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    根系分泌物對(duì)土壤中有機(jī)氯農(nóng)藥降解的強(qiáng)化效應(yīng)及其作用機(jī)制

    2016-07-22 06:27:40潘聲旺黃方玉
    關(guān)鍵詞:黑麥草分析法

    潘聲旺, 劉 燦, 黃方玉

    (成都大學(xué) 建筑與土木工程學(xué)院, 四川 成都 610106)

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    根系分泌物對(duì)土壤中有機(jī)氯農(nóng)藥降解的強(qiáng)化效應(yīng)及其作用機(jī)制

    潘聲旺, 劉燦, 黃方玉

    (成都大學(xué) 建筑與土木工程學(xué)院, 四川 成都610106)

    摘要:借助盆栽模擬實(shí)驗(yàn),研究了黑麥草根系分泌物對(duì)有機(jī)氯農(nóng)藥的降解效應(yīng)及其對(duì)土壤微生物群落特征的影響.結(jié)果顯示,添加根系分泌物促進(jìn)了污染土壤(TR2)中OCPs的去除:修復(fù)平衡15 d后,TR2組土壤中OCPs去除率高達(dá)77.57%,比對(duì)照組(CK)高出33.49%,比微生物活性被抑制的TR1組高出58.16%;相同污染水平下,TR2土樣中微生物生物量碳量也明顯高于CK、TR1組.實(shí)驗(yàn)期間,細(xì)菌的磷脂脂肪酸在OCPs污染土壤中占主導(dǎo)地位,其次為真菌,其在土壤微生物群落中變化趨勢(shì)與OCPs降解變化一致,說明OCPs降解過程中,根系分泌物主要通過影響細(xì)菌、真菌的種群數(shù)量及其群落結(jié)構(gòu),進(jìn)而影響OCPs降解.

    關(guān)鍵詞:有機(jī)氯農(nóng)藥;黑麥草;根系分泌物;根際微生物;磷酸脂肪酸(PLFA)分析法

    0引言

    有機(jī)氯農(nóng)藥(Organochlorine pesticides,OCPs)是高殘留、生物富集性強(qiáng)的農(nóng)藥,性質(zhì)穩(wěn)定、可溶性差,容易吸附在土壤中,并通過食物鏈對(duì)生態(tài)環(huán)境和人體健康產(chǎn)生潛在威脅[1-2].我國(guó)雖從1983年開始禁止使用OCPs,但目前仍可在多種利用類型土壤中檢出OCPs殘留[3-4].隨著全球范圍內(nèi)對(duì)環(huán)境保護(hù)和食品安全的日益重視,如何安全、有效地去除環(huán)境中的OCPs殘留已成為環(huán)境毒理學(xué)研究的熱點(diǎn).降解有機(jī)氯的方法有很多種,如化學(xué)法、物理法和植物—微生物聯(lián)合修復(fù),其中物理法和化學(xué)法等都普遍存在著處理成本高,易造成二次污染,去除效果差等缺點(diǎn),而植物—微生物聯(lián)合修復(fù)則主要利用微生物對(duì)OCPs的特異性降解及其根際效應(yīng)進(jìn)行降解,該方法操作簡(jiǎn)便、環(huán)境友好、修復(fù)效果明顯,已成為治理殘留農(nóng)藥的重要手段.本研究擬以成都市區(qū)蔬菜地土壤中OCPs復(fù)合污染狀況[5]為參照,以研究較多的黑麥草為實(shí)驗(yàn)材料,系統(tǒng)研究受OCPs復(fù)合污染狀態(tài)下,黑麥草的根系分泌物對(duì)根際微生物降解效能的影響,探討其影響機(jī)制,以期為植物修復(fù)技術(shù)的研究與實(shí)踐提供參考.

    1材料與方法

    1.1實(shí)驗(yàn)材料

    1.1.1土壤.

