肝原位瘤切除術對小鼠一般狀態(tài)和免疫功能的影響

趙　彤，呂　燦，韓夢飛，張　展，王傅喆，黃　楓，陳　泉，方凡夫，李　柏

(第二軍醫(yī)大學 中醫(yī)系，上海200433)

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肝原位瘤切除術對小鼠一般狀態(tài)和免疫功能的影響

趙彤，呂燦，韓夢飛，張展，王傅喆，黃楓，陳泉，方凡夫*，李柏*

(第二軍醫(yī)大學 中醫(yī)系，上海200433)

摘要：目的觀察肝原位瘤切除術對小鼠一般狀態(tài)和免疫功能的影響。方法對小鼠進行肝原位瘤切除術，觀察手術對小鼠術后不同時間節(jié)點自發(fā)活動度，淋巴細胞增殖能力，CD4+/CD8+比例等指標的影響。結(jié)果與正常小鼠相比，術后第1天小鼠自發(fā)活動度減小，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；術后第1天和第3天小鼠淋巴細胞增殖能力均小于正常小鼠，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；術后第7天及正常小鼠淋巴細胞CD4+/CD8+比值均大于術后第1天小鼠，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。結(jié)論肝原位瘤切除術對小鼠造成了較大的應激損傷，產(chǎn)生了免疫抑制，小鼠在術后與人類圍手術期相似，也需要一定的時間逐步恢復正常狀態(tài)。

關鍵詞：小鼠；肝原位瘤切除術；自發(fā)活動；免疫功能

(ChinJLabDiagn,2016,20:0883)

癌癥在我國已成為各類疾病死因之首，原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC，簡稱肝癌)是其中惡性程度極高，預后極差的惡性腫瘤，且與主要癌癥的下降趨勢相反，隨著慢性肝炎、肝硬化、肥胖發(fā)生率的升高，肝癌的死亡率有所上升[1]。目前，在肝癌的治療手段上，最行之有效的手段依然是通過傳統(tǒng)的手術切除，其對于患者預后，生存期的延長都有所幫助[2]。盡管如此，除利用手術方法外，對于肝癌的治療措施依然有限，患者的5年生存率依然沒有實質(zhì)性的提高，而其根本原因還在于利用手術治療后依然有較高的復發(fā)可能。據(jù)相關機構(gòu)統(tǒng)計，肝癌在通過手術切除后5年的復發(fā)率依然高于60%，小肝癌經(jīng)過完整切除后也有40%以上的復發(fā)率。研究顯示肝癌術后復發(fā)與患者免疫功能有著高度相關性，圍術期應激反應可抑制患者免疫功能，導致術后腫瘤轉(zhuǎn)移的風險增加[3]。因此，如何避免肝癌的復發(fā)和轉(zhuǎn)移成為治療肝癌的重點，而改善肝癌患者圍手術期免疫功能對于提高肝癌患者的長期存活率具有重要意義。但是，肝癌術后圍手術期小鼠免疫功能如何恢復尚缺乏相關資料。本研究擬在圍手術期內(nèi)術后不同時間節(jié)點觀察小鼠一般狀態(tài)，檢測小鼠免疫功能變化，為圍手術期內(nèi)如何改善小鼠免疫功能等臨床研究提供前期參考。

1材料與方法

1.1實驗動物與分組

健康雄性ICR 小鼠30只,6-8 周齡,體重(20±2)g/只,由上海斯萊克實驗動物有限公司提供。于清潔級環(huán)境中飼養(yǎng)，恒濕(相對濕度50%)，恒溫(室溫22℃)，光照06:00-18:00，分籠飼養(yǎng)，自由飲水及進食，鼠籠規(guī)格為25 cm*15 cm*18 cm，每籠飼養(yǎng)5只，無菌手術在第二軍醫(yī)大學實驗動物中心屏障動物實驗設施進行。將小鼠隨機分為6組，每組5只，即正常小鼠和術后小鼠，術后小鼠分別在術后第1天，第3天，第5天，第7天，第9天處死。

