水澇脅迫下歐李SOD和POD的變化

鄔曉勇， 李　潘， 張　敏， 孫雁霞， 茍小軍

(1.成都大學(xué) 藥食同源植物資源開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 四川 成都　610106；2.成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院， 四川 成都　610106)

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水澇脅迫下歐李SOD和POD的變化

鄔曉勇1,2， 李潘2， 張敏2， 孫雁霞2， 茍小軍1

(1.成都大學(xué) 藥食同源植物資源開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 四川 成都610106；2.成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院， 四川 成都610106)

摘要：通過盆栽實(shí)驗(yàn)法，測(cè)定水澇條件歐李SOD和POD酶的活性的關(guān)系，考察SOD、POD抗氧化酶系統(tǒng)在歐李抗?jié)成硌芯恐械淖饔?采用鄰苯三酚自氧化法對(duì)葉片中SOD的活性進(jìn)行測(cè)定；采用愈創(chuàng)木酚法對(duì)葉片中POD酶活性進(jìn)行測(cè)定.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，歐李在水澇脅迫下，植物體內(nèi)的SOD酶活性大量降低而POD酶適量地增加；一段時(shí)間后，SOD酶不降反增而POD酶活性降低；實(shí)驗(yàn)后期SOD酶和POD酶都同時(shí)呈現(xiàn)了下降趨勢(shì)，最后趨于穩(wěn)定.水澇雖會(huì)對(duì)歐李的生理狀態(tài)產(chǎn)生一定影響，但結(jié)果表明歐李在短期水澇脅迫下有較強(qiáng)的適應(yīng)能力.關(guān)鍵詞： 歐李；水澇；POD；SOD；酶活性

0引言

歐李為薔薇科櫻桃屬歐李樹種，是世界上最矮小的木本果樹，廣泛分布于我國的東北、華北、西北等地[1-2]，其鈣的含量居所有水果之首[3-4]，具有較為廣闊的開發(fā)利用前景[5].相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在嚴(yán)重水分脅迫下，植物體內(nèi)自由基大量產(chǎn)生，抗氧化功能明顯降低[6-7].超氧化物歧化酶(SOD)，能通過歧化反應(yīng)清除生物細(xì)胞中的超氧自由基(O2·-)生成H2O2和O2，H2O2可由過氧化氫酶(CAT)催化生成H2O和O2，從而減少自由基對(duì)有機(jī)體的毒害.目前，對(duì)歐李的研究主要集中在其栽培和礦質(zhì)元素含量方面，而對(duì)于在水澇逆境下的歐李植物葉片酶的活性研究少有報(bào)道.本研究對(duì)從北方引種到南方的歐李在水澇脅迫下其植物葉片內(nèi)的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)的活性進(jìn)行測(cè)定與分析，了解歐李在南方溫暖濕潤的氣候中的生長狀況，為歐李的進(jìn)一步開發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù).

1材料與方法

1.1材料

實(shí)驗(yàn)植物材料為2008年秋季從山西引種到成都的歐李，2014年3月份選長勢(shì)良好的移栽至花盆中，正常管理.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為8株長勢(shì)相同的歐李植物，隨機(jī)分為2組：處理組和對(duì)照組.處理組的4株歐李采用雙套盆法進(jìn)行水澇脅迫的處理，對(duì)照組的為正常條件下正常管理.進(jìn)行連續(xù)168 h的觀測(cè)和定時(shí)采樣測(cè)定.

1.2試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)試劑：0.2%愈創(chuàng)木酚、磷酸緩沖液、30%過氧化氫、考馬斯亮藍(lán)G-250、標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白、鄰苯三酚溶液、鹽酸溶液、Tris-HCI緩沖液、100 mmol·L-1二硫蘇糖醇(DTT)或5%抗壞血酸(維生素C)、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、石英砂等均為國產(chǎn)分析純.

實(shí)驗(yàn)儀器：722型分光光度計(jì)，核酸蛋白檢測(cè)儀(UV-2802PC)，高速冷凍離心機(jī)，秒表，F(xiàn)A2004B型電子天平，研缽，紫外可見分光光度計(jì)，恒溫水浴鍋，試管，移液管，CT15RT型高速冷凍離心機(jī)，離心管，移液槍等.

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1酶的提取.

