抑菌劑及接種條件在矮牽牛開放式快速繁殖中的效果

曾云英++萬強(qiáng)++馬存琛

摘要：以矮牽牛為外植體，將不同種類和濃度的抑菌劑加入培養(yǎng)基中，確定適合矮牽牛開放式快速繁殖的最佳抑菌劑種類和濃度。結(jié)果表明，Y1和Y2均可作為矮牽牛開放式快速繁殖的抑菌劑，Y1濃度為2.5%時(shí)抑菌效果最佳且外植體生長(zhǎng)良好。接種器具用抑菌劑浸泡消毒5 min后在空氣消毒后的制劑間接種可以達(dá)到超凈工作臺(tái)的效果。

關(guān)鍵詞：矮牽牛；開放式快速繁殖；抑菌劑；接種條件

中圖分類號(hào)： S681.604+.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）05-0079-02

植物開放式快速繁殖是指在抑菌劑的作用下，使植物快速繁殖脫離嚴(yán)格無菌的操作環(huán)境，不需高壓滅菌和超凈工作臺(tái)，用普通容器代替組培瓶，在自然、開放的有菌環(huán)境下進(jìn)行植物的快速繁殖。該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了把植物組培從無菌實(shí)驗(yàn)室移到自然環(huán)境中進(jìn)行，可降低植物快繁要求、簡(jiǎn)化快繁程序、降低快繁成本、提高快繁效率。當(dāng)前關(guān)于植物開放式快速繁殖的研究重點(diǎn)是圍繞污染控制問題展開，抑菌劑的選擇成為開放式快速繁殖是否成功的關(guān)鍵。利用抗生素、農(nóng)藥、家用消毒劑、植物提取物等作為抑菌劑方面的研究均有報(bào)道，崔剛等首次采用植物提取液作為抑菌劑對(duì)葡萄莖段進(jìn)行培養(yǎng)，成功獲得外植體，由此開始快速繁殖的相關(guān)研究[1]。陳瑞丹等以植物混合提取液作為抑菌劑對(duì)梅花莖段進(jìn)行培養(yǎng)[2]。丁國(guó)昌等以退菌特為抑菌劑獲得黑木相思開放式快速繁殖的再生苗，污染率僅為9.3%[3]；解輝等以家用消毒劑次氯酸鈉作為香蕉開放式快速繁殖的抑菌劑，認(rèn)為濃度在0.01%以上可有效抑制培養(yǎng)基的污染[4]；趙青華等將特制的H198抑菌劑400倍液添加到培養(yǎng)基中，獲得魔芋的再生苗[5]；王趙玉等比較生物農(nóng)藥大蒜素與化學(xué)農(nóng)藥代森錳鋅的抑菌效果，認(rèn)為適當(dāng)濃度的大蒜素和代森錳鋅抑菌效果均比較理想且不會(huì)對(duì)植物生長(zhǎng)產(chǎn)生副作用[6]。王丹用山梨酸鉀作為抑菌劑獲得紅豆杉的再生苗[7]。本研究以2種復(fù)合抑菌劑（Y1，Y2）作為矮牽牛開放式快速繁殖的抑菌劑，研究適合矮牽牛外植體生長(zhǎng)的最佳抑菌劑種類和濃度，以及合適的接種操作方法，以期建立其開放式快速繁殖技術(shù)體系，簡(jiǎn)化快速繁殖程序，降低快速繁殖成本，為植物的低成本工廠化生產(chǎn)提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1材料

植物材料為矮牽牛莖尖和莖段。抑菌劑為復(fù)合型抑菌劑，Y1由植物提取，Y2是化學(xué)合成制劑，均由上海宇涵生物科技有限公司提供。

1.2方法

1.2.1抑菌劑篩選以MS+1.0 mg/L BA+0.5 mg/L NAA為矮牽牛培養(yǎng)基，將不同濃度的Y1、Y2抑菌劑分別添加到培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基不經(jīng)過高溫高壓滅菌直接接種。Y1抑菌劑濃度為 1.25、2.50、3.50 mL/L，Y2抑菌劑的濃度為0.25、0.50、1.00 mL/L。以傳統(tǒng)制備方法即高溫高壓滅菌為對(duì)照。

1.2.2接種條件的篩選接種盤、鑷子、刀片不同處理：高壓滅菌、乙醇浸泡消毒、抑菌劑浸泡消毒、不消毒。接種環(huán)境：超凈工作臺(tái)接種、空氣消毒后的制劑間接種。以快速繁殖的傳統(tǒng)接種方法為對(duì)照。

1.2.3統(tǒng)計(jì)與分析材料接種培養(yǎng)后，在一定時(shí)間內(nèi)對(duì)材料的污染率、芽分化率以及外植體生長(zhǎng)狀況作觀察記載及必要的統(tǒng)計(jì)。本試驗(yàn)中，污染率=污染的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100%；分化率=已分化的外植體數(shù)/接種后成活外植體數(shù)×100%。

統(tǒng)計(jì)相關(guān)的數(shù)據(jù)，采用SPSS for windows 10.0統(tǒng)計(jì)分析軟件包對(duì)試驗(yàn)觀察數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2結(jié)果與分析