1.2小鼠肝原位瘤切除術

將H22細胞進行計數(shù)，用PBS懸浮至1-3×106個/ml，腹腔注射接種0.4 ml/mouse至第一代小鼠，8-9 d后當觀察到第一代種鼠腹部膨隆，即可傳代，傳代時取1 ml注射器，種鼠腹部消毒后直接將針頭插入抽取0.5 ml腹水，用PBS3-6倍稀釋后注入第二代小鼠體內(nèi)，6-7 d后傳代，三代后可用PBS將腹水中H22細胞懸浮至2×106個/ml，0.1 ml/mouse于遠端進針于小鼠左前肢，約10 d后腫瘤長至1 cm時進行原位移植。接種前首先取出，確保操作在無菌狀態(tài)下進行，然后在RPMI-1640溶液中將外周纖維組織及血管清除干凈，并且將中央壞死組織剔除，將魚肉狀組織切成2 mm×2 mm瘤塊，放置一邊備用，且組織要在2 h內(nèi)用完。取肝內(nèi)隧道植入法[4]，用1%戊巴比妥鈉麻醉，采用腹腔麻醉，劑量按小鼠體重的60 mg/kg計算，將小鼠固定在鼠板上，采用仰臥位，腹部皮膚去毛并消毒，用手術剪沿腹中線剪開，暴露肝臟左外肝葉。用顯微外科鑷在肝左外葉中間部位沿肝葉平面約20°角輕輕戳一個約3 mm深度的隧道，棉簽局部輕壓止血后夾取瘤塊，小心送入，止血。縫合并關腹，涂抹少量青霉素，預防感染。腫瘤種植10 d后沿原切口進腹，在預定切緣后方，用5-0無創(chuàng)帶針線結(jié)扎縫合肝左葉，并切除荷瘤的肝左外葉部分，切緣距腫瘤邊緣大于0.5 cm。手術過程中及術后保證室內(nèi)溫度，并用保溫毯和碎木屑及時給小鼠保溫，避免由于溫度過低導致小鼠無法復溫而致的小鼠死亡。

1.3檢測指標

1.3.1自主活動度每次實驗均在上午9時對小鼠進行自主活動度檢測，以便觀察手術對小鼠刺激的最大影響。將小鼠按標號依次放置于自發(fā)活動儀箱底中心位置，一個自發(fā)活動箱內(nèi)放置一只小鼠，放置穩(wěn)妥后開始計時連續(xù)觀察并攝像記錄小鼠活動情況，5 min后停止，記錄其自發(fā)活動總路程。確保自主活動儀置于隔音，光強度溫和、濕度適宜的行為實驗室內(nèi)，減少環(huán)境對小鼠的影響，實驗。

1.3.2小鼠脾淋巴細胞收集頸椎脫臼處死小鼠， 75%乙醇中消毒后，超凈臺中無菌剝離小鼠脾臟，用 RPMI 1640 完全培養(yǎng)基沖洗兩次后將小鼠脾臟置于培養(yǎng)皿中研磨并將脾細胞懸液靜置5 min，取2 ml細胞懸液放入10 ml無菌離心管中，離心，1500 r/min*5 min。去上清，緩慢滴入淋巴細胞裂解液(1X)3 ml，反應1-2 min后加1 ml PBS終止反應，用移液槍混勻后離心1 500 r/min*5 min，加入4 ml 1640培養(yǎng)基洗滌1次，離心1 500 r/min *10 min。傾倒上清液，加入含10%胎牛血清的完全1640培養(yǎng)基或PBS。

1.3.3脾淋巴細胞增殖將上述制備好的脾淋巴細胞移入10 ml離心管中，加含10%胎牛血清的完全1640培養(yǎng)基調(diào)整至107cell/ml，接種在96孔板中，每孔100 μl，每組設四個副孔，共分10個組，即5組小鼠的脾淋巴細胞分為淋巴細胞組和淋巴細胞+刺激劑組。刺激劑為多克隆刺激劑刀豆蛋白A(concanavalin A,ConA)，其終濃度為5 μg/ml。適當細胞濃度后置入37℃，5%的CO2孵育箱中培養(yǎng)。

1.3.4脾淋巴細胞表面CD4+與CD8+的表達

將上述制備好的脾淋巴細胞移入10 ml離心管中，加PBS稀釋至106cell/ml后吸取1 ml至流式管中，加入相應抗體，4℃孵育30 min，離心1 500 r/min*5 min，加入PBS洗滌，離心后加入PBS上機檢測。

