異氟烷對間歇缺氧靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用研究

張旭東　　任鵬程　　何印斌　　孫　麗　　刻九虎

第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院全軍骨腫瘤研究所麻醉科，陜西西安　710038

異氟烷對間歇缺氧靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用研究

張旭東任鵬程何印斌孫麗刻九虎

第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院全軍骨腫瘤研究所麻醉科，陜西西安710038

目的探討異氟烷對間歇缺氧 （IH）人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的作用。方法HUVEC和EAhy926細(xì)胞分為對照組、模型組及1%、1.5%、2%異氟烷預(yù)處理組，測定細(xì)胞活力、乳酸脫氫酶（LDH）和超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量和谷胱甘肽（GSH）水平，采用Rea1-time PCR和Western b1ot法檢測低氧誘導(dǎo)因子（HIF-1α）和核轉(zhuǎn)錄因子-B（NF-кB）的表達(dá)。結(jié)果 與對照組比較，模型組細(xì)胞活力、SOD活性和GSH水平降低，LDH活性、MDA含量、HIF-1α和NF-кB表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。與模型組比較，異氟烷預(yù)處理組的細(xì)胞活力、SOD活性、GSH水平和HIF-1α表達(dá)，增加LDH活性、MDA含量和NF-кB表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。 結(jié)論異氟烷能清除細(xì)胞氧自由基，上調(diào)HIF-1α表達(dá)，下調(diào)NF-кB表達(dá)，提示其能降低IH引起氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)，減輕內(nèi)皮細(xì)胞IH損傷。

異氟烷；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；間歇缺氧；氧化應(yīng)激；炎癥

［Abstract］Objective To study the effect of isof1urane on intermittent hypoxia（IH）injured human umbi1ica1 vein endothe1ia1 ce11s.Methods HUVEC and EAhy926 ce11s were divided into contro1 group，mode1 group，1%，1.5%，2% Isof1urane pre-treatment group.Ce11 viabi1ity，MDA and GSH 1eve1s，LDH and SOD activities，and HIF-1α and NF-кB expressions were tested by MTT assay，expression of MDA，LDH，SOD and GSH were tested by Rea1-time PCR and Western b1ot，respective1y.Results Compared with contro1 group，the ce11 viabi1ity，SOD activity and GSH 1eve1 decreased，LDH activity and MDA 1eve1，and expression of HIF-1α and NF-кB increased in mode1 group ce11s，the differences were statistica11y significant（P＜0.05 or P＜0.01）.Compared with mode1 group，the ce11 viabi1ity，SOD activity，GSH 1eve1 and HIF-1α expression increased，MDA 1eve1，LDH activity and NF-кB expression decreased，the differences were statistica11y significant（P＜0.05 or P＜0.01）Conclusion Isof1urane protects human umbi1ica1 vein endothe1ia1 ce11s from IH injury by scavenging free radica1 and reducing oxidative stress and inf1ammation.

［Key words］Isof1urane；Human umbi1ica1 vein endothe1ia1 ce11s；Intermittent hypoxia；Oxidative stress；Inf1ammation

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征（obstructive s1eep apnea syndrome，OSAS）是睡眠時(shí)上呼吸道反復(fù)阻塞的一種疾?。?］，為高血壓、冠心病和心肌梗塞等諸多心腦血管疾病相關(guān)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［2-3］，二者關(guān)系的研究逐漸成為目前研究熱點(diǎn)。間歇缺氧（intermittent hypoxia，IH）導(dǎo)致的氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)造成的血管內(nèi)皮損傷是OSAS引起心腦血管疾病的主要原因之一［4］。臨床常用麻醉藥異氟烷可抑制氧自由基生成，降低臟器缺血再灌注損傷［5］，但其對細(xì)胞IH的作用鮮見報(bào)道。本研究探討異氟烷對IH臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的作用。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)試劑

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC和EAhy926（中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所）；DMEM培養(yǎng)基（Hyc1one公司）；胎牛血清（FBS）（Gibco公司）；BCA試劑盒、核蛋白提取試劑盒、乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒和谷胱甘肽（GSH）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；抗體（Santa Cruz公司）；PVDF膜和ECL化學(xué)發(fā)光試劑 （Mi11ipore公司）；TRIzo1試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Invitrogen公司）。