    供試土壤為中性紫色土,采自成都大學(xué)十陵校區(qū)旱地表層,取樣深度為5~15 cm.新鮮土樣去除石子和植物殘?bào)w后,分為2部分:一部分直接過9 mm篩后混合均勻,供盆栽培養(yǎng)植物用;另一部分風(fēng)干后研磨過2.5 mm篩,用于土壤基本性質(zhì)測(cè)定.經(jīng)檢測(cè),土樣的理化性質(zhì)如下:pH值為7.19,有機(jī)質(zhì)含量為2.14×104mg·kg-1,陽離子交換量為20.43 cmol·kg-1,速效N、P、K分別為31.62、24.74、94.81 mg·kg-1;砂粒、粉粒和黏粒的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為71.27%、9.59%和19.14%.土樣風(fēng)干后過2 mm篩,備用.

    1.1.2植物.

    選取修復(fù)效果較好的黑麥草為供試植物,其幼苗采自成都大學(xué)無OCPs污染的草坪及其周邊地區(qū),選擇株體大小相當(dāng)?shù)闹仓?,清水去泥?%H2O2除菌后,用蒸餾水清洗其根部后作移栽、備用.

    1.1.3儀器.

    實(shí)驗(yàn)所用的儀器包括:Agilent1100型氣相色譜儀(Agilent Technologies Inc.,USA); 電子捕獲檢測(cè)器(GC-μECD);Agilent1100系列自動(dòng)進(jìn)樣器;TOC-500型自動(dòng)分析儀(Hitachi Ltd.,Japan);GC-MS(G1530N/G3172A,Agilent Technologies Inc.,USA);DHP-9080B型電熱恒溫培養(yǎng)箱(江蘇省金壇市友聯(lián)儀器研究所)等.

    1.1.4試劑.

    OCPs混標(biāo):HCHs (α-HCH、β-HCH、γ-HCH、δ-HCH)、DDTs(p,p′-DDT、o,p′-DDT、p,p′-DDE、o,p′-DDE、p,p′-DDD)、六氯苯(HCB)、艾氏劑、狄氏劑、異狄氏劑、α-氯丹、γ-氯丹、硫丹I、硫丹II、硫丹硫酸鹽、異狄氏劑醛、異狄氏劑酮、七氯、環(huán)氧七氯、甲氧滴滴滴,均為色譜純,購(gòu)自Supelco公司;無水硫酸鈉、丙酮、正己烷等為分析純,購(gòu)自成都市科農(nóng)化工試劑廠.

    1.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

    1.2.1收集根系分泌物.

    采用土培法進(jìn)行黑麥草根系培養(yǎng),40 d后,水培法對(duì)黑麥草植株進(jìn)行OCPs脅迫處理、收集根系分泌物[6].將根系分泌物慢速過濾(0.45 μm微孔濾膜)后,定容至1.5 L,低溫(-20 ℃)保存,備用.

    1.2.2配置受OCPs污染土樣.

    參照成都市區(qū)蔬菜地土壤中OCPs的污染特征[7],按一定比例稱取適量的OCPs組分溶于丙酮溶液中,均勻?yàn)⒃谕寥辣韺?,待丙酮揮發(fā)后,多次攪拌、混勻后,室溫下平衡7 d.GC/MS-MS法測(cè)定土壤中OCPs的初始濃度為343.61 mg·kg-1(C5),其中,∑DDT、∑HCH、HCB、艾氏劑、狄氏劑、狄氏劑、毒殺芬、滅蟻靈、硫丹Ⅰ、環(huán)氧七氯、γ~氯丹的質(zhì)量濃度分別為299.52、14.49、8.13、1.05、1.89、3.21、1.98、1.65、3.42和8.27 mg·kg-1;將已制得的標(biāo)準(zhǔn)土樣(C5)用未污染土樣多次稀釋、攪拌,制得土樣C1~C4,室溫下平衡7 d后測(cè)得其濃度分別為:66.67 mg·kg-1(C1)、138.47 mg·kg-1(C2)、205614 mg·kg-1(C3)、282.07 mg·kg-1(C4).

