大葉山楝拮抗內(nèi)生真菌DYSJ3的鑒定及抑菌活性產(chǎn)物分析

吳亞騰++吳曼莉++柳志強(qiáng)

摘要：從大葉山楝體內(nèi)分離得到1株內(nèi)生真菌DYSJ3，發(fā)現(xiàn)其對(duì)香蕉炭疽病菌、橡膠炭疽病菌、香蕉枯萎病菌和芒果炭疽病菌具有較強(qiáng)的拮抗作用，皿內(nèi)抑制率分別為61.9%、57.9%、55.3%和65.9%。通過形態(tài)學(xué)觀察結(jié)合ITS序列分析，初步將菌株DYSJ3鑒定為雜色曲霉（Aspergillus versicolor）。對(duì)菌株DYSJ3產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)進(jìn)行了初步分析，發(fā)現(xiàn)菌株DYSJ3的抑菌活性物質(zhì)集中于菌絲體中，其菌絲體乙酸乙酯浸提物對(duì)多種植物病原真菌具有較強(qiáng)的抑菌活性，且熱穩(wěn)定性較好，100 μg/mL浸提物對(duì)香蕉炭疽病菌及蘋果輪紋病菌具有明顯抑制活性，抑制率分別為 72.7% 和62.0%。當(dāng)濃度為1 000 μg/mL時(shí)，浸提物對(duì)香蕉炭疽病菌、蘋果輪紋病菌、黃瓜枯萎病菌、橡膠炭疽病菌、小麥赤霉病菌的抑制率均大于90%。

關(guān)鍵詞：大葉山楝；內(nèi)生真菌；雜色曲霉；抑菌活性

中圖分類號(hào)： S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）05-0181-03

大葉山楝（Aphanamixis grandifolia）為楝科（Meliaceae）山楝屬（Aphanamixis） 植物，主要分布于廣東、廣西、云南、海南等低海拔至中海拔山地溝谷密林或疏林地區(qū)，是一種傳統(tǒng)的中藥。《新華本草綱要》記載大葉山楝的根及葉具有祛風(fēng)除濕、舒筋活絡(luò)及通痹等功效，為祛風(fēng)止痛藥。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，大葉山楝中主要含有倍半萜、二萜、三萜等萜類成分和甾體等，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤等活性[1-3]。Zeng等從大葉山楝中分離到四環(huán)三萜、倍半萜、木脂素、苯丙素、二肽類等化合物，并選出多個(gè)具有腫瘤細(xì)胞抑制活性的單體化合物[4]；黃淼等從大葉山楝根分離得到9 個(gè)化合物，發(fā)現(xiàn)多個(gè)化合物對(duì)慢性髓原白血病細(xì)胞K562和人胃癌細(xì)胞SGC-7901有生長(zhǎng)抑制活性[5]。然而，目前關(guān)于大葉山楝內(nèi)生真菌的研究鮮有報(bào)道。本研究從大葉山楝體內(nèi)分離出1株內(nèi)生真菌DYSJ3，發(fā)現(xiàn)其對(duì)多種植物病原菌具有較好的拮抗活性，通過形態(tài)觀察結(jié)合ITS序列分析對(duì)該菌株進(jìn)行鑒定，并對(duì)其產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)進(jìn)行初步分析。

1材料與方法

1.1菌株

內(nèi)生真菌DYSJ3從大葉山楝中經(jīng)組織表面消毒分離獲得。

供試真菌：香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum sp. cubense）、黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum sp. cucumerinum）、小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum）、香蕉炭疽病菌（Colletotrichum musae）、橡膠炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、芒果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、蘋果輪紋病菌（Botryosphaeria berengriana sp. piricola）由海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院提供。

1.2培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水 1 000 mL。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1 000 mL。

CM培養(yǎng)基：胰化蛋白胨6 g，酵母提取物6 g，蔗糖10 g，蒸餾水1 000 mL。

1.3菌種活化及平板拮抗試驗(yàn)

將內(nèi)生真菌DYSJ3及植物病原真菌接種于PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)5～7 d活化待用。用5 mm打孔器在培養(yǎng)5～7 d的供試內(nèi)生真菌、病原真菌平板的菌落邊緣取菌餅，將病原真菌置于PDA平板中央，菌株DYSJ3置于平板邊緣，以只接種病原真菌的PDA平板為對(duì)照，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，28 ℃培養(yǎng)5～7 d，測(cè)量菌落半徑（mm），計(jì)算抑菌率。抑菌率=（對(duì)照組菌落半徑-處理組菌落半徑）/對(duì)照組菌落半徑×100%。

