表皮生長因子對化療損傷小鼠骨髓基質(zhì)細胞的保護作用

刁遠明　　詹　瑧　　周　韜　　張偉偉　　張李唯　　董　偉　　張軍峰

1.廣州中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，廣東廣州　510006；2.南京中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，江蘇南京　210023

表皮生長因子對化療損傷小鼠骨髓基質(zhì)細胞的保護作用

刁遠明1，2詹瑧2▲周韜2張偉偉2張李唯2董偉2張軍峰2

1.廣州中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，廣東廣州510006；2.南京中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，江蘇南京210023

目的探討表皮生長因子（EGF）對5-氟尿嘧啶（5-FU）化療損傷小鼠骨髓基質(zhì)細胞（OP9）的保護作用。 方法首先建立5-FU化療損傷OP9細胞模型并摸索EGF作用劑量。然后，將實驗分為空白對照組、模型組、實驗組。用25 μg/mL 5-FU作用OP9細胞作為模型組，用20 ng/mL的EGF處理25 μg/mL 5-FU損傷的OP9細胞作為實驗組，并設常規(guī)培養(yǎng)的OP9細胞作為空白對照組。分別用CCK-8法檢測細胞存活率，流式細胞術(shù)（FCM）檢測細胞凋亡，一氧化氮（NO）測試盒、一氧化氮合酶（NOS）測定試劑盒、Caspase-3活性檢測試劑盒分別檢測NO、iNOS、TNOS及Caspase-3的含量。結(jié)果與空白對照組比較，模型組細胞存活率明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，EGF可以顯著保護5-FU損傷的OP9細胞，使其存活率升高（P＜0.01）。與空白對照組比較，模型組細胞早期凋亡率明顯提高（P＜0.05），Caspase-3含量明顯增加（P＜0.05），NO生成明顯增多（P＜0.05），iNOS表達明顯上升（P＜0.05）；與模型組比較，實驗組化療損傷OP9細胞的早期凋亡率顯著降低（P＜0.05），Caspase-3含量明顯下降（P＜0.05），iNOS的表達明顯受到抑制（P＜0.01），NO的生成明顯減少（P＜0.05）。結(jié)論EGF可能通過降低Caspase-3含量抑制細胞凋亡，減少NO的過度生成，發(fā)揮其細胞保護作用。

表皮生長因子；5-氟尿嘧啶；OP9細胞；化療損傷

［Abstract］Objective To investigate the protective effect of epiderma1 growth factor（EGF）on 5-F1uorouraci1（5-FU）chemotherapy-injured mouse bone marrow stroma1 ce11s（OP9）.Methods First，the OP9 injury mode1 was estab1ished by using 5-FU and the effect of EGF on OP9 injury mode1 was exp1ored.Then，the experiment was divided into b1ank contro1 group，mode1 group and experimenta1 group.The OP9 ce11s treated with 25 μg/mL 5-FU were used as the mode1 group.The mode1 ce11s treated with 20 ng/mL EGF were used as the experimenta1 group，and the norma1 OP9 ce11s were used as b1ank contro1 group.CCK-8 assay was used to detect ce11 viabi1ity.Ce11 apoptosis was detected by FCM. NO，iNOS，TNOS，Caspase-3 were detected by nitric oxide（NO）test kit，nitric oxide synthase（NOS）assay kit，Caspase-3 active assay kit.Results Compared with the b1ank contro1 group，the ce11 surviva1 rate of mode1 group was significant1y decreased（P＜0.01），and compared with the mode1 group，EGF cou1d significant1y protect OP9 ce11s from 5-FU damage，and increased the surviva1 rate of ce11s（P＜0.01）.Compared with the b1ank contro1 group，the ear1y apoptosis rate of mode1 group was significant1y enhanced（P＜0.05），the content of Caspase-3 was significant1y increased（P＜0.05），the NO production was significant1y increased（P＜0.05），and the expression of iNOS was significant1y rose（P＜0.05）.Compared with the mode1 group，the ear1y apoptosis rate of injury OP9 ce11s of the experimenta1 group was significant1y decreased（P＜0.05），the content of Caspase-3 was significant1y reduced（P＜0.05），the iNOS expression was significant1y inhibited（P＜0.01），and NO generation was 1essened（P＜0.05）.Conclusion EGF might inhibit apoptosis through decreasing the content of Caspase-3 and reducing the excessive production of NO to p1ay its ro1e in ce11 protection.

