超聲輔助酶法回收南極磷蝦殼中蛋白質的研究

徐 洋，呂大強，王舒婷，曹 雪，于 波，姜啟興*，許艷順，于沛沛，夏文水

(1.江南大學食品學院，江蘇無錫 214122；2.遼寧省大連海洋漁業(yè)集團公司，遼寧大連 116113)

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超聲輔助酶法回收南極磷蝦殼中蛋白質的研究

徐 洋1，呂大強2，王舒婷1，曹 雪1，于 波2，姜啟興1*，許艷順1，于沛沛1，夏文水1

(1.江南大學食品學院，江蘇無錫 214122；2.遼寧省大連海洋漁業(yè)集團公司，遼寧大連 116113)

摘要[目的]研究南極磷蝦殼的超聲輔助酶解工藝，以最大程度地回收南極磷蝦加工下腳料中的蛋白質。[方法]探究了不同種類蛋白酶、固液比、pH、酶解時間、酶解溫度、酶底物比以及輔助超聲功率對蛋白回收率的影響，并通過正交試驗優(yōu)化確定超聲輔助酶解工藝參數(shù)。[結果]堿性蛋白酶水解蛋白能力最強；超聲輔助堿性蛋白酶解最優(yōu)工藝：自然pH下，控制固液比1∶10 g/mL，輔助超聲功率150 W，加入堿性蛋白酶(5 000 U/g蛋白)后，50 ℃下酶解2.5 h，此時蛋白質回收率達87.42%。[結論]采用優(yōu)化后的超聲輔助酶解工藝可極大程度地回收南極磷蝦加工下腳料中的蛋白質，促進磷蝦資源的充分利用。

關鍵詞酶解；超聲波；南極磷蝦下腳料；蛋白質

南極磷蝦(Euphausiasuperb)是一種生活在南冰洋南極洲水域的小型浮游甲殼類生物，主要以浮游植物為食，是世界上最大也是最后一個動物蛋白庫，其每年的捕獲量相當于全世界魚類和其他甲殼類的總和[1]。從“十二五”開始，我國越來越重視南極磷蝦的開發(fā)利用，但目前國內外的研究更多關注于南極磷蝦蝦肉中酶、脂肪酸等的研究[2]，關于其加工下腳料綜合利用的課題少見報道[3]。但對于河蝦、龍蝦等其他甲殼類加工下腳料的回收利用已有大量研究成果，主要集中在回收蛋白質、制備甲殼素及提取蝦青素等方面。

南極磷蝦在加工過程中會產生大量下腳料，包括蝦頭、蝦殼等，這些下腳料通常被當作廢棄物丟棄，經(jīng)濟價值沒有得到充分利用，這樣不僅是對資源的浪費，也會導致嚴重的環(huán)境污染?，F(xiàn)有的對于蛋白質回收的方法有：堿法提取[4]、酶法水解[5]和微生物發(fā)酵[6]等。堿法提取操作簡單，成本低廉，但由于反應條件劇烈，氨基酸易嚴重受損，水解程度難以控制，且造成的污染較大；酶水解是通過酶制劑來切斷蛋白質的肽鍵，反應條件溫和，過程容易操控[7]；微生物發(fā)酵法目前還處在實驗室階段。

為了利用酶解法最大限度地回收南極磷蝦加工下腳料中的蛋白質，筆者通過探討酶解反應時間、酶解反應溫度、酶底物比、輔助超聲反應的功率頻率等因素確定堿性蛋白酶酶解的最佳工藝參數(shù)，以期為充分利用南極磷蝦資源，進一步開發(fā)出具有較高市場附加值的蛋白產品，實現(xiàn)工業(yè)化生產提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料南極磷蝦冷凍蝦磚，由遼寧省大連海洋漁業(yè)集團提供，于低溫(-18 ℃)冷庫中貯藏備用；南極磷蝦加工下腳料，蝦磚在4 ℃解凍，經(jīng)魚肉采肉機擠壓脫殼后，置低溫(-18 ℃)下貯藏備用；堿性蛋白酶(Alcalase 2.4 L)，購自Novozymes諾維信公司。