1.4菌株DYSJ3鑒定

將菌株DYSJ3接種于PDA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)3～7 d，從第3天開始每天挑取少量菌絲于載玻片上，在顯微鏡下觀察氣生菌絲、分生孢子等，拍照并描述特征。

菌株基因組DNA提取采用CTAB法[6]，利用ITS通用引物（ITS 1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，ITS 4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 PCR反應(yīng)體系為：10×buffer 2.5 μL，Taq酶0.25 μL，dNTPs 2 μL，ITS 1 0.5 μL，ITS 4 0.5 μL，dH2O 18.25 μL，模板1 μL，總體積 25 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 30 min。將所得產(chǎn)物用純化試劑盒回收，連接到pMD18-T Vector，由上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，將所測(cè)序列在GenBank 中（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）進(jìn)行Blast分析。用Clustal X （1.83） 軟件進(jìn)行多序列比對(duì)（Multiple alignments），利用MEGA 5.0軟件以鄰近相接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5菌株DYSJ3粗提物的制備及活性測(cè)定

菌株DYSJ3活化后，接種于5 L的PDA液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)7 d，室溫避光靜置21 d。將菌絲體和發(fā)酵液用8層紗布過濾分離，充分洗凈菌絲體。發(fā)酵液濃縮為浸膏后備用。菌絲體用95%乙醇浸泡后超聲破碎1 h，再用8層紗布過濾獲得乙醇浸出液，濃縮為浸膏后備用。

配制香蕉炭疽菌的孢子懸浮液（1×107 CFU/mL），混入PDA 平板中，制備帶菌平板。將獲得的發(fā)酵液及菌絲體浸膏用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇進(jìn)行浸提，獲得各溶劑層浸膏，丙酮溶解，利用牛津杯法檢測(cè)其拮抗活性[7]。

1.6菌株DYSJ3粗提物熱穩(wěn)定性及抗菌譜測(cè)定

熱穩(wěn)定性試驗(yàn)：使用香蕉炭疽病菌制備帶菌平板，將DYSJ3粗提物置于120 ℃處理1 h，利用牛津杯法檢測(cè)其活性。

抗菌譜測(cè)定：將DYSJ3菌絲體乙酸乙酯粗提物用丙酮完全溶解后混入PDA培養(yǎng)基，制成濃度分別為100、500、1 000 μg/mL 的平板，以加丙酮PDA平板為對(duì)照組。用直徑5 mm打孔器在供試病原菌菌落邊緣取菌餅接于平板中央，每處理3個(gè)重復(fù)，28 ℃培養(yǎng)3～7 d，十字交叉法測(cè)量所有處理菌落生長(zhǎng)直徑（mm），按如下公式計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率[8]：

菌絲生長(zhǎng)抑制率=[（對(duì)照菌落直徑-5）-（處理菌落直徑-5）]/（對(duì)照菌落直徑-5）×100%。

2結(jié)果與分析

2.1菌株DYSJ3皿內(nèi)拮抗活性

利用對(duì)峙生長(zhǎng)法測(cè)試了菌株DYSJ3對(duì)4種植物病原真菌的皿內(nèi)拮抗活性，結(jié)果見表1、圖1，內(nèi)生真菌DYSJ3對(duì)香蕉炭疽病菌、橡膠炭疽病菌、香蕉枯萎病菌和芒果炭疽病菌具有明顯的拮抗作用，皿內(nèi)抑制率均大于50%。

表1菌株DYSJ3對(duì)4種植物病原真菌的皿內(nèi)抑制率

供試病原真菌抑菌率（%）香蕉炭疽病菌61.9橡膠炭疽病菌57.9香蕉枯萎病菌55.3芒果炭疽病菌65.9

2.2菌株DYSJ3鑒定

菌株DYSJ3在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)14 d直徑 3～6 cm，菌落呈不規(guī)則圓形、緊密，培養(yǎng)基正面顏色有數(shù)環(huán)，從青綠到紅綠，背面顏色有青黃、紅褐色等。分生孢子頭的頂囊近球形，頂囊著生小梗，小梗有單層、雙層、單雙層同時(shí)生在1個(gè)頂囊上，頂端有鏈形孢子、近球形孢子，無(wú)色（圖2）。對(duì)菌株DYSJ3的ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)序得到 598 bp 的堿基序列。將得到的ITS序列進(jìn)行Blast分析，發(fā)現(xiàn)其與雜色曲霉的親緣關(guān)系最近，相似度達(dá)到100%。選取多株曲霉屬菌株與DYSJ3的ITS序列，利用MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3），DYSJ3在系統(tǒng)進(jìn)化樹中與Aspergillus versicolor在同一分支上，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征初步將DYSJ3鑒定為雜色曲霉（Aspergillus versicolor）。