1.2分組及處理方法

HUVEC和EAhy926細(xì)胞分為對照組、模型組和1%、1.5%、2%異氟烷預(yù)處理組。對照組細(xì)胞正常培養(yǎng)；IH模型細(xì)胞參照Hoffmann等［6］的方法，于5%CO2和95%N2（O2＜1%）中37℃培養(yǎng)5 min，再正常培養(yǎng)5 min，每天循環(huán)6 h，共4 d；異氟烷預(yù)處理組細(xì)胞分別用溶解在DMEM中1%、1.5%、2%異氟烷處理3 h后進(jìn)行IH處理。

1.3MTT法測定細(xì)胞活力

細(xì)胞以1×105個(gè)/mL接種于96孔板，同“1.2”項(xiàng)方法培養(yǎng)，加5 g/L MTT 20 μL培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)基后加DMSO 150 μL溶解結(jié)晶。用全自動酶標(biāo)儀檢測490 nm吸光度。重復(fù)3次。

1.4GSH水平、LDH活性及MDA含量測定

細(xì)胞培養(yǎng)液離心后取上清，按相應(yīng)試劑盒說明書測GSH水平、LDH活性和MDA含量，重復(fù)3次。

1.5SOD活性測定

細(xì)胞用0.25%胰酶消化，離心，PBS溶解沉淀，超聲破碎，按SOD試劑盒說明書測SOD活性，重復(fù)3次。

1.6Real-time PCR檢測

TRIzo1法提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，定量PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系：SYBR Premix Ex TaqⅡ10 μL，上下游引物各0.5 μL，2 μL cDNA，ddH2O 7 μL。反應(yīng)條件：94°C，2 min；94°C，30 s；62°C，30 s，30個(gè)循環(huán)；72°C，5 min。低氧誘導(dǎo)因子（HIF-1α）上下游引物為5'-ATCTGAGGACACGAGCTGCCT-3'和 5'-CAGAAGGACTT-GCTGGCTGATC-3'，產(chǎn)物368 bp；核轉(zhuǎn)錄因子-B（NF-кB）上下游引物為5'-CTGATGTGCACCGACAAGTGG-3'和5'-GTT-GATGGTGCTCAGGGATGAC-3'，產(chǎn)物353 bp。各樣品復(fù)管2次。βactin為內(nèi)參。基因表達(dá)量由2-ΔΔCt法獲得。

1.7Western blot檢測

Trizo1抽提細(xì)胞總蛋白，用核蛋白提取試劑盒提取核蛋白，BCA法測蛋白濃度。10 μg蛋白經(jīng)10% SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)膜，封閉1 h，分別加入HIF-1α、NF-кB、GAPDH或TBP一抗，4℃孵育過夜，洗膜，加二抗，室溫孵育2 h，GAPDH為HIF-1α的內(nèi)參，TBP為NF-кB的內(nèi)參，用ECL系統(tǒng)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光和觀察。重復(fù)3次。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1異氟烷增加IH內(nèi)皮細(xì)胞存活力，降低LDH活性

與對照組比較，模型組吸光度值降低，LDH活性均升高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較難，隨著異氟烷濃度的增加吸光度值增加，LDH活性下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1、圖1。

表1　異氟烷對IH HUVEC、EAhy926細(xì)胞存活力和LDH活力的影響

圖1　異氟烷對IH HUVEC、EAhy926細(xì)胞存活力和LDH活力的影響

2.2異氟烷降低IH內(nèi)皮細(xì)胞MDA含量

與對照組比較，模型組MDA含量增加，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，隨著異氟烷濃度的增加MDA含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2、圖2。

表2　異氟烷對IHHUVEC、EAhy926細(xì)胞MDA含量的影響（mmo1/L，±s）

表2　異氟烷對IHHUVEC、EAhy926細(xì)胞MDA含量的影響（mmo1/L，±s）

注：與對照組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；MDA：丙二醛

組別　HUVEC　EAhy926對照組模型組1%異氟烷預(yù)處理組1.5%異氟烷預(yù)處理組2%異氟烷預(yù)處理組0.57±0.05 0.93±0.02##0.86±0.03*0.76±0.05**0.63±0.03**0.61±0.08 0.99±0.04##0.91±0.04*0.80±0.03**0.70±0.02**