［Key words］Epiderma1 growth factor；5-F1uorouraci1；OP9 ce11s；Chemotherapy injury

化療是治療惡性腫瘤的一種重要手段，其臨床作用日益突出，但是腫瘤化療的毒副作用以及對患者生活質(zhì)量所造成的影響也成為影響其療效的重要原因之一?；熕幬镌诳焖贇缒[瘤細胞的同時，對人體中處于活躍分裂狀態(tài)的細胞也具有極大的殺傷力，這是其化療毒副作用的根源。開發(fā)研究新的高效低毒藥物、降低化療毒副作用是當前的研究熱點［1］。表皮生長因子（EGF）通過結(jié)合表皮生長因子受體（EGFR）刺激細胞發(fā)生有絲分裂，在胚胎發(fā)育、創(chuàng)傷修復、腫瘤發(fā)生等過程中起到重要作用［2-4］。另外，有研究表明，EGF可促進小鼠骨髓基質(zhì)干細胞的增殖，是小鼠骨髓基質(zhì)干細胞體外大量培養(yǎng)和快速增殖的有效刺激因子［5］。因此，筆者猜測EGF很可能對化療藥物損傷的機體的正常細胞有一定的保護作用。然而，EGF對腫瘤化療藥物損傷的小鼠骨髓基質(zhì)細胞是否具有保護作用及其可能的作用機制目前尚未有相關研究報道，因此，本研究以EGF為主要研究對象，對其化療輔助作用進行初步探討。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株小鼠骨髓基質(zhì)細胞（OP9），由中國科學院細胞庫提供。

1.1.2試劑 胎牛血清（貨號1428479，GIBCO公司）；MEMα培養(yǎng)基（貨號12000022，GIBCO公司）；胰蛋白酶（GIBCO公司）；6孔和96孔細胞培養(yǎng)板（平底）（CORNING公司）；5-氟尿嘧啶 （5-FU，AMRESCO公司，批號0597）；EGF（PEPROTECH公司，純度＞98%，批號0906390-1）；CCK8試劑盒 （日本同仁化學研究所，貨號GC762）；Caspase-3活性檢測試劑盒、Bradford蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術(shù)）；Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡試劑盒（eBioscience公司）；一氧化氮（NO）測試盒、一氧化氮合酶（NOS）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.1.3儀器設備 酶標儀（Power Wave X340，美國BIOTEK公司）；超凈工作臺（蘇凈公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；顯微鏡（日本OLYMPUS）；熒光顯微鏡（BX41，日本OLYMPUS）；超純水凈化系統(tǒng)（南京易普易達科技發(fā)展有限公司）；立式壓力蒸汽滅菌器（LS-B50L，上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司）；FACS Ca1ibur流式細胞儀（美國BD公司）；電子天平（德國sartorius）。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 將細胞按1×105個/mL接種在培養(yǎng)瓶中，加入MEMα培養(yǎng)體系，二氧化碳培養(yǎng)箱溫育（37℃、5%CO2），24 h后換液。細胞為梭型貼壁生長，待細胞生長至70%～80%時，用0.25%的胰酶消化傳代，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.2.25-FU化療損傷模型的建立 細胞以1×105個/孔密度接種于96孔板上，培養(yǎng)24 h后，加入5-FU使其終濃度為12.5、25、50、100、200 μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h，培養(yǎng)時間終止后，加入CCK8試劑10 μL，37℃反應2 h，450 nm波長檢測各孔吸光度值（A）。按公式計算細胞存活率：存活率=［（A實驗孔-A本底）/A空白對照組-A本底）］×100%。根據(jù)結(jié)果選定5-FU適宜的作用時間和損傷濃度。

大多數(shù)教師把教學的百分之九十的精力放在了教學設計上，聽課中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)教師游戲設計的精彩多樣，可是到了評價的階段卻是相當?shù)牧邌?，只是草率地一帶而過。殊不知，教學評價才是游戲深化、幼兒發(fā)展最直接的因素。

1.2.3CCK8法檢測EGF對5-FU化療損傷OP9細胞模型存活率的影響 細胞以1×105個/孔密度接種于96孔板上，24 h后，EGF組分別加入1.25、2.5、5、10、20 ng/mL的EGF及25 μg/mL 5-FU，模型組加入終濃度為25 μg/mL 5-FU，空白對照組始終用完全培養(yǎng)液，每組6孔。分別于藥物作用24 h后加入CCK8試劑10 μL，同實驗“1.2.2”項下操作并計算細胞存活率。實驗重復3次。

1.2.4實驗分組及給藥實驗分設空白對照組、模型組、實驗組。模型組加入終濃度為25 μg/mL 5-FU，實驗組加入20 ng/mL EGF溶液及終濃度為25 μg/mL 5-FU，空白對照組加入等量培養(yǎng)液。

