淫羊藿女貞子及其有效組分對地塞米松干預哮喘大鼠氣道病理改變的影響

唐秀鳳　年宏蕾　楊　燕　許利平　王秀娟　刻仁慧

1.首都醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，北京　100069；2.中醫(yī)絡病研究北京市重點實驗室，北京　100069

淫羊藿女貞子及其有效組分對地塞米松干預哮喘大鼠氣道病理改變的影響

唐秀鳳1年宏蕾1楊燕1許利平1王秀娟1刻仁慧1，2

1.首都醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，北京100069；2.中醫(yī)絡病研究北京市重點實驗室，北京100069

目的研究淫羊藿女貞子水提物及其有效組分配伍地塞米松全身干預對哮喘大鼠氣道病理改變的影響。方法42只SD大鼠按照隨機數(shù)字表法隨機分為7組，每組6只，正常對照組（A組）、哮喘模型組（B組）、地塞米松組（C組）、淫羊藿女貞子水提物組（D組）、地塞米松合淫羊藿女貞子水提物組（E組）、淫羊藿女貞子有效組分組（F組）、地塞米松合淫羊藿女貞子有效組分組（G組）。卵蛋白致敏并激發(fā)建立哮喘模型后給藥，C、E、G組腹腔注射地塞米松注射液（0.5 mg/kg）；D及E組灌胃給予淫羊藿女貞子水提物（4∶3，0.35 g/kg生藥）；F及G組灌胃給予淫羊藿女貞子有效組分（2∶3，100 mg/kg），均每日1次，共計2周。通過HE、Masson、PAS染色觀察肺組織的病理改變，并測量膠原纖維增生情況、標準化總管壁厚度（Wat）、標準化平滑肌厚度（Wam）以及上皮組織標準化杯狀細胞面積。 結果與B組比較，C、D、E、F、G組的Wat、Wam值、標準化膠原面積及標準化杯狀細胞面積均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；與C組比較，E、F組對纖維增生有顯著改善作用（P＜0.05），E、F、G組Wat顯著降低（P＜0.05）。結論地塞米松合用淫羊藿女貞子水提物或有效組分對改善哮喘氣道病理有一定的協(xié)同增效作用。

哮喘；淫羊藿；女貞子；地塞米松；實驗研究；病理學

［Abstract］Objective To study the combined effects of the aqueous extracts and active ingredients from Herba Epimedii and Fructus Ligustri Lucid and Dexamethasone on the patho1ogica1 changes in the asthmatic rats.Methods 42 SD rats were random1y divided into 7 groups according to the random number tab1e method，each group had 6 rats，inc1uding norma1 contro1 group（group A），asthma mode1 group（group B），Dexamethasone group（group C），aqueous extracts group（group D），Dexamethasone p1us aqueous extracts group（group E），active ingredients group（group F）and Dexamethasone p1us active ingredients group（group G）.Asthmatic mode1 was dup1icated by ova1bumin through sensitizing and cha11enging in rats and give medicine，C，E，G group were administered Dexamethasone injection（0.5 mg/kg）；D and E group were gavaged with Herba Epimedii，F(xiàn)ructus Ligustri Lucid aqueous extract（4∶3，0.35 g/kg crude drug）；F and G group were gavaged Herba Epimedii，F(xiàn)ructus Ligustri Lucid effective components（2∶3，100 mg/kg），once a week，for a tota1 of two weeks.The patho1ogy changes in the bronchia1 1ung tissue of the asthmatic rats were detected through Masson staining，HE staining and PAS staining.And the co11agen fiber hyperp1asia，standardized tota1 bronchia1 wa11 area（Wat），standardized smooth musc1e area（Wam），and standardized epithe1ia1 gob1et ce11 area were measured. Results Compared with group B，group C，D，E，F(xiàn) and G cou1d reduce the co11agen area，Wat，Wam and standardized epithe1ia1 gob1et ce11 area（P＜0.05 or P＜0.01）. Compared with group C，group E and F cou1d improve fibrop1asias（P＜0.05），and group E，F(xiàn) and G cou1d reduce Wat（P＜0.05）.Conclusion The combination of Herba Epimedii，F(xiàn)ructus Ligustri Lucid and Dexamethasonein may p1ay a protective ro1e in airway patho1ogica1 changes of asthma rats.

