富血小板血漿制備方法穩(wěn)定性的研究

潘紅娟，王雅麗，呂　爽，劉鐵梅

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 輸血科，吉林 長(zhǎng)春130033)

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富血小板血漿制備方法穩(wěn)定性的研究

潘紅娟，王雅麗，呂爽，劉鐵梅*

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 輸血科，吉林 長(zhǎng)春130033)

富血小板血漿(platelet rich plasma，PRP)含有超過(guò)生理濃度數(shù)倍的血小板，作為一種自體血來(lái)源的產(chǎn)品，因獲取過(guò)程創(chuàng)傷較小、制備簡(jiǎn)便及具有生物學(xué)治療潛能等方面的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于組織再生、創(chuàng)面修復(fù)、感染治療和功能重建等領(lǐng)域[1，2]。但目前實(shí)驗(yàn)及臨床大都使用自體血液提取生長(zhǎng)因子，這無(wú)疑會(huì)對(duì)患者機(jī)體形成二次創(chuàng)傷[3]，為了用盡可能少的血液制備出血小板含量較高且能滿(mǎn)足臨床需要量的PRP，本文將對(duì)PRP的制備方法提供新的參考。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)標(biāo)本

取15例健康成年男性自愿者的外周血各40 ml，年齡 18-50歲，平均34歲。其納入標(biāo)準(zhǔn)為 ：①血紅蛋白>120 g/L，血小板>100×109/L。②采血前5 d 內(nèi)未服用影響血小板功能和凝血系統(tǒng)的藥物。③無(wú)傳染性疾病、相關(guān)血液疾病、嚴(yán)重心血管疾病及感染等。所有自愿者知情并同意采血用于本實(shí)驗(yàn)。

1.2主要試劑與儀器

一次性采血袋(天津金耀氨基酸有限公司)，50 ml無(wú)菌離心管(Thermo scientific公司)，20 ml一次性注射器(山東新華安得醫(yī)療用品有限公司)，9#腰椎穿刺針(蘇州偉康醫(yī)療器械有限公司)，一次性塑料管(江蘇康健醫(yī)療用品有限公司)；TDZ5-WS 臺(tái)式低俗離心機(jī)(湖南赫西儀器裝備有限公司)，蘇凈安泰超凈工作臺(tái)(北京華威興業(yè)科技有限公司)，BC-6800 全自動(dòng)血液分析儀(上海同舸醫(yī)療器械有限公司)。

1.3PRP 制備方法

1.3.1制備PRP

將200 ml一次性采血袋中的CPD-A抗凝劑除去22 ml，使其剩余6 ml；用裝有 5 ml抗凝劑的 一次性采血袋于每例志愿者肘前靜脈采血40 ml。搖勻后，取2 ml 抗凝血作全血細(xì)胞分析，3 ml用于細(xì)菌培養(yǎng)，40 ml 注入 50 ml無(wú)菌離心管中，剩余的1 ml血液棄掉，于常溫下制備 PRP。根據(jù)血液中各組分的沉降系數(shù)不同，以660 g/min 離心10 min 后，全血分為 3 層，上層為上清液，下層為紅細(xì)胞，兩層交界處一淺黃色層即 PRP 層。用20 ml 注射器吸取下層紅細(xì)胞，約剩余紅細(xì)胞層(1±0.3) ml。將剩余血液以相同條件離心后，可見(jiàn)在底部紅細(xì)胞表面有白膜樣物質(zhì)，即為血小板和白細(xì)胞沉積層 ；其上部為透明的血漿層。再次以20 ml 注射器吸取上層大部分乏血小板血漿，保留離心管中約 (6±0.2) ml 血漿。靜置15 min后輕搖離心管約 5 min，使血小板充分重懸于剩余血漿中，即得到 PRP。上述除采血外，其他操作均在無(wú)菌室及超凈工作臺(tái)進(jìn)行。

1.3.2血細(xì)胞分析

分別將2 ml 抗凝靜脈血和制備的 PRP 采用全自動(dòng)血液分析儀進(jìn)行血常規(guī)分析，測(cè)定血小板及白細(xì)胞濃度。

1.3.3細(xì)菌培養(yǎng)