1.4統(tǒng)計學處理

2結(jié)果

2.1術后不同時間小鼠自發(fā)活動度的區(qū)別

表1　術后不同時期小鼠小鼠自發(fā)活動±s,n=5)

注：A:術后第1天，B:術后第3天，C：術后第5天，D：術后第7天，E：術后第9天，F(xiàn)：正常小鼠。下同。

與正常小鼠比較差異有統(tǒng)計學意義：*P<0.05

術后第1、3、5、7、9天小鼠及正常小鼠自發(fā)活動總路程見圖1、表1。由表1可見各組小鼠自發(fā)活動水平均小于正常小鼠，術后第7天組小鼠自發(fā)活動水平與正常組小鼠差異較前3組小，但結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計學分析后，僅術后第1天組小鼠與正常組小鼠自發(fā)活動度相比具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其他各組小鼠間均無統(tǒng)計學差異。

注：A:術后第1天，B:術后第3天，C：術后第5天，D：術后第7天，E：術后第9天，F(xiàn)：正常小鼠。

圖1小鼠自發(fā)活動檢測

2.2術后不同時間小鼠淋巴細胞增殖能力的區(qū)別

術后第1、3、5、7、9天小鼠淋巴細胞增殖能力見表2，正常小鼠為172.38±0.21%?？芍鹘M小鼠淋巴細胞增殖能力均小于正常小鼠，術后第1天組小鼠淋巴細胞增殖能力遠小于正常組小鼠組(P<0.01)，術后第3天組小鼠與正常組小鼠相比也存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)，其他各組小鼠間均無統(tǒng)計學差異。

表2　術后不同時期小鼠淋巴細胞增殖能力±s,n=5)

注：與正常小鼠比較差異有統(tǒng)計學意義：*P<0.05，ΔP<0.01

2.3術后不同時間小鼠CD4+/CD8+比例的區(qū)別

表3　術后不同時期小鼠CD4+/CD8+比例

注：與正常小鼠比較差異有統(tǒng)計學意義：ΔP<0.01；與D組比較差異有統(tǒng)計學意義：#P<0.01

注：A:術后第1天，B:術后第3天，C：術后第5天，D：術后第7天，E：術后第9天，F(xiàn)：正常小鼠。

術后第一天組小鼠淋巴細胞CD4+/CD8+比值為1.61±0.33，正常組小鼠為5.46±1.07，兩者之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。且術后第7天組小鼠也高于術后第一天組小鼠，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表3，圖2。

3討論

圍手術期是圍繞手術的一個治療經(jīng)過，具體包括手術前期、手術中期、手術后期，其中，手術后期包括術后的7-12 d的一段時間[5]，圍術期患者的免疫功能往往因手術過程中引起的應激狀態(tài)等而受到抑制[6]。對腫瘤術后患者而言，短暫的術后免疫抑制期可能會對殘留的腫瘤細胞產(chǎn)生巨大的影響，大量動物實驗結(jié)果證實手術能促進腫瘤轉(zhuǎn)移，這些研究同時表明，在手術中受到越大的創(chuàng)傷，則術后越有可能發(fā)生其他部位的轉(zhuǎn)移[7]。小鼠肝原位瘤切除術模型中肝癌株的形態(tài)特點和病理組織變化較人類肝細胞癌而言極其類似，與其他模型相較[8-11]，較好的模擬人類肝細胞癌的手術過程。有大量文獻報道這一模型的建立及生物學特性，該模型中對小鼠進行兩次開腹手術，對小鼠造成巨大創(chuàng)傷，小鼠在圍手術期免疫抑制在何時得以改善卻缺乏相關研究。本研究通過制備小鼠肝原位瘤模型[4]，觀察術后小鼠的一般狀態(tài)和免疫功能發(fā)現(xiàn)，小鼠在術后第1天一般狀態(tài)較差，與正常小鼠相比自發(fā)活動能力較弱，體內(nèi)的淋巴細胞增殖減弱，CD4+/CD8+比例失調(diào)。在第7天后，雖然各個指標顯示仍較正常小鼠有較大差距，但和第1天、第3天、第5天比較，有很大程度的改善。