主要儀器設備：YCR-180型魚肉采肉機，上海華夏漁業(yè)機械儀器工貿公司；PL203型電子分析天平、FE20型pH計，美國梅特勒-托利多儀器有限公司；4K-15型高速冷凍離心機，Sigma公司；UV1000型紫外-可見分光度計，上海天美科學儀器有限公司；101-1-BS型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海躍進醫(yī)療器械廠；RE-52A型旋轉蒸發(fā)器、90-2型恒溫磁力攪拌器，上海亞榮生化儀器廠；電熱恒溫水槽，上海一恒科學儀器有限公司；HYP-1008型八孔消化爐、KDN-2C型定氮儀，上海纖檢儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1蛋白酶種類對水解南極磷蝦加工下腳料蛋白質回收率的影響。 準確稱取20 g南極磷蝦下腳料，按酶底物比6 250 U/g蛋白分別添加蛋白酶(木瓜蛋白酶、風味蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、復合蛋白酶)，料液比為1∶10 g/mL，于各自最適溫度及最適pH下反應5 h，超聲功率為150 W，測定水解后蛋白回收率，每個樣品平行3次。

1.2.2固液比對水解南極磷蝦加工下腳料蛋白質回收率的影響。準確稱取20 g南極磷蝦下腳料，按酶底物比6 250 U/g蛋白添加堿性蛋白酶，料液比分別為1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶16、1∶20 g/mL，調節(jié)pH至9，于50 ℃下反應5 h，超聲功率為150 W，測定水解后蛋白回收率，每個樣品平行3次。1.2.3不同pH條件對水解南極磷蝦加工下腳料蛋白質回收率的影響。準確稱取20 g南極磷蝦下腳料，按酶底物比6 250 U/g 蛋白添加堿性蛋白酶，料液比為1∶10 g/mL，用緩沖液調節(jié)初始pH分別為7.0、7.5、8、8.5、9.0、9.5和10.0，于50 ℃下反應5 h，超聲功率為150 W，測定水解后蛋白回收率，每個樣品平行3次。

1.2.4酶解溫度對水解南極磷蝦加工下腳料蛋白質回收率的影響。準確稱取20 g南極磷蝦下腳料，按酶底物比6 250 U/g蛋白添加堿性蛋白酶，料液比為1∶10 g/mL，調節(jié)pH至9，分別于40、45、50、55、60、65、70 ℃水浴下反應5 h，超聲功率為150 W，測定水解后蛋白回收率，每個樣品平行3次。

1.2.5反應時間對水解南極磷蝦加工下腳料蛋白質回收率的影響。準確稱取20 g南極磷蝦下腳料，按酶底物比6 250 U/g蛋白添加堿性蛋白酶，料液比為1∶10 g/mL，調節(jié)pH至9，于50 ℃水浴下反應，在反應0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h時分別取樣，超聲功率為150 W，測定水解后蛋白回收率，每個樣品平行3次。

1.2.6酶底物比對水解南極磷蝦加工下腳料蛋白質回收率的影響。準確稱取20 g南極磷蝦下腳料，分別按酶底物比0、1 250、2 500、3 750、5 000 、6 250 U/g蛋白加入堿性蛋白酶，料液比為1∶10 g/mL，調節(jié)pH至9，于50 ℃水浴下反應5 h，超聲功率為150 W，測定水解后蛋白回收率，每個樣品平行3次。

1.2.7超聲波功率對水解南極磷蝦加工下腳料蛋白質回收率的影響。準確稱取20 g南極磷蝦下腳料，按酶底物比6 250 U/g蛋白添加堿性蛋白酶，料液比為1∶10 g/mL，調節(jié)pH至9，于50 ℃水浴下反應5 h，超聲功率分別為0、80、100、150、200、220 W，測定水解后蛋白回收率，每個樣品平行3次。

1.2.8酶解工藝條件的優(yōu)化。在單因素試驗結果的基礎上選擇因素水平，蛋白酶種類、固液比對酶解蛋白質回收率的影響不大，而pH過大或過小均不利于酶解液中的蛋白酶發(fā)生作用影響，故選取反應時間、酶解溫度、酶底物比和超聲波功率4個因素，以蛋白回收率為指標，采用L9(34)正交試驗進行超聲輔助酶解工藝條件優(yōu)化。試驗因素水平見表1。