2.3菌株DYSJ3粗提物制備及活性分析

利用牛津杯法測(cè)試了菌株DYSJ3發(fā)酵液及菌絲體粗提物對(duì)香蕉炭疽病菌的拮抗作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DYSJ3發(fā)酵液粗提物對(duì)病原菌無(wú)拮抗作用，菌絲體乙酸乙酯浸提物具有明顯的拮抗活性（圖4-A）。由此可見，菌株DYSJ3的抑菌活性物質(zhì)集中于菌絲體中。將菌絲體乙酸乙酯浸提物置于120 ℃處理1 h后測(cè)試拮抗活性，抑菌圈與對(duì)照組相比無(wú)顯著變化（圖4-B），可見菌株DYSJ3產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)具有較好的熱穩(wěn)定性。

將菌株DYSJ3菌絲體乙酸乙酯浸提物配制成不同濃度（100、500、1 000 μg/mL），測(cè)試了其對(duì)6種植物病原菌的拮抗活性，結(jié)果見表2、圖5。菌絲體乙酸乙酯浸提物在1 000 μg/mL 濃度時(shí)對(duì)香蕉炭疽病菌、蘋果輪紋病菌、黃瓜枯萎病菌、橡膠炭疽病菌、小麥赤霉病菌抑制率均大于90%，對(duì)香蕉炭疽病菌及蘋果輪紋病菌菌絲抑制明顯，500 μg/mL濃度下抑制率分別達(dá)到93.5%和87.3%。

3討論

從微生物次生代謝產(chǎn)物中篩選抗生素是新藥開發(fā)的一個(gè)重要途徑，隨著近年來(lái)對(duì)新型抗生素需求的增加，植物內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物的研究受到了廣泛的關(guān)注。藥用植物內(nèi)生真菌多樣性十分豐富，由于特殊的生存環(huán)境，藥物植物內(nèi)生真菌在生長(zhǎng)和代謝過程中可以產(chǎn)生各種具有特殊化學(xué)結(jié)構(gòu)類型和特殊生理功能的活性物質(zhì)，這是研究開發(fā)農(nóng)藥先導(dǎo)化合物珍貴的原料寶庫(kù)。

本研究對(duì)分離自藥用植物大葉山楝內(nèi)生真菌DYSJ3進(jìn)行了鑒定，初步鑒定為曲霉屬雜色曲霉。目前有關(guān)雜色曲霉次生代謝產(chǎn)物的研究有部分報(bào)道，董世豪等從相似蜂海綿分離到1株海洋真菌雜色曲霉F62，從中分離得到了6 個(gè)化合物，分別為Alantrypinone、洛伐他汀、甲酯型莫納克林K、土曲霉酮、土震素B和麥角甾醇，其中土曲霉酮具有體外抗炎活性[9]；鞏婷等從海洋真菌雜色曲霉 F62 中分離得到6個(gè)丁內(nèi)酯類化合物，其中丁內(nèi)酯Ⅰ表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗炎活性[10]；趙彩桂從雜色曲霉中分離鑒定了22個(gè)化合物，主要為沒藥烷型倍半萜、二苯醚類化合物、生物堿和甾體[11]；王香粉從海洋真菌雜色曲霉菌發(fā)酵液中分離純化得到 7 個(gè)化合物，包括 5-methylbenzene-1，3-diol、吡咯并哌嗪-1，4-二酮、3-（hydroxymethyl）cyclopentanol、3-異丙基-吡咯并哌嗪 2，5-二酮、6-甲氧基柄曲菌素等[12]。然而，目前尚未有將雜色曲霉用于植物真菌病害防治的研究。本研究發(fā)現(xiàn)菌株DYSJ3菌絲體乙酸乙酯浸提物對(duì)6種植物病原真菌具有較強(qiáng)的抑制能力，具有廣譜抗菌性，熱穩(wěn)定性較好，具有開發(fā)的潛力。本研究為下一步進(jìn)行菌株DYSJ3抑菌活性物質(zhì)的分離、鑒定及應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。

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