    1.2.3土壤模擬修復(fù)實(shí)驗(yàn).

    土壤模擬修復(fù)采用3個(gè)處理、5個(gè)重復(fù).處理1(對(duì)照組,CK),OCPs污染土樣;處理2(TR1),加入0.05% NaN3(抑制微生物活性[9])的OCPs污染土樣;處理3(TR2),加入黑麥草根系分泌物的OCPs污染土樣.室溫下平衡15 d后,檢測(cè)土壤中OCPs殘留濃度、微生物生物量碳及其磷酸脂肪酸組分.

    1.3檢測(cè)方法

    1.3.1OCPs檢測(cè).

    土樣前處理參照GB/T14550-1993相關(guān)要求.

    1)GC-ECD分析[7].DM-5層析柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm),程序升溫:初溫90 ℃,保持1 min;40 ℃·min-1升至170 ℃,23 ℃·min-1升至230 ℃保持17 min;40 ℃·min-1升至280 ℃保留5 min.進(jìn)樣口溫度260 ℃,檢測(cè)器溫度300 ℃;高純氮?dú)鉃檩d氣,流速為1 mL·min-1;尾吹為60 mL·min-1;不分流進(jìn)樣,進(jìn)樣量1 μL.

    2)GC/MS-MS分析.島津氣相色譜(GC2010,Shimadzu Corp.,Japan),離子阱質(zhì)譜,色譜—質(zhì)譜接口溫度250 ℃,離子源溫度230 ℃;離子化方式,EI;電子能量:70 eV;溶劑延遲,6 min;全掃描質(zhì)量范圍,40~500 AMU.

    按照上述方法,OCPs回收率為90%~120%,檢出限為0.07~0.15 μg·kg-1.

    1.3.2土壤微生物群落特征分析.

    土壤微生物生物量碳用氯仿熏蒸,0.5 mol·L-1K2SO4提取,TOC-500自動(dòng)分析儀測(cè)定.土壤微生物群落結(jié)構(gòu)采用磷酸脂肪酸分析法(PLFA)分析[8],測(cè)定依據(jù):不同微生物(細(xì)菌、真菌、放線菌等)具有特征的磷酸脂肪酸譜,根據(jù)質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)圖PLFA組分的定性分析,以PLFA19∶0做內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行定量分析.特定脂肪酸的排列為:碳的數(shù)目、雙鍵的數(shù)目、跟隨雙鍵的位置(甲基端起).c、t分別表示順式和反式脂肪酸,a和i分別指反式支鏈脂肪酸及異式支鏈脂肪酸,br表示未知結(jié)構(gòu)的支鏈脂肪酸,cy表示環(huán)狀脂肪酸,10Me表示第10個(gè)碳原子的甲基(從羥基端起).具體涉及的群落結(jié)構(gòu)指標(biāo)和磷酸脂肪酸譜系如表1.

    表1 表征微生物群落結(jié)構(gòu)的磷酸脂肪酸譜系表

    1.4數(shù)據(jù)處理

    實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2007基礎(chǔ)處理后,用SPSS 11.5軟件LSD法分析不同處理間差異顯著性.其中,OCPs降解率(R)計(jì)算公式為,

    式中,C0表示土壤中OCPs初始濃度,Ct表示土壤中殘留濃度.

    2結(jié)果與分析

    2.1不同處理土壤中OCPs的降解特征

    不同處理土壤中OCPs的降解特征如圖1所示.可以看出,室溫下平衡15 d后,土壤中OCPs的殘留濃度隨著初始污染水平的上升而增加.試驗(yàn)期間,添加根系分泌物(30 mL)污染土樣(TR2)中OCPs的平均降解率為77.57%,微生物活性被抑制的TR1處理中OCPs的平均降解率為19.41%;而對(duì)照土壤(CK)中OCPs降解率為44.08%,不同處理間差異明顯(p<0.05)(p<0.05).相同污染濃度下,TR2中OCPs的去除率明顯高于其他處理,表現(xiàn)為TR2>CK>TR1,差異明顯(p<0.05) (圖1(a);根系分泌物的添加量不同,污染土樣(TR2)中OCPs的降解率也不一樣,且隨著添加量的增加而增大,添加量為30 mL時(shí)增幅最大(圖1(b)).圖中不同字母代表同一污染水平上P<0.05水平差異顯著,圖柱線I為誤差線.