SOD和POD酶的提取方法參照郝建軍的方法[8]稍有改動(dòng)：于每天上午10：30左右取樣2～3 g植物葉片(取樣部位為植物當(dāng)年生枝條中部葉片)；實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為單株小區(qū)，重復(fù)3次后取平均值；將所采葉片清洗稱重后切碎.

1)SOD提取.將切碎葉片置于加有3 mL濃度為0.05 mmmol/L的Tris-Hcl的預(yù)冷的研缽中，加入適量石英砂于冰浴環(huán)境下研磨成勻漿，以13 000 r/min，4 ℃離心15 min收集上清液即為SOD酶液， 取上清液用Tris-Hcl緩沖液定容至5 mL試管中，保存在冰箱中備用.

2)POD提取.將切碎葉片置于加有3 mL濃度為20 mmol/L的KH2PO4的預(yù)冷的研缽中，再加入適量石英砂于冰浴環(huán)境下研磨成勻漿，以10 000 r/min，4 ℃離心10 min收集上清液即為POD酶液，取上清液用磷酸緩沖液定容至5 mL試管中，保存在冰箱中備用.

1.3.2SOD和POD酶活性測(cè)定.

1)SOD酶活性的測(cè)定方法.

鄰苯三酚自氧化速率的測(cè)定[9]：取pH值為8.2的Tris-HCl-EDTA緩沖液4.5mL于10 mL比色管中，于25 ℃恒溫10 min，再加入25 ℃恒溫的45 mmol/L的鄰苯三酚溶液10 uL，混勻后迅速于1 cm石英比色杯319 nm波長測(cè)光密度值，每隔30 s測(cè)一次光密度值，共測(cè)4 min，求出鄰苯三酚的自氧化速率OD/min.同時(shí)，用10 mmol/L的鹽酸做空白試驗(yàn).

SOD活性測(cè)定[10]：取pH值為8．2的Tris-HCl-EDTA緩沖液4.5 mL于10 mL比色管中，25 ℃恒溫10 min，加入已恒溫至25 ℃的樣品溶液10 mL，迅速混勻，于325 nm波長測(cè)定密度值，30 s記錄一次數(shù)據(jù)，連續(xù)測(cè)4～6 min，求出光密度值變化速率OD/min.

式中，V1為反應(yīng)液總體積，mL；V2為測(cè)定樣品體積，mL；n為樣品稀釋液倍數(shù)；ODA為鄰苯三酚的自氧化速率；ODB為樣品光密度值變化速率.

2)POD酶活性的測(cè)定方法.

POD活性的測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定[11].取比色皿2只，一只中加入反應(yīng)混合液[100 mmol/L磷酸緩沖液(pH=6.0)50 mL，加入愈創(chuàng)木酚100 μL，加熱攪拌，直至愈創(chuàng)木酚溶解，待溶液冷卻后，加入30%過氧化氫200 μL，混合均勻保存于冰箱中]3 mL，KH2PO41 mL作為較零對(duì)照；另一只中加入反應(yīng)混合液3 mL，上述提取的酶液1 mL，于分光光度計(jì)470 nm波長下測(cè)量OD值，每隔30 s讀數(shù)一次，測(cè)試時(shí)間4～5 min.

定義：酶活力單位(Units)，以每分鐘轉(zhuǎn)化1 μmol底物定義為一個(gè)酶活單位(u).酶的比活力(Units/mg)，是酶制劑純度的指標(biāo)，對(duì)于同一種酶來說比活力越高，表明酶越純.

比活力=活力單位數(shù)(Units)/酶蛋白(mg).

式中，ΔA470為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化；W為植物鮮重，g；VT為提取酶液總體積，mL；Vs為測(cè)定時(shí)取用酶液體積，mL；t為反應(yīng)時(shí)間，min.

2結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線制定

利用文獻(xiàn)[12]的方法，本研究測(cè)定了牛血清蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1.

圖1牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

通過牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，得到了回歸方程，y=0.0485x+0.0105，其相關(guān)系數(shù)為，R2=0.9985，線性良好.表明可以利用回歸方程計(jì)算酶液中蛋白的含量.

