)率分別已達(dá)全光譜貢獻(xiàn)率的97.38%、97.09%、99.29%。

在極顯著性水平條件下來(lái)檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷目煽啃?，獲得了所建立的預(yù)測(cè)模型性能最佳校正和驗(yàn)證的結(jié)果（表2）。研究發(fā)現(xiàn)，在對(duì)校正集樣品進(jìn)行預(yù)測(cè)的時(shí)候，5個(gè)產(chǎn)地的模型對(duì)于本產(chǎn)地樣品的識(shí)別率均為100%；在拒絕非本產(chǎn)地樣品時(shí)，5個(gè)產(chǎn)地模型的拒絕率均為100%。對(duì)驗(yàn)證集樣品進(jìn)行預(yù)測(cè)時(shí)，5個(gè)產(chǎn)地的模型對(duì)樣品的識(shí)別率均為100%，拒絕率均為100%。結(jié)果表明，可以用該SIMCA模型鑒別不同產(chǎn)地來(lái)源的鐵皮石斛，所建立的產(chǎn)地識(shí)別模型能夠達(dá)到正確識(shí)別5個(gè)

2.6對(duì)其他樣品的鑒別

為進(jìn)一步確認(rèn)近紅外判別分析模型的可靠性，利用建好的5個(gè)產(chǎn)地鐵皮石斛的模型對(duì)其他3種石斛金釵石斛、紫皮石斛、金石斛的樣品進(jìn)行判別分析，發(fā)現(xiàn)所建模型對(duì)其他樣品拒絕率都為100%（表3）。

3結(jié)論

本研究研究了不同樣品粒徑對(duì)近紅外光譜的影響，建立了不同樣品粒度的SIMCA模型，并對(duì)該模型進(jìn)行了評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)隨著樣品粒徑的增加，樣品反射光譜和吸收強(qiáng)度逐漸增大，因此近紅外吸收強(qiáng)度與樣品粒徑大小正相關(guān)。此外，80目的光譜建立的模型效果優(yōu)于40、60目光譜所建模型。

本研究利用近紅外光譜技術(shù)結(jié)合SIMCA模式識(shí)別方法對(duì)5個(gè)產(chǎn)地的鐵皮石斛建立了鑒別模型。經(jīng)過(guò)對(duì)比不同光譜預(yù)處理和光譜波段對(duì)模型的影響，最后選擇S-G平滑+1階S-G導(dǎo)數(shù)+均值中心化組合為最佳預(yù)處理方法和1 100～1 630 nm 為建模光譜波段，所建模型為最優(yōu)的模型。模型能正確識(shí)別5個(gè)產(chǎn)地鐵皮石斛，對(duì)其他產(chǎn)地識(shí)別時(shí)，拒絕率達(dá)到100%，而且5個(gè)產(chǎn)地鐵皮石斛的模型也能拒絕其他3種石斛金釵石斛、紫皮石斛和金石斛。結(jié)果表明，近紅外光譜結(jié)合SIMCA模式識(shí)別方法在鐵皮石斛產(chǎn)地溯源中具有可行性，為解決鐵皮石斛的質(zhì)量安全問(wèn)題[22-24]提供了一種新的思路。與理化試驗(yàn)、紫外分光光度法和高效液相色譜等技術(shù)方法相比，本研究所提出的鐵皮石斛產(chǎn)地識(shí)別方法具有識(shí)別率高、識(shí)別方法可擴(kuò)充性好、適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。

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