    圖1不同處理?xiàng)l件下土壤中OCPs的降解特征

    2.2不同處理土壤中微生物生物量碳的變化

    添加根系分泌物對(duì)土壤微生物生物量碳的變化情況見圖2.可以看出,相同添加水平(30 mL)下,微生物生物量碳最多的為TR2,CK次之、TR1最少,三者差異顯著(p<0.05),說明根系分泌物的存在促進(jìn)了降解菌的生長(zhǎng)(圖2(a));相同污染水平(C3)下,根系分泌物添加量越多,該土壤—植物系統(tǒng)(TR2)中微生物生物量碳就越多,說明根系分泌物的存在激發(fā)了微生物的生長(zhǎng)活性(圖2(b)).圖中不同字母代表同一污染水平上P<0.05水平差異顯著,圖柱線I為誤差線.

    圖2不同處理土壤中微生物生物量碳的變化

    2.3根系分泌物添加量對(duì)土壤微生物群落特征影響

    2.3.1對(duì)微生物群落磷脂脂肪酸含量的影響.

    根系分泌物添加量對(duì)受OCPs污染土壤(C3)中不同類群土壤微生物磷脂脂肪酸含量的影響效應(yīng)見圖3.可以看出,相同添加量下,OCPs污染土壤中的磷脂脂肪酸量以細(xì)菌最多,真菌、放線菌次之,叢枝菌根最少.說明添加根系分泌物的OCPs污染土壤中,土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成以細(xì)菌為主,其次為真菌和放線菌,最后是叢枝菌根.隨著根系分泌物添加量的增加,受OCPs污染土壤中細(xì)菌的種群數(shù)量也逐漸增加,但添加在30~50 mL間時(shí),其增加幅度并不顯著(P>0.05);真菌的種群數(shù)量的變化趨勢(shì)較細(xì)菌更明顯,即隨著根系分泌物添加量的增加,真菌的種群數(shù)量逐漸增加,不同添加量間差異顯著(P<0.05).相比之下, 叢枝菌根真菌種群數(shù)量的變化趨勢(shì)較為緩和,隨著根系分泌物添加濃度的增加,污染土壤中叢枝菌根真菌的數(shù)量也逐漸增加,且都明顯高于對(duì)照(P<0.05),但不同添加量間的種群數(shù)量無顯著差異(P>0.05).實(shí)驗(yàn)期間,放線菌種群數(shù)量的變化較為特殊,隨著根系分泌物添加量的增加,受OCPs污染土壤中放線菌的種群數(shù)量呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢(shì),在添加量為30 mL時(shí)出現(xiàn)峰值.造成上述變化的原因可能是,根系分泌物可作為滿足細(xì)菌生長(zhǎng)所需碳源、氮源,添加少量的根系分泌物能激發(fā)微生物的生長(zhǎng)活性;隨著根系分泌物的增加,分泌物中的有機(jī)酸可能會(huì)對(duì)部分中性或嗜堿性細(xì)菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用,不耐酸的放線菌的種群數(shù)量也會(huì)隨之減少,但有機(jī)酸對(duì)耐酸性的真菌、叢枝菌根的生長(zhǎng)影響不大.