圖2　異氟烷對IH HUVEC和EAhy926細(xì)胞MDA含量的影響

2.3異氟烷升高IH內(nèi)皮細(xì)胞SOD活性和GSH水平

與對照組比較，模型組培養(yǎng)基中SOD活性和GSH水平顯著降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），異氟烷預(yù)處理顯著升高SOD活性和GSH水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且隨著異氟烷濃度的增加SOD活性和GSH水平均升高。見表3、圖3。

表3　異氟烷對IH HUVEC和EAhy926細(xì)胞SOD活性和GSH水平的影響（±s）

表3　異氟烷對IH HUVEC和EAhy926細(xì)胞SOD活性和GSH水平的影響（±s）

注：與對照組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；SOD：超氧化物歧化酶；GSH：谷胱甘肽

組別HUVEC SOD活性（U/mL）　GSH水平（mg/L）EAhy926 SOD活性（U/mL）　GSH水平（mg/L）對照組模型組1%異氟烷預(yù)處理組1.5%異氟烷預(yù)處理組2%異氟烷預(yù)處理組71.05±2.61 36.59±1.23##42.15±2.41*57.02±2.20**64.55±2.18**82.11±3.96 51.88±3.47##59.88±2.84*68.48±2.92**72.73±3.39**68.74±4.83 38.60±1.54##44.87±3.20*52.38±2.77**58.91±1.99**88.14±3.37 48.45±6.13##59.46±4.02*71.29±3.80**78.40±3.11**

圖3　異氟烷對IH HUVEC和EAhy926細(xì)胞SOD活性和GSH水平的影響

2.4異氟烷對IH內(nèi)皮細(xì)胞HIF-1α和NF-кB表達(dá)的影響

qRT-PCR和Western b1ot結(jié)果表明：與對照組比較，模型組HIF-1α和核內(nèi)NF-кB均高表達(dá)，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，隨著異氟烷濃度的增加內(nèi)皮細(xì)胞HIF-1α mRNA和蛋白表達(dá)均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而NF-кB mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4、5。

圖4　異氟烷對IH HUVEC細(xì)胞HIF-1α和NF-kB表達(dá)的影響

圖5　異氟烷對IH EAhy926細(xì)胞HIF-1α和NF-kB表達(dá)的影響

3　討論

OSAS機(jī)體處于IH環(huán)境中，產(chǎn)生大量氧自由基，形成氧化應(yīng)激狀態(tài)［7］。OSAS可導(dǎo)致諸多心腦血管疾病，病理基礎(chǔ)是血管內(nèi)皮受損，而IH是引起血管內(nèi)皮受損的核心環(huán)節(jié)［8］。本實(shí)驗(yàn)用HUVEC和EAhy926細(xì)胞IH模擬OSAS IH，模型組吸光度降低，LDH活性升高，表明細(xì)胞氧化呼吸功能受損，細(xì)胞膜通透性增加。

全身麻醉后OSAS患者術(shù)后呼吸系統(tǒng)并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)很高［9］。麻藥的選擇對OSAS患者的安全至關(guān)重要。異氟烷是臨床常用揮發(fā)性鹵代麻醉藥［10］，具有抗氧化的特性，保護(hù)細(xì)胞DNA損傷［11］。異氟烷預(yù)處理對多種器官可產(chǎn)生保護(hù)作用。據(jù)報(bào)道，異氟烷對腦［12］、心臟［13］、心?。?4］、腎［15］、肝和肺［16］等器官缺血再灌注損傷均有保護(hù)作用。鑒于缺血再灌注與IH有相似之處，本研究探討異氟烷對IH內(nèi)皮細(xì)胞的作用，發(fā)現(xiàn)異氟烷預(yù)處理可降低細(xì)胞IH損傷。血管內(nèi)皮細(xì)胞功能異常是引發(fā)心血管疾病的關(guān)鍵，內(nèi)皮細(xì)胞缺氧可產(chǎn)生大量活性氧，損傷血管。異氟烷可提高IH臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞SOD活性和GSH水平，降低氧自由基，保護(hù)細(xì)胞。