1.2.5Anexin V-FITC/PI雙染流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 細胞接種于6孔板，按“1.2.4”的實驗分組及給藥，24 h后，胰酶消化收集細胞制備成的細胞懸液，1000 r/min離心5 min，離心半徑為6 cm，棄上清，用PBS洗2次，再加入1 mL PBS重懸成單細胞懸液，按Anexin V-FITC/PI雙染試劑盒操作，F(xiàn)CM分析細胞凋亡情況。實驗重復3次。

1.2.6Caspase-3試劑盒檢測Caspase-3酶活性按“1.2.4”的實驗分組及給藥，24 h后，胰酶消化收集細胞制備成的細胞懸液，冰浴裂解細胞后，4℃高速離心，取上清液一部分按Caspase-3活性檢測試劑盒相關步驟處理，測定各組樣品中Caspase-3催化產(chǎn)生的pNA產(chǎn)生的吸光度，通過pNA標準曲線可以計算出樣品中催化產(chǎn)生的pNA的量。另取一部分上清液樣品用Bradford法測定蛋白，通過蛋白標準曲線可以計算出每個樣品中所含的蛋白的量。每個樣品pNA的量比上樣品中所含的蛋白的量即為單位重量蛋白中所含的Caspase-3的酶活力單位。實驗重復3次。

1.2.7NO、NOS試劑盒檢測NO和NOS含量 按“1.2.4”的實驗分組及給藥，24 h后，取細胞上清液，按NO測試盒相關步驟處理，測定各組NO變化情況。同時取細胞上清液，按NOS測定試劑盒相關步驟處理，測定各組NOS的活性變化情況。實驗重復3次。

1.3統(tǒng)計學方法

應用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用兩樣本單因素方差分析（One-Way ANOVA），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.15-FU對OP9細胞存活率的影響

不同濃度5-FU處理OP9細胞后，細胞受到不同程度的損傷，與空白對照組比較，差異有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表1。

表1　5-FU對OP9細胞存活率的影響（±s，n=6）

表1　5-FU對OP9細胞存活率的影響（±s，n=6）

注：與空白對照組比較，*P＜0.01；5-FU：5-氟尿嘧啶

組別　5-FU終濃度（μg/mL）　24 h A450　　存活率（%）48 h A450　　存活率（%）空白對照組5-FU組0 12.5 25 50 100 200 0.5518±0.0087 0.4382±0.0118*0.4224±0.0107*0.4126±0.0127*0.3980±0.0071*0.3886±0.0112*100.00 78.98 76.55 74.67 72.13 70.43 0.5758±0.0141 0.4418±0.0052*0.4170±0.0090*0.4074±0.0087*0.4026±0.0132*0.3954±0.0150*100.00 76.72 72.42 70.75 69.92 68.67

考慮到5-FU對細胞損傷過多可能導致?lián)p傷難以修復，參考文獻［6-8］，結(jié)合鏡下所見細胞狀態(tài)及后續(xù)預實驗結(jié)果，本研究選用25 μg/mL 5-FU作用24 h作為造模條件。

2.2EGF對5-FU化療損傷OP9細胞存活率的影響

不同濃度的EGF可以不同程度地保護5-FU化療損傷的OP9細胞，使其存活率升高，其中10、20 ng/mL 的EGF與模型組比較差異有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表2。

表2　EGF對5-FU化療損傷OP9細胞存活率的影響（±s，n=6）

表2　EGF對5-FU化療損傷OP9細胞存活率的影響（±s，n=6）

注：與空白對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01；“-”表示無數(shù)據(jù)

組別　EGF濃度（μg/mL）　A450　　存活率（%）空白對照組模型組EGF組--1.25×10-32.5×10-35×10-31×10-22×10-20.8782±0.0266 0.6538±0.0256*0.6772±0.0113 0.6877±0.0197 0.6973±0.0364 0.7230±0.0315#0.7450±0.0285#100.00 74.44 77.11 78.30 79.40 82.32 84.83

2.3EGF對化療損傷OP9細胞凋亡的影響

根據(jù)“2.2”實驗結(jié)果，本研究進一步觀察了20 ng/mL EGF對化療損傷OP9細胞凋亡的影響，結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組細胞早期凋亡率顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），EGF干預后，實驗組細胞早期凋亡率較模型組明顯降低（P＜0.05）。見圖1。

圖1　表皮生長因子對化療損傷OP9細胞凋亡的影響

2.4EGF對化療損傷OP9細胞的Caspase-3活性的影響

與空白對照組比較，模型組細胞Caspase-3含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），EGF干預后，實驗組Caspase-3含量明顯降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3　EGF對化療損傷OP9細胞Caspase-3活性的影響（±s，n=3）