    圖3 根系分泌物添加量對(duì)根際微生物磷脂脂肪酸含量的影響

    綜合OCPs污染土壤中土壤微生物群落隨根系分泌物添加濃度增加的變化可知,由于土壤中微生物群落以細(xì)菌、真菌為主,且二者的變化趨勢(shì)與OCPs降解變化特征一致,說明OCPs的降解以細(xì)菌、真菌為主,根系分泌物主要通過影響細(xì)菌、真菌的種群數(shù)量,進(jìn)而影響OCPs的降解特征.圖中不同字母代表同P<0.05水平差異顯著,圖柱線I為誤差線.

    2.3.2對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的影響.

    進(jìn)一步分析受OCPs污染土壤(C3)中微生物種群間的變化幅度(見圖4)時(shí)發(fā)現(xiàn),隨著根系分泌物添加量的增加,革蘭氏陰性菌與革蘭氏陽性菌的種群數(shù)量之比逐漸增加,除對(duì)照外,不同添加量土壤中革蘭氏陰性菌與革蘭氏陽性菌間的變化幅度無明顯差異(P>0.05).同時(shí),從真菌與細(xì)菌、叢枝菌根與細(xì)菌以及放線菌與細(xì)菌的種群數(shù)量之比來看,受OCPs污染土壤中細(xì)菌占絕對(duì)主導(dǎo)地位,而革蘭氏陰性菌又占相對(duì)優(yōu)勢(shì),其次為真菌和放線菌,最后是叢枝菌根.真菌與細(xì)菌的種群數(shù)量之比隨著根系分泌物添加濃度的增加而急劇增加,不同添加水平間差異顯著(P<0.05),說明真菌在植物修復(fù)受OCPs污染土壤過程中同樣發(fā)揮著重要作用.

    圖4 根系分泌物添加量對(duì)根際微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

    實(shí)驗(yàn)期間,叢枝菌根與細(xì)菌、放線菌與細(xì)菌的數(shù)量比隨著根系分泌物添加量的增加逐漸減小,添加量較低(0~30 mL)時(shí),對(duì)叢枝菌根與細(xì)菌之比影響較大(P<0.05),但對(duì)放線菌與細(xì)菌之比影響不顯著(P>0.05);添加量較高(30~50 mL)時(shí),對(duì)放線菌與細(xì)菌之比影響較大(P<0.05),但對(duì)叢枝菌根與細(xì)菌之比影響不顯著(P>0.05).說明改變微生物群落的組成結(jié)構(gòu),是根系分泌物影響OCPs降解特征的另一重要途徑,具體如圖4所示.圖4中不同字母代表P<0.05水平差異顯著,圖柱線I為誤差線.

    3討論

    植物的存在能加快土壤中持久性有機(jī)污染物的去除,根系分泌物營(yíng)造的根際環(huán)境則是污染物快速消解的重要因素[7,9].植物修復(fù)過程中,根系分泌物在改善土壤屬性、提高污染物生物可利用性、緩解環(huán)境脅迫等方面具有重要作用.一方面,根系分泌的某些胞外酶能夠直接參與污染物的降解過程;另一方面,分泌物中的可溶性糖、低分子量有機(jī)酸、氨基酸等物質(zhì),為根際微生物提供充足的營(yíng)養(yǎng),增加微生物數(shù)量、激發(fā)微生物活性,進(jìn)而加速污染物降解.同時(shí),根系分泌物還會(huì)直接影響污染物的固定和活化,進(jìn)而影響污染物在土壤—植物系統(tǒng)中的遷移轉(zhuǎn)化,促進(jìn)土壤中OCPs去除[10].本研究中,加入根系分泌物的TR2土樣經(jīng)15 d修復(fù)平衡后,其OCPs降解率(77.57%)明顯大于CK、TR1(P<0.05);相同污染水平下,TR2土樣中微生物生物量碳含量明顯大于CK1(P<0.05),說明根系分泌物的存在激發(fā)了土壤微生物的生長(zhǎng)活性,進(jìn)而影響了OCPs的降解變化特征.