2.2鄰苯三酚標(biāo)準(zhǔn)曲線制定

取4.5mL 50 mmol·L-1Tris-HCl(pH 8.2)緩沖液，4.2 mL蒸餾水，混勻后在25 ℃水浴保溫20 min，取出后立即加入在25 ℃預(yù)熱過的0.1 mmol·L-1鄰苯三酚0.3 mL(以10 mmol·L-1HCl配制，空白管用10 mmol·L-1HCl代替鄰苯三酚的HCl溶液)，總體積為9 mL，迅速搖勻倒入比色杯(光徑1 cm)在波長325 nm，25 ℃恒溫池中，每隔30 s測(cè)OD值一次.計(jì)算線性范圍內(nèi)每分鐘OD的增值，此即為鄰苯三酚的自氧化速率[13〗.結(jié)果見圖2.

圖2鄰苯三酚自氧化速率標(biāo)準(zhǔn)曲線

通過鄰苯三酚自氧化速率標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，得到了回歸方程，Y=0.0234X+0.1231，其相關(guān)系數(shù)為，R2=0.9993，線性良好.表明可以利用該回歸方程來計(jì)算SOD酶液的活性.

2.3SOD實(shí)驗(yàn)測(cè)定

2.3.1SOD酶活性測(cè)定結(jié)果.

利用“1.3.1”項(xiàng)下“1)”的方法測(cè)定SOD酶活性，測(cè)得水澇處理組和空白對(duì)照組歐李植物葉片中SOD酶活性(U/ml)，結(jié)果見表1.

表1　SOD酶活性記錄表

利用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)的原理和方法測(cè)定每日提取的SOD酶液中的酶蛋白的含量，連續(xù)測(cè)定7 d，得SOD酶蛋白含量的變化趨勢(shì)圖，結(jié)果見圖3.

圖3SOD酶蛋白含量的變化趨勢(shì)圖

由圖3可看出，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)階段中，水澇處理組的歐李植物葉片內(nèi)的SOD酶蛋白含量在前3 d呈下降趨勢(shì)，在第4 d含量突然增加，第5 d又減少，隨后一直呈上升趨勢(shì)；對(duì)照組在實(shí)驗(yàn)前3 d呈上升趨勢(shì)，隨后在實(shí)驗(yàn)的后期整體呈下降趨勢(shì)，但有所起伏.

2.3.2SOD酶比活力變化趨勢(shì).

通過比活力計(jì)算公式得SOD酶比活力趨勢(shì)變化如圖4所示.

由圖4可看出，水澇處理組的SOD酶比活力前72 h呈下降趨勢(shì)，72～120 h呈上升趨勢(shì)，之后一直呈下降趨勢(shì)；空白對(duì)照組SOD酶比活力在實(shí)驗(yàn)前96 h呈起伏上升，隨后一直下降.

圖4SOD酶比活的變化趨勢(shì)圖

2.4POD實(shí)驗(yàn)測(cè)定

2.4.1POD酶活性測(cè)定結(jié)果.

利用“1.3.1”項(xiàng)下“2)”的方法測(cè)POD酶活力，實(shí)測(cè)的水澇組和對(duì)照組歐李植物葉片POD酶活性酶活性[u/(mg·min)]，結(jié)果見表2.

表2　POD酶活性記錄表

利用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)的原理和方法，每日提取的POD酶液中的酶蛋白的含量，連續(xù)測(cè)定7 d，得POD酶蛋白含量的變化趨勢(shì)，結(jié)果如圖5所示.

圖5POD酶蛋白含量的變化趨勢(shì)圖

由圖5可看出，實(shí)驗(yàn)中水澇處理組和空白對(duì)照組的歐李植物葉片內(nèi)POD酶蛋白的含量變化不大，只在144 h時(shí)存在略微變化.

2.4.2POD酶比活力變化趨勢(shì).

通過比活力計(jì)算公式得POD酶比活力趨勢(shì)變化如圖6所示.

圖6POD酶比活的變化趨勢(shì)圖

由圖6的POD酶比活力的變化趨勢(shì)圖得出：水澇處理組的歐李植物葉片內(nèi)的POD酶比活力前24 h呈上升趨勢(shì)，24～120 h時(shí)一直呈下降趨勢(shì)，在第144 h時(shí)突然增大隨后又呈下降趨勢(shì)；空白對(duì)照組的POD酶比活力在實(shí)驗(yàn)前96 h時(shí)呈緩慢上升趨勢(shì)，但在120 h時(shí)突然降低，隨后又呈上升趨勢(shì).