［Key words］Asthma；Herba Epimedii；Fructus Ligustri Lucidi；Dexamethasonein；Experimenta1 study；Patho1ogy

支氣管哮喘是一種氣道慢性炎癥性疾?。?］。糖皮質激素（g1ucocorticoids，GC）由于其強大的兔疫抑制和抗炎作用，是臨床上治療哮喘的首選藥［2］，但應用過程中出現(xiàn)的激素依賴、激素抵抗以及局部和全身性副作用卻難以避兔［3］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿女貞子水煎劑合用布地奈德吸入可抑制哮喘大鼠氣道炎癥及重塑的病理改變［4］；合用地塞米松能增強后者的抗炎作用，并抑制其不良反應［5-7］。本研究以淫羊藿女貞子水提物及主要有效成分為研究對象，探討與地塞米松合用對哮喘大鼠氣道病理改變的影響，以期為中西藥聯(lián)合應用治療哮喘，尤其是難治性哮喘提供實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1動物

雄性SPF級SD大鼠42只，月齡為（3±1）個月，體重（120±10）g，合格證號：SCXK（京）2012-0001，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。置于室溫為（25±2）℃，濕度為（20±5）%，晝夜明暗交替時間為12 h∶12 h，自由飲水、進食的SPF級動物房內(nèi)飼養(yǎng)。

1.2實驗藥物

淫羊藿水提物（批號：20130155）、女貞子水提物（批號：20130104），均由西安康威生物有限公司提供，提取率為1∶10。淫羊藿有效組分為總黃酮類，女貞子有效組分為總黃酮和齊墩果酸類。淫羊藿有效成分提取物：淫羊藿藥材切碎，用90%乙醇提取3次，合并提取液，回收至無醇沉，用石油醚萃取3次（除去葉綠素），棄去石油醚部分，水部分上D-101大孔樹脂，水洗到無色后，用90%乙醇洗脫，所得蒸干，即為淫羊藿總黃酮提取物。總黃酮含量以淫羊藿苷計為80%，主要包括淫羊藿苷，淫羊藿次苷Ⅰ，淫羊藿次苷Ⅱ，寶藿苷，朝藿定A、B、C等，提取率為2.5%。女貞子有效成分提取物：女貞子粉粹，75%乙醇加熱提取3次，合并提取液，回收到無醇，上AB-8大孔樹脂，水洗（除糖），棄去水液，再用75%乙醇沖洗，所得蒸干即為女貞子提取物。有效成分為總環(huán)烯醚萜和總黃酮類，含量分別以齊墩果酸和蘆丁計總含量＞80%，主要包括特女貞苷，女貞苷，橄欖苦苷，木樨欖苷二甲酯，女貞酸，新女貞苷，女貞果苷A、B、C、D，芹菜素-7-O-葡萄糖苷等，提取率為5%。

1.3主要試劑與儀器

卵蛋白（美國Sigma公司，批號：A5253-100g），氫氧化鋁凝膠（美國Sigma公司，批號：A8222-250mL），地塞米松磷酸鈉注射液（5 mg/支，國藥集團容生制藥有限公司，批號：H41020036）；尼康（Nikon）ECLIPSE 80i生物顯微鏡及NIS-E1ements BR 3.2圖像分析軟件（北京銳馳恒業(yè)儀器科技有限公司）。

1.4造模及給藥方法

SD大鼠隨機分為正常對照組（A組）、哮喘模型組（B組）、地塞米松組（C組）、淫羊藿女貞子水提物組（D組）、地塞米松合淫羊藿女貞子水提物組（E組）、淫羊藿女貞子有效組分組（F組）、地塞米松合淫羊藿女貞子有效組分組（G組），每組6只。參考文獻［8］，從第1天開始，除A組外，其余各組均造模。造模成功后，各造模組用1%的卵蛋白（OVA）氫氧化鋁溶液霧化30 min，A組霧化生理鹽水溶液，每周2次，直至實驗結束。實驗第22天開始給藥，C、E、G組腹腔注射地塞米松注射液（0.5 mg/kg）；D及E組灌胃給予淫羊藿女貞子水提物（4∶3，0.35 g/kg生藥）；F及G組灌胃給予淫羊藿女貞子有效組分（2∶3，100 mg/kg），均每日1次，共計2周。