OSAS合并心腦血管疾病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，NF-кB依賴的炎性通路和HIF-1依賴的適應(yīng)性通路尤為重要［17-18］。NF-кB在胞漿內(nèi)與IкB結(jié)合，無活性；受到炎癥介質(zhì)和應(yīng)激反應(yīng)等刺激后解離，NF-кB活化入核，促進(jìn)炎癥因子轉(zhuǎn)錄。據(jù)報(bào)道IH可升高EAhy926中NF-кB表達(dá)［19］。HIF-1廣泛存在于人和哺乳動物細(xì)胞內(nèi)，低氧時(shí)才穩(wěn)定表達(dá)［20］，能激活200多個(gè)基因調(diào)控缺氧應(yīng)答［21］。HIF-1由受缺氧調(diào)控的HIF-1α和細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)的HIF-1β組成，只有二聚體才能發(fā)揮作用。缺氧時(shí)HIF-1α表達(dá)增多，與HIF-1β結(jié)合入核，激活促血管內(nèi)皮生長因子、促紅細(xì)胞生成素和一氧化氮合酶等基因轉(zhuǎn)錄［22］。HIF-1α可降低缺血再灌注損傷中線粒體氧化應(yīng)激的產(chǎn)生，其下游效應(yīng)因子已糖激酶Ⅱ也可阻止缺血再灌注損傷造成的線粒體功能障礙［22］。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：IH HUVEC和EAhy926細(xì)胞HIF-1α和核內(nèi)NF-кB表達(dá)升高，而異氟烷預(yù)處理能夠升高細(xì)胞HIF-1α表達(dá)，降低NF-кB表達(dá)，提示其可抑制氧化應(yīng)激所致的炎癥損傷。

綜上所述，異氟烷可降低細(xì)胞IH損傷，為其用于OSAS患者的麻醉提供依據(jù)。然而異氟烷在降低細(xì)胞IH損傷的同時(shí)，是否有其他副作用，還有待深入研究。

［1］Mannarino MR，Di Fi1ippo F，Pirro M.Obstructive s1eep apnea syndrome［J］.Eur J Intern Med，2012，23（7）：586-593.

［2］Destors M，Tamisier R，Baguet JP，et a1.Cardiovascu1ar morbidity associated with obstructive s1eep apnea syndrome［J］. Rev Ma1 Respir，2014，31（4）：375-385.

［3］王鵬舉，李江平.氧化應(yīng)激反應(yīng)在OSAHS伴原發(fā)性高血壓中的作用［J］.臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2014，28（9）：604-606.

［4］Seif F，Pate1 S R，Wa1ia H，et a1.Association between obstructive s1eep apnea severity and endothe1ia1 dysfunction in an increased background of cardiovascu1ar burden［J］.J S1eep Res，2013，22（4）：443-451.

［5］Baotic I，Weihrauch D，Procknow J，et a1.Isof1urane favorab1y modu1ates guanosine triphosphate cyc1ohydro1ase-1 and endothe1ia1 nitric oxide synthase during myocardia1 ischemia and reperfusion injury in rats［J］.Anesthesio1ogy，2015，123（3）：582-589.

［6］Hoffmann M S，Singh P，Wo1k R，et a1.Obstructive s1eep apnea and intermittent hypoxia increase expression of dua1 specificity phosphatase 1［J］.Atherosc1erosis，2013，231（2）：378-383.

［7］Lavie L.Oxidative stress in obstructive s1eep apnea and intermittent hypoxia--revisited--the bad ug1y and good：imp1ications to the heart and brain［J］.S1eep Med Rev，2015，20：27-45.

［8］Lopez-Jimenez F，Sert Kuniyoshi FH，Gami A，et a1.Obstructive s1eep apnea：imp1ications for cardiac and vascu-1ar disease［J］.Chest，2008，133（3）：793-804.

