采用微衛(wèi)星DNA標(biāo)記分析皖南中蜂小群保種效果

孟祥金++吉挺++沈芳

摘要：利用篩選后的12對(duì)熒光標(biāo)記微衛(wèi)星引物分析皖南中蜂野生群與皖南中蜂保種場(chǎng)保種群，探討小群保種效果。共檢測(cè)確定60個(gè)個(gè)體基因型，通過計(jì)算2 個(gè)群體的優(yōu)勢(shì)等位基因頻率（Pi）、期望雜合度（He）、多態(tài)信息含量（PIC）、群體內(nèi)近交系數(shù)（Fis）分析了皖南中蜂群體內(nèi)和群體間的遺傳變異，采用配對(duì)試驗(yàn)均數(shù)差異t檢驗(yàn)，比較了保種群體與野生群體的遺傳差異。結(jié)果表明：保種群體與野生群體間的Pi 無顯著性差異（P=0.440>0.05）；He略高于野生群體，差異均不顯著（P=0.122），PIC 顯著高于野生群體（P=0.047>0.05）；Fis顯著高于野生群體（P=0.019<0.05）。結(jié)果說明，皖南中蜂采用小群保種效果良好。

關(guān)鍵詞：皖南中蜂；微衛(wèi)星DNA；遺傳多樣性；保種效果

中圖分類號(hào)： S892文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）05-0062-03

皖南中蜂是中華蜜蜂的重要組成，皖南中蜂具有適應(yīng)性強(qiáng)、嗅覺靈敏、善于利用零星蜜粉源、抗病蟲害、群勢(shì)強(qiáng)、產(chǎn)量高等優(yōu)良性狀[1]。皖南中蜂已被農(nóng)業(yè)部和安徽省列入第一批“地方畜禽保護(hù)品種名錄”。但是長期以來，由于保種經(jīng)費(fèi)不足，加上西方蜜蜂的大量飼養(yǎng)，皖南中蜂群數(shù)銳減[2]。近幾年安徽中鋒開始實(shí)行小群保種。

微衛(wèi)星是目前普遍使用的分子遺傳標(biāo)記方法，具有多態(tài)性好、共顯性、易于鑒定、檢測(cè)重復(fù)性好以及基因組中分布廣泛等優(yōu)點(diǎn)。聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）在其持續(xù)發(fā)展和管理動(dòng)物遺傳資源的戰(zhàn)略計(jì)劃中，推薦將微衛(wèi)星標(biāo)記作為優(yōu)先考慮的分析工具[2-3]。近幾年來微衛(wèi)星標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于我國各地蜜蜂種質(zhì)資源分析，但是目前普遍采用聚丙烯酰胺電泳加放射顯影或銀染的方法，不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力效率低，而且誤差較大[4-6]。本研究利用篩選后的12對(duì)熒光標(biāo)記微衛(wèi)星引物，對(duì)保種場(chǎng)與野生種群遺傳多樣性進(jìn)行比較分析，旨在初步評(píng)價(jià)小群保種的效果，繼而探討小群保種的可能性。

1材料和方法

1.1試驗(yàn)材料

本研究所用皖南中蜂為皖南地區(qū)保種場(chǎng)群體和原產(chǎn)地野生群體，各隨機(jī)選取30群，每群隨機(jī)采集成年工蜂10只，用無水乙醇溶液浸泡保存。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1基因組DNA提取基因組DNA提取參照吉挺等所建立的方法[7]，提取的基因組DNA用微量紫外可見分光光度計(jì)（NanoDrop ND-1000）測(cè)定含量與純度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2常規(guī)引物的篩選根據(jù)課題組成員對(duì)中華蜜蜂轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果[8]所獲得的3 000多個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行篩選，選擇的原則為等位基因數(shù)目多，具有高度多態(tài)性，結(jié)合GenBank和相應(yīng)文獻(xiàn)提供的微衛(wèi)星引物對(duì)所選54對(duì)引物進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)一步篩選出30對(duì)擴(kuò)增效果較好的微衛(wèi)星引物。引物均由生工（上海）生物工程服務(wù)有限公司（Sangon）提供。