2.1抑菌劑種類及濃度對(duì)矮牽?？焖俜敝车挠绊?/p>

試驗(yàn)于2015年3月11日進(jìn)行，接種后定期觀察外植體生長(zhǎng)狀況，接種后7、14、20 d分別統(tǒng)計(jì)外植體污染情況，接種后30 d觀察統(tǒng)計(jì)外植體分化狀況。與傳統(tǒng)組織培養(yǎng)相比，污染率一直是植物開放式快速繁殖的一大難題。從表1可以看出，傳統(tǒng)的滅菌方式培養(yǎng)20 d時(shí)污染率為0。加了抑菌劑的培養(yǎng)基在一定程度上能控制污染，但達(dá)不到高壓滅菌的效果。Y1、Y2在低濃度時(shí)污染率較高，濃度高時(shí)基本能達(dá)到與傳統(tǒng)滅菌方式一樣的無菌效果。培養(yǎng)7 d時(shí)，不加抑菌劑和不進(jìn)行高壓滅菌的CK2污染率最高，為80%，其次是Y1濃度為1.25 mL/L時(shí)，污染率為13%。培養(yǎng)14 d時(shí)，Y1濃度為 2.50 mL/L、Y2濃度為0.25 mL/L時(shí)開始出現(xiàn)污染，之后污染逐漸加重，20 d時(shí)污染率分別達(dá)到33%和20%。由此可見，14 d是污染加重的一個(gè)拐點(diǎn)，為了減少污染，可在培養(yǎng)14 d左右更換培養(yǎng)基。

抑菌劑對(duì)外植體分化率及生長(zhǎng)狀況的影響見表2。從表2可以看出，隨著Y1濃度的升高，外植體的分化率減少，Y1濃度為1.25、2.50 mL/L時(shí)分化率差異不顯著。本試驗(yàn)所設(shè)的Y2等3個(gè)濃度均不利于外植體的分化，外植體只伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，并且隨Y2濃度升高，外植體黃化率增高，直至全部死亡。

比較Y1和Y2的污染率及外植體生長(zhǎng)狀況可以看出Y2作為抑菌劑可以很好的抑菌污染，但對(duì)外植體的傷害很大，很小的濃度就能使外植體整株黃化甚至死亡。Y1抑菌力不及Y2，但對(duì)外植體傷害小，外植體能正常生長(zhǎng)與分化。適合矮牽牛開放式快速繁殖的抑菌劑種類為Y1、濃度為2.5 mL/L。

2.2接種條件對(duì)矮牽牛外植體生長(zhǎng)及分化的影響

以抑菌效果最好的濃度為2.50 mL/L的Y1為抑菌劑添表2抑菌劑種類及濃度對(duì)矮牽?？焖俜敝车挠绊?/p>

抑菌劑種類抑菌劑濃度（mL/L）接種瓶數(shù)（瓶）分化率（%）外植體生長(zhǎng)狀況Y11.2515100aA未污染的外植體生長(zhǎng)良好，分化正常2.501593aA外植體生長(zhǎng)良好，分化正常3.501553bB外植體生長(zhǎng)纖細(xì)，部分分化Y20.25150cC外植體老葉萎黃，不分化，伸長(zhǎng)生長(zhǎng)緩慢0.50150cC外植體不生長(zhǎng)，葉片萎黃，逐漸死亡1.00150cC外植體不生長(zhǎng)，葉片萎黃，逐漸死亡CK1不加抑菌劑，高壓滅菌10100 aA未發(fā)生污染，外植體生長(zhǎng)良好，正常分化CK2不加抑菌劑，不高壓滅菌100cC污染嚴(yán)重注：各處理芽分化率進(jìn)行LSD檢驗(yàn)，同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著，不同大寫字母表示在0.01水平差異顯著。

加到矮牽牛開放式快速繁殖的培養(yǎng)基中，在不同的接種條件下進(jìn)行接種，觀察外植體污染情況和生長(zhǎng)狀況，以確定接種條件對(duì)抑菌效果的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，接種器具用500 mg/L的Y2浸泡消毒5 min可以達(dá)到徹底消毒的效果，制劑間空氣消毒后接種和超凈工作臺(tái)接種污染狀況沒有差異，接種器具經(jīng)抑菌劑浸泡消毒后在空氣消毒后的制劑間進(jìn)行接種與傳統(tǒng)的在超凈工作臺(tái)里進(jìn)行的接種效果一樣。制劑間空氣消毒可作為矮牽牛的開放式快速繁殖的接種環(huán)境（表3）。

3結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，Y1、Y2在植物組織培養(yǎng)中的抑菌效果良好，Y2的抑菌效果更佳，但Y2在抑菌的同時(shí)，對(duì)外植體的傷害較大，外植體出現(xiàn)生長(zhǎng)緩慢，葉片黃化，最后全株黃化死亡。Y1由植物提取液組成，抑菌效果相對(duì)Y1較弱，但對(duì)外植體不產(chǎn)生傷害，外植體正常生長(zhǎng)和分化。綜合抑菌能力和外植體的生長(zhǎng)狀況，Y1濃度為2.5%是最佳的抑菌劑。接種器具用Y2浸泡消毒5 min后在空氣消毒后的制劑間進(jìn)行接種，可以替代在超凈工作臺(tái)接種。化學(xué)抑菌劑在抑菌的同時(shí)影響外植體生長(zhǎng)、甚至導(dǎo)致外植體整株死亡，植物提取的抑菌劑對(duì)外植體的傷害相對(duì)小[8-9]，發(fā)現(xiàn)更多更有效的植物性抑菌劑是今后工作的重點(diǎn)。

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