［9］Xara D，Mendonca J，Pereira H，et a1.Adverse respiratory events after genera1 anesthesia in patients at high risk of obstructive s1eep apnea syndrome［J］.Braz J Anesthesio1，2015，65（5）：359-366.

［10］Braz MG，Braz LG，F(xiàn)reire CM，et a1.Isof1urane and Propofo1 contribute to increasing the antioxidant status of patients during minor e1ective surgery：a randomized c1inica1 study［J］.Medicine（Ba1timore），2015，94（31）：e1266.

［11］Rocha TL，Dias-Junior CA，Possomato-Vieira JS，et a1. Sevof1urane induces DNA damage whereas isof1urane 1eads to higher antioxidative status in anesthetized rats［J］. Biomed Res Int，2015，2015：264971.

［12］Fang Li Q，Xu H，Sun Y，et a1.Induction of inducib1e nitric oxide synthase by isof1urane post-conditioning via hypoxia inducib1e factor-1a1pha during to1erance against ischemic neurona1 injury［J］.Brain Res，2012，1451：1-9.

［13］AgnicI，VukojevicK，Saraga-Babic M，eta1.Isof1uranepostconditioning stimu1ates the pro1iferative phase of myocardia1 recovery in an ischemia-reperfusion mode1 of heart injury in rats［J］.Histo1 Histopatho1，2014，29（1）：89-99.

［14］Wu W，Zhou X，Liu P，et a1.Isof1urane reduces hypoxia/ reoxygenation-induced apoptosis and mitochondria1 permeabi1ity transition in rat primary cu1tured cardiocytes［J］. BMC Anesthesio1，2014，14：17.

［15］Liang Y，Li Z，Mo N，et a1.Isof1urane preconditioning ame1iorates rena1 ischemia-reperfusion injury through antiinf1ammatory and antiapoptotic actions in rats［J］. Bio1 Pharm Bu11，2014，37（10）：1599-1605.

［16］Zhang L，Luo N，Liu J，et a1.Emu1sified isof1urane preconditioning protects against 1iver and 1ung injury in rat mode1 of hemorrhagic shock［J］.J Surg Res，2011，171 （2）：783-790.

［17］Ryan S，Tay1or CT，McNicho1as WT.Systemic inf1ammation：a key factor in the pathogenesis of cardiovascu1ar comp1ications in obstructive s1eep apnoea syndrome？［J］. Postgrad Med J，2009，85（1010）：693-698.

［18］Ryan S，McNicho1as WT.Intermittent hypoxia and activation of inf1ammatory mo1ecu1ar pathways in OSAS［J］. Arch Physio1 Biochem，2008，114（4）：261-266.

［19］Han Q，Yeung SC，Ip MS，et a1.Intermittent hypoxia-induced NF-kappaB and HO-1 regu1ation in human endothe1ia1 EA.hy926 ce11s［J］.Ce11 Biochem Biophys，2013，66（3）：431-441.

［20］Tekin D，Dursun AD，Xi L.Hypoxia inducib1e factor 1 （HIF-1）andcardioprotection［J］.ActaPharmaco1Sin，2010，31（9）：1085-1094.

［21］Ong SG，Hausen1oy DJ.Hypoxia-inducib1e factor as a therapeutic target for cardioprotection［J］.Pharmaco1 Ther，2012，136（1）：69-81.

［22］Yuan G，Khan SA，Luo W，et a1.Hypoxia-inducib1e factor 1 mediates increased expression of NADPH oxidase-2 in response to intermittent hypoxia［J］.J Ce11 Physio1，2011，226（11）：2925-2933.

Isoflurane protects human umbilical vein endothelial cells on intermittent hypoxia injury

ZHANG XudongREN PengchengHE YinbinSUN LiLIU Jiuhu
Department of Anesthesio1ogy，PLA Institute of Orthopedic Onco1ogy，Tangdu Hospita1，F(xiàn)ourth Mi1itary Medica1 University，Xi'an Shaanxi710038，China

R614.2

A

1673-7210（2016）04（c）-0028-05

任鵬程（1971.9-），男，副主任醫(yī)師；研究方向：心血管麻醉。

2016-01-23本文編輯：蘇 暢）