1.2.3PCR反應(yīng)體系與產(chǎn)物擴(kuò)增由于PCR反應(yīng)中影響因素較多，試驗(yàn)分別設(shè)計(jì)了以DNA模板濃度、Mg2+濃度、Taq酶用量、退火溫度為因素的梯度試驗(yàn)，最終確定PCR的反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)體系：10×buffer 2.0 μL，25 mmol/L MgCl2 1.0 μL，10 mmol/L dNTPs 0.5 μL，10 pmol/μL 上游引物 1.0 μL，10 pmol/μL下游引物1.0 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.2 μL，100 ng/μL DNA模板 1.0 μL，超純水 13.3 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性50 s，（59～62） ℃（因不同引物而異）退火50 s，72 ℃延伸 50 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存（Eppendorf，Mastercycler pro S）。

1.2.4聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)和硝酸銀染色配制3%瓊脂糖凝膠，點(diǎn)樣6 μL，120 V電泳20 min，檢查產(chǎn)物的有無。如有產(chǎn)物，配制8%聚丙烯酰胺凝膠80 mL體系，100 V預(yù)電泳5 min，點(diǎn)樣10 μL，120 V電泳3 h。進(jìn)行硝酸銀染色，直至出現(xiàn)清晰的等位基因條帶。

1.2.5熒光引物的篩選和組合根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果，盡量選擇不同染色體上的引物進(jìn)行標(biāo)記，淘汰掉無法擴(kuò)增以及無多態(tài)性的引物，最終選出相對(duì)較理想的12對(duì)多態(tài)性較豐富的微衛(wèi)星引物（表1）。每對(duì)引物的上游 5′ 端分別用熒光染料FAM（藍(lán)色）、HEX（綠色）、TAMRA（黃色）進(jìn)行標(biāo)記，獲得的熒光標(biāo)記引物避光保存。按照微衛(wèi)星引物的堿基長度進(jìn)行組合，為了區(qū)分得精確一些，組合的引物長度至少相差20 bp，獲得的5個(gè)熒光標(biāo)記微衛(wèi)星引物組合信息見表1。

1.2.6熒光PCR產(chǎn)物STR分型PCR熒光產(chǎn)物送至生工（上海）生物工程有限公司進(jìn)行STR分型，使用ABI-3730XL DNA Analyzer全自動(dòng)測(cè)序儀檢測(cè)。上樣的總體積為13 μL， 其中的上樣液Hi-Di Formamide 10 μL，GS-500 Size Standard 0.5 μL，另外的3 μL為混合PCR產(chǎn)物。將Hi-Di Formamide 和GS-500 Size Standard混合均勻后與等量的同一個(gè)體的PCR產(chǎn)物進(jìn)行混合，然后進(jìn)行個(gè)體編號(hào)，依次加樣到96孔板，接著變性和檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)束后，使用GeneMapper 4.0軟件自動(dòng)生成獨(dú)立的圖譜文件，讀取出片段長度、峰值和峰面積，判斷純合子和雜合子（單峰為純合子，雙峰為雜合子），最后導(dǎo)出Excel數(shù)據(jù)表格。

1.3群體內(nèi)遺傳多樣性分析

1.3.1等位基因頻率

Pi=（2nii+nij1+nij2+…+nijn）/（2N）。

式中，Pi為第i個(gè)等位基因頻率，nii為第i個(gè)等位基因純合個(gè)數(shù)，jn為與i共顯的第n個(gè)等位基因，nijn為含i與jn共顯的等位基因個(gè)體數(shù)，N為群體中個(gè)體數(shù)。

1.3.2雜合度

He=1-∑ki=1Pi2。

式中：k為等位基因數(shù)，Pi為第i個(gè)等位基因頻率。

1.3.3多態(tài)信息含量

PIC=1-∑ki-1Pi2-∑k-ti-1∑kj=i+12Pi2Pj2=2∑k-ji=1∑kj=i+1PiPj（1-PiPj），

式中：k為等位基因數(shù)，Pi為第i個(gè)等位基因頻率，Pj為第j個(gè)等位基因頻率。

1.3.4群體內(nèi)近交系數(shù)