表1　L9(34)正交試驗因素水平

1.3蛋白質回收率的測定蛋白質含量采用凱氏定氮法，按照以下公式計算：

蛋白質回收率(%)=酶解液中蛋白質含量/原料中蛋白質含量×100%

1.4數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)分析采用SPSS16.0軟件。

2結果與分析

2.1單因素對下腳料水解后蛋白質回收率的影響

2.1.1蛋白酶種類對南極磷蝦加工下腳料水解后蛋白質回收率的影響。根據(jù)王燕等研究報道的5種蛋白酶的最適水解條件[8]，分別對南極磷蝦加工下腳料進行酶解。由圖1可以看出，不同的酶對蛋白質的水解能力不同，其中胰蛋白酶和堿性蛋白酶的水解效果都很好。由于胰蛋白酶價格昂貴，綜合考慮及成本控制，選取蛋白質水解能力較強且價格適中的堿性蛋白酶。大量研究表明，在這幾種蛋白酶中對水產品蛋白質水解程度最高的是堿性蛋白酶[9]。

圖1　不同蛋白酶對水解蛋白質回收率的影響Fig.1　Effect of different proteases on protein recovering

2.1.2固液比對南極磷蝦加工下腳料水解后蛋白質回收率的影響。由圖2可以看出，隨著固液比中溶劑用量的增大，蛋白質的回收率隨之增大，當固液比為1∶10 g/mL時，趨勢趨于平緩，水解效果趨于平衡，考慮到固液比中溶劑用量對之后蛋白質的濃縮回收工藝有所不利。綜合考慮，最佳固液比為1∶10 g/mL。

圖2　固液比對蛋白質回收率的影響Fig.2　Effect of ratio of solid to liquid on protein recovering

2.1.3起始pH對南極磷蝦加工下腳料水解后蛋白質回收率的影響。pH能夠影響酶分子和底物分子中基團的解離狀態(tài)，從而影響酶分子的構象以及酶與底物的結合能力和催化能力，只有在適宜pH范圍內，酶才能顯示其催化活性。由圖3可以看出，堿性蛋白酶的最適宜pH在8.5～9.5，當pH為9.0時，蛋白質回收率最高，由此表明反應的最適pH為9.0，當pH減小或增大時，均不利于堿性蛋白酶的酶解反應。后續(xù)試驗證明，當按照固液比1∶10 g/mL加入緩沖液后，體系pH基本維持在9.0附近，考慮到成本問題，起始pH可不進行過多調節(jié)。

圖3　反應pH對蛋白質回收率的影響Fig.3　Effect of initial pH on protein recovering

2.1.4酶解溫度對南極磷蝦加工下腳料水解后蛋白質回收率的影響。溫度對制約蛋白酶制劑而言起著很重要的作用，溫度通過影響反應速度和酶穩(wěn)定性來影響酶催化反應。溫度較低，蛋白酶活性也相對較低，不能完全催化反應；而高溫會使酶變性從而喪失活力，也會導致酶催化反應速率的下降。由圖4可以看出，隨著酶解溫度的不斷升高，蛋白質回收率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，最優(yōu)酶解溫度為50 ℃。

圖4　酶解溫度對蛋白質回收率的影響Fig.4　Effect of hydrolysis temperature on protein recovering

2.1.5反應時間對南極磷蝦加工下腳料水解后蛋白質回收率的影響。圖5表明，隨著反應時間的增加，蛋白質回收率變化基本呈上升趨勢，在反應時間達到2.5 h后趨于平緩。理論上，反應時間越長，酶和底物蛋白質接觸得越久，蛋白質的回收率則越高。出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能是隨著酶解反應的進行，體系中底物(蛋白質)的濃度逐漸降低導致反應速度下降。因此，考慮到時間和能量消耗，堿性蛋白酶最佳酶解時間為2.5 h。

圖5　反應時間對蛋白質回收率的影響Fig.5　Effect of hydrolysis time on protein recovering

2.1.6酶底物比對南極磷蝦加工下腳料水解后蛋白質回收率的影響。從圖6可以看出，隨著酶底物比的增大，堿性蛋白酶水解南極磷蝦下腳料的速度明顯加快，其蛋白質回收率顯著升高。當酶底物比大于3 750 U/g蛋白之后，酶解速率降低，蛋白質回收率的上升幅度減小。產生這種現(xiàn)象是因為酶底物比在3 750 U/g蛋白以下時，體系中底物過量，水解速率和蛋白提取率隨酶底物比的增加而逐漸增大；而在酶底物比比較大的情況下，反應速率主要由底物濃度決定，酶濃度過大會導致沒有足夠的底物供其結合，于是造成蛋白提取率隨加酶量的增加而升高幅度很小的情況。

