小鼠動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展不同階段巨噬細(xì)胞表型變化研究*

西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科(西安710061)　龔　敏　卓小禎　馬愛群

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小鼠動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展不同階段巨噬細(xì)胞表型變化研究*

西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科(西安710061)龔敏△卓小禎馬愛群▲

摘要目的：探討動(dòng)脈粥樣硬化的形成(脂質(zhì)條紋)和發(fā)展(進(jìn)展的復(fù)合斑塊)不同階段巨噬細(xì)胞不同表型(Phenotype)的變化及表達(dá)。方法：將SD小鼠20只喂以高脂飲食，每隔2周分別處死10只，取全部主動(dòng)脈觀察斑塊的組織形態(tài)學(xué)變化和斑塊的穩(wěn)定性，以了解動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展過程，此外用免疫組化法(Immunochemistry)重點(diǎn)觀察斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞的分型情況。 結(jié)果：①隨著動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展，斑塊面積明顯增加。②CD4+隨著動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展明顯增加；而CD8+無明顯變化；③巨噬細(xì)胞M1表型在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展明顯增加，M2表型在不同階段變化不明顯。結(jié)論：M1/M2比例失衡，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展相關(guān)。

主題詞動(dòng)脈硬化/病理生理學(xué)動(dòng)脈硬化/組織學(xué)巨噬細(xì)胞表型實(shí)驗(yàn)，動(dòng)物小鼠

動(dòng)脈粥樣硬化是慢性炎癥過程， 巨噬細(xì)胞在斑塊內(nèi)的堆積是其關(guān)鍵步驟。巨噬細(xì)胞為多向性細(xì)胞，替代激活(M1)和經(jīng)典激活(M2)的巨噬細(xì)胞決定炎癥進(jìn)展。AS的轉(zhuǎn)歸不僅取決于巨噬細(xì)胞的數(shù)量更重要的是巨噬細(xì)胞的活性狀態(tài)，因此調(diào)控M1/M2將對(duì)AS斑塊進(jìn)展和穩(wěn)定性產(chǎn)生重要影響[1]。本研究觀察動(dòng)脈粥樣硬化的形成(脂質(zhì)條紋)和發(fā)展(進(jìn)展的復(fù)合斑塊)不同階段，巨噬細(xì)胞不同表型(Phenotype)的變化及表達(dá)。

材料與方法

1動(dòng)物與試劑實(shí)驗(yàn)用SD小鼠20只購自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。喂以高脂飲食，每隔2周分別處死10只，取全部主動(dòng)脈觀察斑塊的組織形態(tài)學(xué)變化和斑塊的穩(wěn)定性，以了解動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展過程，此外用免疫組化法(Immunochemistry)重點(diǎn)觀察斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞的分型情況。

2研究方法① 病變血管動(dòng)脈粥樣斑塊定量分析：取主動(dòng)脈升部、弓部及胸主動(dòng)脈縱形切開，1%福爾馬林固定，油紅O染色，2.5倍光鏡下觀察照像，圖像掃描計(jì)算血管損害面積與血管總面積之比；② 粥樣斑塊穩(wěn)定性分析:天狼星紅(Sirius red)染色測(cè)定膠原蛋白表達(dá),免疫組化染色檢測(cè)CD4+和CD8+T細(xì)胞陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)；③ 動(dòng)脈粥樣硬斑塊不同發(fā)展階段中的巨噬細(xì)胞表型(Phenotype)變化：免疫組化法以CD68(標(biāo)記所有的組織巨噬細(xì)胞)，CD86(標(biāo)記M1)，Detectin(標(biāo)記M2)為細(xì)胞標(biāo)志物標(biāo)記不同類型的組織巨噬細(xì)胞，CD68+CD86+細(xì)胞則為促進(jìn)炎癥發(fā)展的巨噬細(xì)胞(Pro-inflammatory macrophages，M1)，而CD68+detectin+細(xì)胞為促修復(fù)的旁路激活的巨噬細(xì)胞(Alternatively activated macrophages, M2)。

結(jié)果

1兩組動(dòng)脈斑塊面積變化兩周組陽性區(qū)域出現(xiàn)脂質(zhì)條紋及少量脂質(zhì)斑塊，斑塊面積為(10.10±1.57)%，4周組斑塊面積為(19.08±2.35)%，4周組較兩周組動(dòng)脈斑塊面積明顯增加(P<0.05)。

2動(dòng)脈粥樣硬化不同階段炎性細(xì)胞的變化見表1。4周組CD4+較兩周組明顯增加(P<0.05)；4周組CD8+較兩周組無明顯變化(P>0.05)；但4周組與兩周組之間CD4+/CD8+比值明顯增加(P<0.05)。

表1　動(dòng)脈粥樣硬化不同階段炎性細(xì)胞的變化±s)

注：兩組相比，P<0.05

3斑塊不同發(fā)展階段巨噬細(xì)胞表型變化見表2。CD68在兩組之間無明顯變化(P>0.05)； 4周組CD68+CD86+為(7.06±1.77)% ， 較兩周組明顯增加(P<0.05)；4周組CD68+detectin+為(19.51 ±1.15)%，較兩周組明顯減少(P<0.05)。

表2　斑塊不同發(fā)展階段巨噬細(xì)胞表型變化±s)