對(duì)3 ml抗凝血及制備的PRP進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，一周后記錄結(jié)果，整個(gè)過(guò)程均在無(wú)菌條件下進(jìn)行。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，對(duì)全血和 PRP 中血小板及白細(xì)胞濃度比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，并對(duì)全血和 PRP 中血小板及白細(xì)胞濃度、PRP 中血小板和白細(xì)胞的回收率及富集系數(shù)采用 Pearson 檢驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)分析。

2結(jié)果

2.1血細(xì)胞分析

經(jīng)對(duì)全血及PRP中的血小板、白細(xì)胞的測(cè)定結(jié)果如圖1、圖2所示：由圖可以看出PRP中血小板及白細(xì)胞與全血中血小板及白細(xì)胞呈正相關(guān)趨勢(shì)，分析相關(guān)系數(shù)血小板計(jì)數(shù)r=0.938(P<0.01)，白細(xì)胞計(jì)數(shù)r=0.884(P<0.01)均呈顯著的正相關(guān)。

圖1　全血及PRP中的血小板計(jì)數(shù)

圖2　全血及PRP中的白細(xì)胞計(jì)數(shù)

經(jīng)計(jì)算得，全血和PRP中血小板濃度分別為(183.97±33.48)×109/L及(1009.91±219.43)×109/L，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=16.981，P<0.01)。全 血和 PRP 中 白 細(xì) 胞 濃 度 分 別 為(6.22±1.48)×109/L和(19.31±7.40)×109/L，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.272，P<0.01)。PRP 中血小板和白細(xì)胞濃度的變異系數(shù)分別為 21.73% 和38.32%(表1)。

表1　全血和PRP中血小板及白細(xì)胞計(jì)數(shù)的比較

計(jì)算 PRP 中血小板、白細(xì)胞的回收率和富集系數(shù)，富集系數(shù)=PRP 中血小板或白細(xì)胞濃度/全血中血小板或白細(xì)胞濃度，回收率 =PRP 中血小板或白細(xì)胞總數(shù)/全血中血小板或白細(xì)胞總數(shù)×100%。計(jì)算得PRP中血小板的富集系數(shù)為5.46±0.45，回收率為84.37±4.32；白細(xì)胞的富集系數(shù)為3.02±0.71，回收率為46.90±11.37。并且PRP 中白細(xì)胞的回收率和富集系數(shù)間顯著相關(guān)(r=0.947，P<0.01)，而PRP中血小板的回收率和富集系數(shù)間相關(guān)性較差(r=0.502，P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2　PRP中血小板和白細(xì)胞富集系數(shù)及回收率的比較