Fis=（Hs-Ho）/Hs。

式中：Ho為觀察雜合度，Hs為平均期望雜合度。

1.6.5統(tǒng)計(jì)分析利用Microsatellite-Toolkit軟件根據(jù)GeneMapper 4.0軟件導(dǎo)出的Excel表格來計(jì)算等位基因頻率與期望雜合度，根據(jù)Botestein等的公式[9]設(shè)計(jì)、計(jì)算群體的多態(tài)信息含量，再根據(jù)FSTAT程序[10]計(jì)算群體內(nèi)近交系數(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1中華蜜蜂基因組DNA提取結(jié)果

將提取的基因組DNA經(jīng)TE過夜溶解后，用DanoDrop-1000濃度檢測(cè)儀測(cè)定其吸光曲線與濃度。由圖1可見，曲線平滑單峰，D260 nm/D280 nm介于1.8～20之間，滿足微衛(wèi)星位點(diǎn)序列擴(kuò)增的要求。

2.2熒光PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)分型結(jié)果

圖2-A中個(gè)體G位點(diǎn)核心序列相差7 bp，表現(xiàn)為雙峰，為雜合子，基因型為133/140。圖2-B圖中個(gè)體為單峰，純合子，基因型為142。均無雜峰污染，擴(kuò)增效果良好。

2.3保種場(chǎng)群體與原產(chǎn)地野生群體優(yōu)勢(shì)等位基因的比較

2個(gè)中蜂群體優(yōu)勢(shì)等位基因及其頻率見表2。由表2可見，利用配對(duì)試驗(yàn)均數(shù)差異雙尾t檢驗(yàn)對(duì)2個(gè)群體優(yōu)勢(shì)等位基因頻率進(jìn)行處理，結(jié)果P=0.44>0.05，即2個(gè)群體在這12個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記檢測(cè)出的優(yōu)勢(shì)等位基因上的差異不顯著。

2.4基因庫保種群體與保種場(chǎng)He、PIC、Fis

由表3可見，保種場(chǎng)的平均He為0.530 9，略高于原產(chǎn)地野生群（0.473 5）、對(duì)2個(gè)群體的He進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，2個(gè)群體間無顯著差異（P=0.122）。保種場(chǎng)群體PIC、Fis 分別為0.530 9、0.407 2，均高于原產(chǎn)地野生群（0.422 5、0.123 8），t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，保種場(chǎng)群體和野生群體之間差異顯著（P值分別為0.047、0.019）。

3討論

當(dāng)前保種方法有活體保種、冷凍保種和生物技術(shù)保種3種方法，活體保種包括原產(chǎn)地保種和異地保種2種方式，活體保種是目前中華蜜蜂保種的唯一方式。本研究對(duì)皖南中蜂保種場(chǎng)和原產(chǎn)地野生群進(jìn)行分析研究，旨在為今后中華蜜蜂的保種工作提供參考依據(jù)。

群體中的優(yōu)勢(shì)等位基因是物種中最原始、最保守的等位基因，其余等位基因均是由該等位基因突變形成的，因此微衛(wèi)星的多態(tài)性可以反映物種的進(jìn)化史[11]。本研究中保種場(chǎng)和原產(chǎn)地野生群之間優(yōu)勢(shì)等位基因頻率存在差異，但是差異不顯著（P=0.440>0.05），表明保種場(chǎng)保種方式有效地保存了皖南中蜂的種質(zhì)特征。期望雜合度是衡量遺傳變異程度的最佳參數(shù)；多態(tài)信息含量表示微衛(wèi)星DNA變異程度的高低，反映群體內(nèi)個(gè)體遺傳變異的程度，數(shù)值越高表明變異程度越高。本研究中保種場(chǎng)He、PIC均高于原產(chǎn)地野生群，表明保種場(chǎng)群體的遺傳多樣性得到了很好的保存。