注：兩組相比，P<0.05

討論

動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis, AS)是動(dòng)脈壁的慢性炎癥過程，巨噬細(xì)胞在斑塊內(nèi)的堆積，發(fā)揮促炎效應(yīng)是其關(guān)鍵步驟。然而巨噬細(xì)胞是一種多向性細(xì)胞，不同活性的巨噬細(xì)胞對(duì)炎癥損傷具有不同的作用，替代激活的巨噬細(xì)胞(Alternatively activated macrophages, M2reparative macrophages)促進(jìn)炎癥損傷的修復(fù)，而經(jīng)典激活的巨噬細(xì)胞(Classically activated macrophages, M1destructive macrophages)則加重炎癥損傷[1]。在炎癥模型中，損傷性和修復(fù)性的巨噬細(xì)胞的比例總處于動(dòng)態(tài)平衡，而疾病的轉(zhuǎn)歸不僅取決于巨噬細(xì)胞的數(shù)量更重要的是巨噬細(xì)胞的活性狀態(tài)[2,3]。

新近發(fā)現(xiàn)：肥胖小鼠脂肪組織中的巨噬細(xì)胞主要是M1細(xì)胞，表現(xiàn)為促炎活性，介導(dǎo)胰島素抵抗和代謝綜合征；而體瘦小鼠脂肪組織中的巨噬細(xì)胞主要是M2細(xì)胞，表現(xiàn)為抗炎活性，抑制糖耐量減低[3]。既往研究發(fā)現(xiàn)在人頸動(dòng)脈粥樣斑塊存在著M1/M2比例失衡，并與斑塊的穩(wěn)定性呈強(qiáng)相關(guān)，主要表現(xiàn)為M1活性過強(qiáng)，而M2活性低下[4]。

巨噬細(xì)胞是與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的炎癥細(xì)胞。早在1815年發(fā)現(xiàn)：AS病變部位存在巨噬細(xì)胞。1979年ERRITY證實(shí)：在豬的AS斑塊中存在大量巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞通過黏附浸潤(rùn)血管內(nèi)皮細(xì)胞并形成泡沫細(xì)胞從而促進(jìn)AS的發(fā)展。巨噬細(xì)胞被認(rèn)為是AS發(fā)生和發(fā)展的“關(guān)鍵動(dòng)力”[5]。在體內(nèi)外不同的局部微環(huán)境影響下巨噬細(xì)胞可分化為M1型(經(jīng)典活化型)或M2型(替代活化型)巨噬細(xì)胞。M1型和M2型巨噬細(xì)胞均存在于AS斑塊內(nèi),但發(fā)揮的作用卻不同。在LPS及INF-r的誘導(dǎo)下巨噬細(xì)胞可分化為M1型,同時(shí)分泌大量的LI-12、IL-23、IL-6及INF-a等炎性細(xì)胞因子,參與炎癥反應(yīng)、病原菌的清除以及活性氧的表達(dá)，促進(jìn)AS的發(fā)展。在IL-4、IL-13 、IL-1或者維生素D3的誘導(dǎo)下巨噬細(xì)胞可分化為M2,IL-10、精氨酸酶、清道夫受體、甘露糖受體的分泌及表達(dá)增加，抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)組織損傷修復(fù)[6]。

根據(jù)是否表達(dá)CD4或者CD8分子將淋巴細(xì)胞分為CD4+和CD8+T細(xì)胞。兩種細(xì)胞功能不同，CD4+細(xì)胞識(shí)別13～15個(gè)殘基組成的外源性抗原肽，受自身MHCII類分子的限制,活化后形成的效應(yīng)T細(xì)胞可分泌不同的細(xì)胞因子,在幫助免疫反應(yīng)中其他免疫細(xì)胞發(fā)揮效應(yīng)起到重要作用。CD8+T細(xì)胞識(shí)別8～12個(gè)殘基組成的內(nèi)源性抗原肽，受自身MHCI類分子限制、活化后，分化為Tc細(xì)胞,具有細(xì)胞毒作用,可特異性殺傷受感染細(xì)胞或者功能失調(diào)細(xì)胞,如瘤細(xì)胞等[7]。Chan[8]在研究中證實(shí)：CD4+T細(xì)胞在巨噬細(xì)胞亞型調(diào)節(jié)過程中起主要作用，并且相對(duì)于巨噬細(xì)胞本身成分，淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞因子環(huán)境在誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2亞型轉(zhuǎn)化過程中起到的作用更為關(guān)鍵。無論是在炎癥的初始階段還是維持階段，CD8+T細(xì)胞均可降低M1特征性分子如IL-6、TNF-a的表達(dá)，但對(duì)M2指標(biāo)均無影響。

本研究發(fā)現(xiàn)：動(dòng)脈粥樣硬化的形成(脂質(zhì)條紋)和發(fā)展(進(jìn)展的復(fù)合斑塊)不同階段，巨噬細(xì)胞不同表型(Phenotype)的變化及表達(dá)也不相同。在復(fù)合斑塊期CD4+較脂質(zhì)條紋期明顯增加；而CD8+變化則不明顯。在復(fù)合斑塊期巨噬細(xì)胞M1表型較脂質(zhì)條紋期明顯增強(qiáng)；而M2表型則略減少。M1/M2比例失衡，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展相關(guān),這和既往研究結(jié)論相似。因此，調(diào)節(jié)或控制巨噬細(xì)胞的活性狀態(tài)將對(duì)AS斑塊進(jìn)展、尤其是斑塊的穩(wěn)定性產(chǎn)生重要影響，并有可能成為一種新的潛在治療靶點(diǎn)。

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(收稿：2015-12-28)

通訊作者▲

【中圖分類號(hào)】R543.5

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.05.001

·論著·基礎(chǔ)研究·

*陜西省科技廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014JM4151)

△西安市中心醫(yī)院心內(nèi)科