表3　EGF對化療損傷OP9細胞Caspase-3活性的影響（±s，n=3）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；“-”表示無數(shù)據(jù)；EGF：表皮生長因子

組別　EGF濃度（ng/mL）　Caspase-3（酶活力單位）空白對照組模型組實驗組--2 0 1009.00±56.57 1053.00±68.59*773.00±98.99#

2.5EGF對化療損傷OP9細胞NO、NOS的影響

與空白對照組比較，模型組細胞上清液中NO含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），EGF干預后，實驗組NO含量明顯降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），iNOS呈現(xiàn)相同的變化趨勢，而TNOS各組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表4。

表4　EGF對化療損傷OP9細胞NO、NOS的影響（±s，n=3）

表4　EGF對化療損傷OP9細胞NO、NOS的影響（±s，n=3）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；“-”表示無數(shù)據(jù)；EGF：表皮生長因子；NO：一氧化氮；NOS：一氧化氮合酶；iNOS：誘導型一氧化氮合酶；TNOS：總一氧化氮合酶

組別　EGF濃度（ng/mL）NO （A550）NOS（A530）iNOS　TNOS空白對照組模型組實驗組--2 0 0.0723±0.0005 0.0866±0.0055*0.0736±0.0035#0.1743±0.0102 0.2227±0.0261*0.1547±0.0037##0.2345±0.0332 0.2235±0.0289 0.2595±0.0728

3　討論

骨髓基質(zhì)細胞是成體骨髓中的一類多能干細胞，具有多向分化的潛能，可以分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等［9-10］。骨髓基質(zhì)干細胞的這種特性，使其處于一種活躍分裂狀態(tài)，也常常成為化療藥物攻擊的對象而被“誤傷”。因此，本實驗設計選用5-FU作為損傷骨髓基質(zhì)細胞的化療藥物，模擬臨床化療損傷過程，首次摸索建立了5-FU損傷小鼠骨髓基質(zhì)細胞的化療損傷模型。研究結(jié)果顯示，不同濃度5-FU處理OP9細胞后，細胞受到不同程度的損傷。

本研究首次觀察了EGF對化療損傷小鼠骨髓基質(zhì)細胞是否具有保護作用。研究結(jié)果顯示，不同濃度的EGF可以不同程度地保護5-FU化療損傷的OP9細胞，使其存活率升高。細胞凋亡研究結(jié)果顯示，EGF可顯著降低化療損傷OP9細胞早期凋亡率，結(jié)果提示EGF的保護作用與細胞凋亡途徑有關。

對于NO與細胞凋亡，有學者［11］認為NO對不同細胞及同一種細胞的不同分化階段的凋亡作用有異質(zhì)性，在體內(nèi)，NO促進還是抑制細胞凋亡取決于其濃度、氧化還原的環(huán)境及細胞內(nèi)的保護機制。本研究結(jié)果顯示5-FU刺激后促使骨髓基質(zhì)細胞NO合成顯著增多，且iNOS表達亦顯著升高，NO的含量高低與iNOS表達水平相一致，與TNOS無明顯相關性。因此，筆者認為5-FU刺激后骨髓基質(zhì)細胞大量分泌NO促進細胞自身的凋亡，EGF作用后，主要通過抑制iNOS的表達來減少NO的過度生成，從而減少凋亡，發(fā)揮其細胞保護作用。

Caspase-3激活是細胞凋亡的標志分子事件，已成為細胞凋亡通路研究的經(jīng)典指標［12-15］。本研究顯示，EGF可以降低Caspase-3含量，提示其對化療損傷的保護作用可能與降低Caspase-3含量相關。EGF保護化療損傷OP9細胞的具體作用機制尚待進一步深入研究。

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Protective effect of epidermal growth factor on the chemotherapy-injured mouse bone marrow stromal cells

DIAO Yuanming1，2ZHAN Zhen2▲ZHOU Tao2ZHANG Weiwei2ZHANG Liwei2DONG Wei2ZHANG Junfeng2
1.Schoo1 of Basic Medica1 Science，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangdong Province，Guangzhou 510006，China；2.Schoo1 of Basic Medica1 Science，Nanjing University of Chinese Medicine，Jiangsu Province，Nanjing 210023，China

R392.12

A

1673-7210（2016）04（c）-0008-04

國家自然科學基金資助項目（81473593、814734 58）；廣東省高等學校優(yōu)秀青年教師培養(yǎng)計劃項目（YQ2015 042）。

刁遠明，女，博士，副教授；研究方向：中西醫(yī)結(jié)合基礎、中醫(yī)藥基礎研究。

2016-01-07本文編輯：張瑜杰）