本研究對(duì)皖南中蜂保種場(chǎng)和原產(chǎn)地野生群進(jìn)行遺傳多樣性檢測(cè)分析。結(jié)果表明，皖南中蜂保種場(chǎng)和原產(chǎn)地野生群之間的Pi、He均差異不顯著，PIC顯著增加，F(xiàn)is顯著上升。其中，保種場(chǎng)群體的He略高于原產(chǎn)地，PIC顯著高于原產(chǎn)地；表明基因庫通過利用群體內(nèi)隨機(jī)交配和家系間隨機(jī)交配高效保持了保種群體的多樣性。出眾的飛翔能力使得蜂王在野生狀態(tài)獨(dú)特的自然環(huán)境中可以和其他起源的雄蜂發(fā)生基因交流，所以Fis很低；但是保種場(chǎng)群體有限，蜂王雄蜂的交配又難以控制，最終導(dǎo)致Fis顯著升高；這提醒我們?cè)谝院蟮谋７N工作中應(yīng)該擴(kuò)大群體規(guī)模，采用人工授精技術(shù)，準(zhǔn)確記錄系譜資料，并且根據(jù)群體的具體情況適當(dāng)引入雄蜂血統(tǒng)，避免近交對(duì)保種效果的不利影響，降低Fis，有效避免近交衰退。

綜上所述，本研究利用篩選的12對(duì)微衛(wèi)星DNA標(biāo)記分析皖南中蜂保種群和原產(chǎn)地群體的遺傳多樣性，對(duì)皖南中蜂保種效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，皖南中蜂遺傳多樣性豐富，具有很高的保種價(jià)值；同時(shí)也表明對(duì)地方中蜂品種進(jìn)行小群保種是可行的，為更好地評(píng)價(jià)、保護(hù)和利用我國的中蜂資源提供一定的科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]余林生，吳承武，汪明平，等. 皖南中蜂形態(tài)特征與地方品種優(yōu)勢(shì)種的篩選[J]. 中國蜂業(yè)，2008，59（10）：46-47.

[2]張大利. 中蜂保種場(chǎng)保種模式初探[J]. 蜜蜂雜志，2014，34（7）：25-26.

[3]Crooijmans R P，Groen A F，Van Kampen A J，et al. Microsatellite polymorphism in commercial broiler and layer lines estimated using pooled blood samples[J]. Poultry Science，1996，75（7）：904-909.

[4]Romanov M N，Weigend S. Genetic diversity in chicken populations based on microsatellite markers[C]. Proceedings of the Conference“From Jay Lush to Genomics：Vidions for Animal Breeding and Genetics”. Ames，Iowa，USA，1999：17.

[5]徐新建，周姝婧，朱翔杰，等. 海南島中華蜜蜂遺傳多樣性的微衛(wèi)

星DNA分析[J]. 昆蟲學(xué)報(bào)，2013，56（5）：554-560.

[6]徐新建，周姝婧，朱翔杰，等. 黃土高原中華蜜蜂遺傳多樣性的微衛(wèi)星DNA分析[J]. 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2013，42（6）：638-642.

[7]余林生，解文飛，巫厚長，等. 尼日利亞非洲蜂和安徽意大利蜜蜂及其雜交二代形態(tài)特征與微衛(wèi)星DNA遺傳多樣性[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào)，2012，32（11）：3555-3564.

[8]吉挺. 中國東方蜜蜂資源遺傳多樣性分析[D]. 揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué)，2009：35-48.

[9]殷玲. 東方蜜蜂抗螨相關(guān)基因的篩選及初步驗(yàn)證[D]. 揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué)，2013：31-32.

[10]Botstein D，White R L，Skolnick M，et al. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms[J]. American Journal of Human Genetics，1980，32（3）：314-331.

[11]Goudt J. FSTAT version 2.9.3.2[M]. Switzerland Lausanne：Department of Ecology and Evolution，2002.

[12]張揚(yáng)，黃正洋，陳陽，等. 采用微衛(wèi)星DNA標(biāo)記分析巢湖鴨異地小群保種效果[J]. 中國畜牧雜志，2012，48（11）：7-11.羅岸. 煙草合子時(shí)期特異表達(dá)基因的克隆與分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（5）：65-68.