    微生物能夠降解OCPs,與降解過程中所釋放的脫氯化氫酶、水解酶、脫氫酶、還原酶和雙加氧酶酶密切相關(guān).目前探明對(duì)OCPs有降解作用的微生物主要包括假單胞菌屬,如鞘氨醇單胞菌、檸檬酸桿菌屬,真菌類,如白腐菌、褐腐菌等,以及梭菌屬、牙孢桿菌屬、棒狀桿菌屬、微球菌屬、氫單胞菌屬等多種菌屬[11-13].本研究中,加入黑麥草根系分泌物的TR2土樣經(jīng)15 d修復(fù)平衡后,受OCPs污染土壤中細(xì)菌群落,尤其是革蘭氏陰性菌的磷脂脂肪酸量以最多,真菌、放線菌次之,叢枝菌根真菌最少.在不同處理的模擬修復(fù)試驗(yàn)中,細(xì)菌、真菌隨根系分泌物添加劑量的變化趨勢(shì)與OCPs降解變化特征相一致,說明OCPs的降解以細(xì)菌、真菌為主,根系分泌物主要通過影響受OCPs污染的土壤中細(xì)菌、真菌的種群數(shù)量及其群落結(jié)構(gòu),進(jìn)而影響OCPs的降解特征.

    4結(jié)論

    植物修復(fù)過程中,根系分泌物對(duì)根際微生物的降解效能具有促進(jìn)作用.在15 d的修復(fù)平衡實(shí)驗(yàn)中,添加根系分泌物污染土樣(TR2)中OCPs的平均降解率為77.57%,對(duì)照土壤中OCPs降解率為44.08%;而微生物活性被抑制的TR1處理中OCPs的平均降解率僅為19.41%,不同處理間差異明顯(P<0.05).受OCPs污染土壤中,細(xì)菌占主導(dǎo)地位,并以革蘭氏陰性菌占相對(duì)優(yōu)勢(shì),其次為真菌和放線菌,最后是叢枝菌根真菌.細(xì)菌、真菌隨根系分泌物添加劑量的變化趨勢(shì)與OCPs降解變化特征一致,表明OCPs的降解以細(xì)菌、真菌為主,根系分泌物主要通過影響細(xì)菌、真菌的種群數(shù)量及其群落結(jié)構(gòu),進(jìn)而影響OCPs的降解特征.

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    Effects of Ryegrass Root Exudates on Degradation of Organochlorine Pesticides in Soils and their Enhancing Mechanisms

    PANShengwang,LIUCan,HUANGFangyu

    (School of Architecture and Civil Engineering, Chengdu University, Chengdu 610106, China)

    Abstract:Pot experiments are carried out to investigate the degradation effects of ryegrass(Lolium perenne) root exudates on organochlorine pesticides(OCPs) and on soil microflora characteristics.The results show that ryegrass root exudates stimulated the elimination of OCPs in the polluted soil(TR2) 15 days after the redressed balance.The removal rate of OCPs in the soil(TR2) is the highest,at an average of 77.57%,33.49% higher than that of the control group(CK) and 58.16% higher than that of TR1.During the experiment,the phospholipid fatty acid dominates in the polluted OCPs soil and followed by fungi that have the same variation trend as the OCPs degradation.This indicates that during the degradation of OCPs,the root exudates mainly influence the degradation by disturbing the population quantity and community structure of bacteria and fungi.

    Key words:organochlorine pesticides(OCPs);ryegrass;root exudates;rhizosphere microorganism;phospholipid fatty acid analysis method

    文章編號(hào):1004-5422(2016)02-0196-05

    收稿日期:2016-05-02.

    基金項(xiàng)目:2015年國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)實(shí)驗(yàn)課題(201511079008)、 四川省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃(201411079026; 201511079008)資助項(xiàng)目.

    作者簡(jiǎn)介:潘聲旺(1973 — ), 男, 博士, 副教授, 從事環(huán)境生態(tài)與生態(tài)修復(fù)技術(shù)研究.

    中圖分類號(hào):X131.3;X172

    文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

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