圖6　酶底物比對蛋白質回收率的影響Fig.6　Effect of ratio of enzyme-substrate on protein recovering

2.1.7超聲波功率對南極磷蝦加工下腳料水解后蛋白質回收率的影響。超聲波具有波動和能量2種屬性，對物質有空化效應和機械作用，能將原料中的蛋白質粉碎、液化，顯著提高蝦殼細胞內容物(蛋白質)的回收率[10]。

從圖7可知，隨著超聲波功率的增大，蛋白質回收率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，并在150 W時呈現(xiàn)最佳效果。理論上來說，超聲功率越大，蛋白質回收率越高，反應越完全，當擴散達到平衡，增大超聲功率時回收率不再增大，之后的回收率下降可能是由于超聲功率過大或處理時間過長導致蛋白質變性，因而水溶性變差難以水解引起的。姜震等利用超聲波輔助堿提法提取龍蝦加工廢棄物中蛋白質，其提取率可達78.60%[11]。

圖7　超聲波功率對蛋白質回收率的影響Fig.7　Effect of ultrasonic power on protein recovering

2.2酶解條件的正交優(yōu)化以蛋白回收率為指標，對反應時間、酶解溫度、酶底物比和超聲波功率進行4因素3水平的正交試驗。正交試驗結果如表2所示。由表2可知，對蛋白質回收率影響的因素由大到小依次為：酶解溫度、酶底物比、超聲波功率、反應時間。最優(yōu)組合為A3B2C3D2，即反應時間2.5 h，酶解溫度50 ℃，酶底物比5 000 U/g蛋白質，超聲波功率150 W。

表2　正交試驗直觀分析

3結論

該試驗分別采用木瓜蛋白酶、風味蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶以及復合蛋白酶對原料進行酶解，結果表明，堿性蛋白酶相對更高效節(jié)能。通過單因素及正交試驗優(yōu)化超聲輔助酶解工藝，最佳工藝參數(shù)組合為：固液比1∶10 g/mL，酶解溫度50 ℃，加酶量(酶底物比)5 000 U/g蛋白質，超聲功率150 W，反應時間2.5 h。最佳蛋白質回收率為87.42%，優(yōu)于直接酶解法蛋白回收率[12](86.10%)。此外，與直接酶解法相比，超聲輔助酶解法中蛋白酶添加量更少，酶解速度更快，可以大大縮減生產時間和材料成本。

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基金項目“十二五”國家“863”計劃項目(2011AA090801)；農業(yè)科技成果轉化資金項目(2014GB2C100312)。

作者簡介徐洋(1991- )，女，江蘇海安人，碩士研究生，研究方向：食品加工與保藏。*通訊作者，副教授，博士，從事食品加工與保藏研究。

收稿日期2016-04-06

中圖分類號S 986

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)14-097-04

Research on the Protein Extracted from Antarctic Krill Shell with Ultrasonic-assisted Enzymatic Method

U Yang1, LU Da-qiang2, WANG Shu-ting1, JIANG Qi-xing1*et al

X(1.School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122;2. Dalian Ocean Fishery Group of Liaoning Province, Dalian, Liaoning 116113)

AbstractIn order to maximally recover the protein from Antarctic krill shell, the extraction technology of enzymatic hydrolysis method with Ultrasonic-assisted was studied. The influence of the different proteinases, ratio of solid-to-liquid, pH value, enzymolysis time and temperature, ratio of enzyme to substrate and ultrasonic power on the recovery of protein was tested. With orthogonal experiment, the optimal process parameters were formed, which was as follows：the pH value was in natural condition; the ratio of solid to liquid, 1∶10 g/mL; the ultrasonic power, 150 W; the ratio of enzyme to substrate, 5 000 U/g protein; the temperature, 50 ℃; and the treating time, 2.5 h at 50 ℃. The extraction efficiency of protein in the optimized conditions was 87.42%. Alkaline protease had the strongest capability in hydrolyzing protein. As a result, the protein in Antarctic krill shell could be recovered with the technique to the most extent and the kinds of resource could be fully utilized.

Key wordsEnzymatic hydrolysis; Ultrasonic; Antarctic krill shell; Protein