3結(jié)論

由SOD和POD酶活性的變化趨勢(shì)結(jié)果表明：隨水澇脅迫的增強(qiáng)，SOD和POD活性隨著脅迫時(shí)間的延長表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，這與馬建軍等[6]的研究結(jié)果一致；在中度脅迫時(shí)，SOD和POD仍保持較高的活性，且活性值比對(duì)照大，但在重度脅迫下其活性均呈下降趨勢(shì).歐李植物葉片SOD活性在淹水初期與對(duì)照比較存在明顯下降趨勢(shì)，隨著水澇脅迫程度加深，由于歐李對(duì)淹水脅迫的適應(yīng)和自身的調(diào)節(jié)機(jī)制，使SOD酶活性又開始回升成上升趨勢(shì)，到第4 d升高至最大活性，在脅迫后5d超出對(duì)照.說明適度的逆境處理能提高植物的SOD活性，增強(qiáng)抗逆性.隨著水澇脅迫的繼續(xù)增強(qiáng)，其活力又逐漸呈下降趨勢(shì).

歐李POD酶的活性在水澇脅迫前期歐李葉片POD活性一直呈上升趨勢(shì)且整體高于對(duì)照，這與POD具有清除H2O2等活性氧的功能而增強(qiáng)植株的抗逆性相一致[14].但隨水澇脅迫強(qiáng)度的增大，POD酶的活性反而呈下降趨勢(shì)，分析認(rèn)為，POD活性在短期淹水下的快速上升應(yīng)屬植物體對(duì)逆境脅迫的一種應(yīng)激反應(yīng)，直至第6 d酶活性突然增加，出現(xiàn)這一結(jié)果可能存在的原因?yàn)闅鉁赝蝗坏纳?受水澇脅迫后酶蛋白含量變化都不是很明顯，分析認(rèn)為，在短時(shí)的水澇脅迫下，植物體內(nèi)蛋白的合成與分解可能達(dá)到一種相對(duì)的平衡.

總而言之，本實(shí)驗(yàn)受水澇脅迫處理的SOD酶和POD酶活性都有所提高，且二者存在明顯的補(bǔ)償機(jī)制.從水澇脅迫后的變化趨勢(shì)可推測(cè)歐李植物受淹后生理生化變化順序?yàn)椋篠OD活性受抑制→活性氧增加→SOD、POD活性及可溶性蛋白→清除活性氧→淹水脅迫加深→活性氧再增加→MDA積累→保護(hù)酶活性降低→質(zhì)膜受損，此可作為耐澇性評(píng)價(jià)的指標(biāo).

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SOD and POD Enzyme Changes of Prunus Humilis Bunge in Waterlogging Stress

WUXiaoyong1,2，LIPan2,ZHANGMin2，SUNYanxia2，GOUXiaojun1

(1.Key Laboratory of Medicinal and Edible Plants Resources Exploitation， Chengdu University, Chengdu 610106, China;

2.School of Pharmacy and Bioengineering, Chengdu University, Chengdu 610106, China)

Abstract:The relationship between SOD and POD enzyme activity under waterlogging stress are studied through the pot experiment method to observe the functions of SOD,and POD anti-oxidant enzyme system in the physiological study of Prunus Humilis Bunge in anti-waterlogging.SOD enzyme activity is detected by the pyrogallol autoxidation method and POD enzyme activity is also detected by using guaiacol method in Prunus humilis Bunge leaves.The experimental results show that the SOD enzyme activity largely decreases,but POD enzyme activity increases during waterlogging stress;SOD enzyme activity increases but POD enzyme activity decreases after a period.In the later stage,both SOD and POD enzyme activity decrease and finally reach a constant level.The conclusion drawn from the experiments is that the waterlogging can affect the physiological status of Prunus Humilis Bunge,but the results show that Prunus Humilis Bunge has more powerful adaptability in the waterlogging stress in a short period of time.

Key words：Prunus Humilis Bunge;waterlogging;POD;SOD;enzyme activity

文章編號(hào)：1004-5422(2016)02-0130-05

收稿日期：2016-04-26.

基金項(xiàng)目：四川省教育廳自然科學(xué)基金(14ZA0326)資助項(xiàng)目．

作者簡介：鄔曉勇(1975 — )， 男， 博士， 副教授， 從事植物資源開發(fā)利用研究．

中圖分類號(hào)：S662.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A