2.2全血和PRP的細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果

細(xì)菌培養(yǎng)1周，所用培養(yǎng)結(jié)果均為陰性。

3討論

自上世紀(jì)90年代富血小板血漿技術(shù)問(wèn)世以來(lái)，富血小板血漿逐漸成為組織工程領(lǐng)域尤其是骨創(chuàng)傷缺損修復(fù)方面的研究熱點(diǎn)[4]，并在臨床中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，同時(shí)也出現(xiàn)了多種富血小板血漿的制備方法。經(jīng)典的制備方法有(1)Anitua[5]法 ：160 g離心6 min一次離心法，(2)Landersberg[6]法： 兩次均為200 g離心10 min的二次離心法；(3)Aghaloo[7]法：分兩次離心，第一次215 g離心10 min，第2次863 g離心10 min等；李明等[8]指出當(dāng)離心血量較大時(shí)，這些方法制備的PRP的血小板濃度并不理想，較大的血量需要較大的離心管直徑及較高的離心力。對(duì)于PRP中血小板的有效濃度，Giusti等[9]發(fā)現(xiàn)人肌腱細(xì)胞培養(yǎng)中血小板濃度在(500-1000)×109/L之間刺激細(xì)胞的增殖、遷移及膠原合成的作用最為顯著，當(dāng)血小板濃度為2 000×109/L和3 000×109/L時(shí)，PRP的促細(xì)胞增殖作用明顯減弱。同樣Graziani等[10]體外研究發(fā)現(xiàn)，PRP制劑對(duì)成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞的促增殖作用具有劑量依賴(lài)性；當(dāng)血小板計(jì)數(shù)為(800-1000)×109/L之間時(shí)能夠達(dá)到更好的促增殖作用。本實(shí)驗(yàn)采血量為40 ml，加入6 ml抗凝劑，其抗凝劑與全血的比例為1∶6.7，其血液被稀釋而使全血及PRP中血小板、白細(xì)胞計(jì)數(shù)均偏低。本實(shí)驗(yàn)中血小板的富集系數(shù)與回收率的相關(guān)系數(shù)r=0.502，并不顯著性相關(guān)(P>0.05)，可能是由于制備的PRP較多(1∶6.7)導(dǎo)致PRP的富集系數(shù)相對(duì)較低而回收率較高造成的。但PRP中血小板濃度(1009.91±219.43)×109/L、富集系數(shù)(5.46±0.45)及PRP的量尚可滿(mǎn)足臨床需要。此實(shí)驗(yàn)采用二次離心法，兩次均為660 g離心10 min，避免了離心力過(guò)大離心時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致血小板活化及生長(zhǎng)因子的過(guò)早釋放。

白細(xì)胞中含有中性粒細(xì)胞，單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，在機(jī)體的宿主防御中發(fā)揮著重要作用。中性粒細(xì)胞被病原體，毒素等激活后，生成具有高度殺菌活性的次氯酸和其它的活性氧衍生物，及其胞內(nèi)的多種水解酶對(duì)病原體或異物具有消化作用；并且單核細(xì)胞的吞噬作用及淋巴細(xì)胞的免疫功能均對(duì)機(jī)體具有保護(hù)作用[11]。目前對(duì)于PRP中白細(xì)胞的含量及有無(wú)并沒(méi)有明確的要求。Wasterlain等[12]表示理想的骨科PRP制備應(yīng)該有高比率的血小板和白細(xì)胞，從而合成代謝大于分解代謝，以利于骨折的愈合。但也有報(bào)道稱(chēng)富白細(xì)胞PRP用于治療跟腱炎可能會(huì)增加患者的局部疼痛[13]。本實(shí)驗(yàn)PRP中白細(xì)胞的濃度為(19.31±7.40)×109/L，富集系數(shù)為3.02±0.71，其在各種臨床疾病中的作用還有待進(jìn)一步的試驗(yàn)與研究。

本實(shí)驗(yàn)的優(yōu)缺點(diǎn)分析(1)第1次離心后采用去除紅細(xì)胞，第2次離心后去除上層的P-PRP的方法，減少了多次抽吸血小板及轉(zhuǎn)移試管對(duì)血小板的刺激，從理論上降低了血小板的活化；(2)由于不同疾病、不同性別患者的紅細(xì)胞壓積的不同，第1次離心后去除紅細(xì)胞的體積并不相同，本實(shí)驗(yàn)用20 ml的離心管吸取紅細(xì)胞，最終使管底剩余約(1±0.3)ml的紅細(xì)胞，保證了每次制備的PRP中血小板的數(shù)量及PRP的有效體積，并減少沉降在紅細(xì)胞層的血小板的丟失，但同時(shí)使PRP中紅細(xì)胞的量增加。(3)本實(shí)驗(yàn)為了盡可能的減少對(duì)患者的二次傷害，全血中加入抗凝劑的體積相對(duì)較大且制備的PRP的量也較大，這使得全血及PRP中血小板及白細(xì)胞的濃度均偏低。

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基金項(xiàng)目：吉林省衛(wèi)計(jì)委項(xiàng)目(20152004)

*通訊作者

文章編號(hào)：1007-4287(2016)06-1008-03

作者簡(jiǎn)介：劉鐵梅(1965-).女，博士，教授、主任醫(yī)師，輸血科主任，主要從事臨床輸血工作。

(收稿日期：2015-06-28)