1.5樣本采集與檢測

第36天麻醉處死動物。開胸，暴露心肺，快速取出肺組織連同氣管，結扎左組織器官，剪下左肺。切成厚度約3 mm的組織塊，置于10%的甲醛溶液內(nèi)固定24 h。常規(guī)石蠟包埋，制片。參考文獻［9］行HE染色及Masson染色，參考文獻［10］行PAS染色，在光鏡下進行觀察。

1.6圖像分析軟件測量

［11］拍攝每個樣本400倍光鏡下的3個視野。通過測量Masson染色后的上皮組織細胞面積及膠原纖維面積，計算標準化膠原纖維面積（膠原纖維面積/上皮組織細胞面積）；通過測量HE染色后的圖片，計算氣管基底膜周徑（Pbm）、標準化總管壁厚度（Wat）以及標準化平滑肌厚度（Wam）；通過測量PAS染色后的杯狀細胞面積及Pbm值，計算單位長度基底膜上的平均杯狀細胞面積（標準化杯狀細胞面積）。

1.7統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較根據(jù)方差齊性檢驗結果選擇LSD-t（方差齊）或Tamhane's T2（方差不齊）檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1各組大鼠膠原增生情況比較

與A組標準化膠原面積 ［（62.97±16.44）μm2/mm］比較，B組［（93.55±14.74）μm2/mm］大鼠膠原纖維增生明顯（P＜0.01）；與B組比較，各給藥組［C組：（59.79±9.91）μm2/mm，D組：（48.01±8.27）μm2/mm，E組：（44.07± 7.70）μm2/mm，F(xiàn)組：（43.81±9.76）μm2/mm，G組：（53.92± 12.96）μm2/mm］均明顯抑制膠原纖維增生（均P＜0.01）；與C組比較，E組、F組能進一步抑制膠原纖維增生（P＜0.05）。見圖1。

圖1　各組大鼠病理Masson染色（400×）

2.2各組大鼠Wat和Wam值比較

肺組織HE染色計量結果顯示：與A組比較，B 組Wat和Wam值均顯著性升高（均P＜0.01）；經(jīng)藥物治療后，與B組比較，5個給藥組均能顯著降低Wat及Wam值（P＜0.05或P＜0.01）；與C組比較，E組、F組和G組均能顯著降低Wat值（P＜0.05）。見表1、圖2。

表1　各組大鼠Wat、Wam值比較（μm2/μm，±s）

表1　各組大鼠Wat、Wam值比較（μm2/μm，±s）

注：與A組比較，**P＜0.01；與B組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與C組比較，▲P＜0.05

組別　　只數(shù)　Wat　Wam A組B組C組D組E組F組G組6666666 45.84±14.93 87.48±8.38**72.66±7.39△64.68±10.82△△55.58±14.60△△▲58.78±9.01△△▲57.85±10.98△△▲17.39±5.14 46.91±8.95**21.88±6.11△△15.05±8.63△△15.25±5.47△△18.78±6.28△△16.26±5.26△△

圖2　各組大鼠病理HE染色（400×）

2.3各組大鼠杯狀細胞增生比較

與 A組標準化杯狀細胞面積 ［（0.2548± 0.0665）μm2/mm2］比較，B組［（0.4067±0.0835）μm2/mm2］大鼠杯狀細胞增生顯著（P＜0.01）；與B組比較，5個給藥組［C組：（0.2755±0.0634）μm2/mm2，D組：（0.2532± 0.0507）μm2/mm2，E組：（0.2255±0.0336）μm2/mm2，F(xiàn)組：（0.2686±0.0787）μm2/mm2，G組：（0.2337±0.0531）μm2/mm2］肺組織杯狀細胞增生明顯緩解（均P＜0.01）。見圖3，封三。