在已有術后康復評價指標中，自發(fā)活動度作為行為學經(jīng)典指標被廣泛應用[12,13]，其測量是通過記錄視頻并跟蹤評估光電束斷裂的頻率或小鼠活動的距離進行的。自發(fā)活動度檢測作為無創(chuàng)檢測手段，常用于檢測小鼠自發(fā)活動度和探尋度，已被廣泛應用于評價各種實驗干預如基因改變和藥物干預。且相較于小鼠狀態(tài)評分表，如是否顫抖，是否舔舐傷口，步態(tài)是否正常等更客觀，可量化。此外，術后第1天，第3天，第5天，小鼠自發(fā)活動度較第7天和正常小鼠有一定差距，可能是由于術后傷口疼痛和術間麻醉對小鼠造成影響，降低其自發(fā)活動度。在7 d后，小鼠自發(fā)活動度仍低于正常小鼠，但差距較小，第7天和其9天波動不大，說明可能小鼠雖仍未完全恢復，但已與正常狀態(tài)類似，可進行如給藥，運動等相應后續(xù)干預。

手術創(chuàng)傷能介導不同程度的免疫功能抑制，包括CD3+下降及CD4+/CD8+比值失調(diào)，這是術后感染發(fā)生率上升的重要原因[14]。本研究發(fā)現(xiàn)小鼠在術后機體淋巴細胞增殖減少，CD4+/CD8+比值失調(diào)的情況，表明手術創(chuàng)傷和術后疼痛等應激反應對免疫系統(tǒng)產(chǎn)生了抑制作用，在第1天，第3天尤為明顯，與正常組小鼠淋巴細胞增值能力相較差異具有統(tǒng)計學意義，且第7天后，小鼠的免疫功能逐步上升恢復，狀態(tài)較為穩(wěn)定，CD4+/CD8+比例與術后第1天組小鼠相比較具有統(tǒng)計學意義。

本研究結(jié)果表明，小鼠術后自發(fā)活動度為代表的行為學差異較正常小鼠有一定差距，術后第1天較為明顯，且免疫功能也有所下降，尤其是第1天和第3天，但也可以看到，小鼠的免疫功能在逐步恢復，尤其是術后第7天，與第1天小鼠的免疫功能差距較大。但在本實驗中，除術后第1天組和術后第3天組小鼠較正常組小鼠，第1天組小鼠和第7天組小鼠部分指標有差異之外，其他組小鼠之間的CD4+/CD8+等各項指標的差異并無統(tǒng)計學意義，這可能由于本實驗小鼠例數(shù)較少，檢測指標仍有待完善，以全面觀察小鼠免疫功能及其他狀態(tài)恢復情況。

綜上所述，肝原位瘤切除術對小鼠造成了較大的應激損傷，產(chǎn)生了免疫抑制，小鼠在術后與人類圍手術期相似，也需要一定的時間逐步恢復正常狀態(tài)。圍手術期內(nèi)，在小鼠免疫功能低谷予以干預和在小鼠免疫功能峰值予以干預，對免疫功能的恢復是否有差異還需進一步實驗探尋。

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基金項目：國家自然科學基金項目(編號：81503632)

*通訊作者

文章編號：1007-4287(2016)06-0883-04

中圖分類號：R735.7

文獻標識碼：A

(收稿日期：2015-12-09)

The influence of the resection of the tumor in situ liver on general state and the immune function in mice

ZHAOTong,LüCan,HANMeng-fei,etal.

(DepartmentofTCM,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433，China)

Abstract:ObjectiveObserve the influence of the resection of the tumor in situ liver on general state and the immune function in mice.MethodsDo the resection of the tumor in situ liver in mice to observe the operation of spontaneous activity of mice after different time node,ability of lymphocyte proliferation and the influence of CD4+/CD8+ ratio and other indexes.ResultsCompared with the normal mice,spontaneous activity in mice reduce on the first postoperative day,with statistical significance(P<0.05);Compared with the normal mice,the reproductive capacity of lymphocytes in mice reduce on the first and third day,with statistical significance(P<0.05);Compared with the first postoperative day mice,CD4+/CD8+ lymphocytes in mice increase on the seventh postoperative day and the normal mice,with?statistical significance(P<0.01).ConclusionResection of the tumor in situ liver caused greater stress injury and immunosuppression in mice.Mice are similar to human perioperative after surgery,also need a certain amount of time gradually returned to normal state.

Key words:Mice;Resection of the tumor in situ liver;Spontaneous activity;Immune function