3　討論

哮喘是一種復雜的異質性慢性炎癥性疾病，其特點是氣道炎癥和氣道重構，包括杯狀細胞和氣道平滑肌細胞增生、黏液分泌過多和嗜酸性粒細胞浸潤等［12］。GC是目前治療哮喘的首選藥物，但長期應用不可避兔產(chǎn)生局部或全身性副作用，甚至激素抵抗的發(fā)生，影響激素的抗炎作用。近年有研究發(fā)現(xiàn)，在GC應用的同時合用中藥，可產(chǎn)生協(xié)同增效的抗炎作用，并維持GC作用的敏感性，預防激素抵抗的發(fā)生［13-14］?，F(xiàn)代學者認為，外源性超生理劑量的GC類同于“壯火”，發(fā)越腎氣、腎精，致火旺陰傷，日久累及腎陽，最終形成陰陽兩虧［15-16］，防治GC的不良反應當以補腎中陰陽為基本立法。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，平補腎中陰陽的藥對淫羊藿女貞子煎劑能夠協(xié)同激素抗炎，并拮抗激素不良反應［17，5］。本研究以淫羊藿女貞子水提物及有效組分為研究對象，評價藥物協(xié)同激素對哮喘大鼠氣道炎癥、氣道重塑相關病理學改變的影響。

實驗結果提示，哮喘模型大鼠Masson染色涂片中膠原纖維明顯沉積，HE染色中Wat、Wam顯著增高，PAS染色中上皮杯狀細胞大量增生，表明哮喘模型出現(xiàn)以氣管壁及平滑肌增厚、膠原纖維及杯狀細胞增生為評價指標的氣道炎癥及氣道重塑的病理改變。經(jīng)過藥物治療后，5個治療組均明顯抑制膠原纖維沉積及杯狀細胞的增生，降低Wam、Wat值，提示各給藥組對哮喘氣道炎癥及氣道重塑的病理改變有良好的療效。且與單用地塞米松相比，合用中藥水提物及有效成分均能降低Wat值，合用中藥水提物對膠原纖維沉積的抑制顯著。提示在激素地塞米松應用的同時，合用平補陰陽中藥淫羊藿女貞子水提物或有效成分可產(chǎn)生一定程度的協(xié)同抗炎及抑制氣道重塑的作用，為今后進一步研究中西醫(yī)藥結合治療哮喘的作用機制提供了實驗基礎。

此外，值得注意的是，本研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿女貞子提取物組對膠原纖維增生和Wat的作用優(yōu)于地塞米松組。淫羊藿提取物主要為淫羊藿苷，文獻報道有類激素樣作用，能提高機體兔疫力，抗炎，從而減輕哮喘氣道炎癥，其作用與地塞米松類似［18-19］；女貞子提取物中的齊墩果酸等萜類，也具有明確的抗炎作用，對急慢性炎癥均有明顯抑制作用［20］。提示淫羊藿女貞子提取物具有的良好的抗炎作用可能是其對Wat改善作用的基礎。雖然GC由于具有良好的抗炎作用而一直是治療哮喘的首選藥物，但其對于哮喘的典型病理改變——氣道重塑的作用并不理想，而氣道重塑是哮喘反復發(fā)作難以治愈的重要原因。課題組前期研究已證實，淫羊藿女貞子煎劑對哮喘大鼠氣道重塑具有明顯的改善作用［17］。在本次實驗中采用的淫羊藿女貞子水提物及有效成分配伍研究中再次證實了其對膠原纖維的改善作用，尤其是有效成分配伍的作用優(yōu)勢，值得進一步展開研究，探討其作用機制，以期為研發(fā)中藥提供依據(jù)。

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Effects of combination of Herba Epimedii，F(xiàn)ructus Ligustri Lucid and Dexamethasone on the pathological changes in asthmatic rats

TANG Xiufeng1NIAN Honglei1YANG Yan1XU Liping1WANG Xiujuan1LIU Renhui1，2
1.Schoo1 of Traditiona1 Chinese Medicine，Capita1 Medica1 University，Beijing100069，China；2.Beijing Key Laboratory of Traditiona1 Chinese Medicine Co11atera1 Disease Theory Research，Beijing100069，China

R285.5；R256.12

A

1673-7210（2016）04（c）-0004-04

國家自然科學基金資助項目（81373814）；北京中醫(yī)藥薪火傳承“3+3”工程二室一站建設項目（2012-SZ-C-42）；北京市屬高等學校高層次人才引進與培養(yǎng)計劃項目（CIT& TCD201504097）。

唐秀鳳（1992-），女，山東萊蕪人，首都醫(yī)科大學2015級中醫(yī)藥學院中藥學專業(yè)在讀碩士研究生；研究方向：中藥及復方的藥效及作用機制。

劉仁慧（1974-），女，山東煙臺人，醫(yī)學博士，副教授，碩士生導師；研究方向：中藥及復方的藥效及作用機制。

2016-01-21本文編輯：程 銘）