促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑對(duì)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化的影響

焦婷婷,劉玉杰,高　原,李　星,惠　寧

(第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院 婦產(chǎn)科,上海200433)

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促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑對(duì)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化的影響

焦婷婷,劉玉杰,高原,李星,惠寧*

(第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院 婦產(chǎn)科,上海200433)

摘要：目的研究促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑(GnRH-α)對(duì)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化的影響。方法體外原代培養(yǎng)人子宮內(nèi)膜細(xì)胞并構(gòu)建蛻膜化模型，用不同濃度的GnRH-α處理細(xì)胞，Real-Time PCR方法檢測(cè)標(biāo)志子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化程度的分子催乳素(prolactin,PRL)和胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-1(IGFBP-1) mRNA的表達(dá)，ELISA法檢測(cè)其在細(xì)胞上清液中的蛋白表達(dá)。結(jié)果10-8g/ml濃度，10-7g/ml濃度和10-6g/ml濃度的PRL mRNA表達(dá)均增加，10-7g/ml濃度和10-6g/ml IGFBP-1 mRNA的表達(dá)增加(P<0.05，P<0.01)；蛻膜化72 h 10-6g/ml濃度基質(zhì)細(xì)胞上清液中PRL 蛋白增加，10-7g/ml濃度上清液中IGFBP-1蛋白增加(P<0.05)。結(jié)論GnRH-α促進(jìn)了子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化PRL和IGFBP-1 mRNA的表達(dá)和上清液中PRL和IGFBP-1 蛋白的分泌。GnRH-α可以促進(jìn)對(duì)人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的蛻膜化。

關(guān)鍵詞：促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑；子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞；蛻膜化；PRL；IGFBP-1

(ChinJLabDiagn,2016,20:0879)

子宮內(nèi)膜蛻膜化是指子宮內(nèi)膜在雌、孕激素的作用下由增殖期向分泌期轉(zhuǎn)變的過(guò)程。子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞(endometrial stromal cells,ESCs)增殖，形態(tài)發(fā)生變化，從成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗪?、胞質(zhì)豐富的蛻膜化基質(zhì)細(xì)胞(decidual stromal cells,DSCs)。孕激素是子宮內(nèi)膜蛻膜化的始動(dòng)因素，多種因素共同參與其中，包括細(xì)胞因子類(lèi)、垂體激素、免疫細(xì)胞、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子等。其中催乳素(prolactin,PRL)和胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-1(insulin-like growth factor binding protein1,IGFBP-1)可以作為衡量蛻膜化程度的標(biāo)志分子[1-4]。蛻膜化是妊娠建立的重要步驟，對(duì)胚胎植入的過(guò)程起著關(guān)鍵作用。子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞如果不能形成有效的蛻膜化，會(huì)導(dǎo)致胚胎著床的失敗。

促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑(GnRH-α)是將天然的促性腺激素結(jié)構(gòu)中某些氨基酸進(jìn)行置換，因此形成的化合物比天然的促性腺激素與垂體上GnRH受體結(jié)合的親和力更強(qiáng)，半衰期延長(zhǎng)，穩(wěn)定性強(qiáng)。大劑量使用時(shí)可以對(duì)垂體分泌的FSH和LH起到降調(diào)節(jié)作用，因此廣泛應(yīng)用于IVF-FT技術(shù)的控制性促排卵長(zhǎng)方案中，有研究發(fā)現(xiàn)GnRH-α不僅可以影響性腺激素的分泌，還可以直接作用于子宮內(nèi)膜，提高胚胎移植的成功率。但是GnRH-α對(duì)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的蛻膜化有怎樣的作用，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究GnRH-α對(duì)人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的蛻膜化的影響，探討其在胚胎移植中的作用。

1材料與方法

1.1主要材料與試劑人子宮內(nèi)膜組織由長(zhǎng)海醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心提供，DNA酶Ⅰ型購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，Ⅱ型膠原酶購(gòu)于WASHINGTON公司，胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基均購(gòu)于美國(guó)Gibcol公司，醋酸甲羥孕酮(Medroxyprogesteroneacetate,MPA)和8-Br-Camp均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司,PCR試劑盒購(gòu)于美國(guó)Bio-med公司，ELISA試劑盒購(gòu)于北京碧云天生物科技公司，Triporelin(曲普瑞林)購(gòu)于德國(guó)輝凌制藥公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)和蛻膜化模型的構(gòu)建按差時(shí)貼壁法原代培養(yǎng)人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞，取宮腔鏡下刮取的少量人子宮內(nèi)膜組織，沖洗標(biāo)本，剪碎。將其置于F12 DMEM培養(yǎng)液配置的消化液中(DNA酶，終濃度為0.5 mg/ml；Ⅱ型膠原酶，終濃度為1.5 mg/ml；BSA，終濃度為1 mg/ml)，37℃，120-130轉(zhuǎn)/分，搖動(dòng)水浴消化40-60 min。收集上層液體，終止消化，600 rpm×3 min離心沉淀未消化完全的組織。收集上清液，以1 100 rpm×10 min離心沉淀細(xì)胞。棄上清液，重懸細(xì)胞沉淀，經(jīng)400目(孔徑38 μm)不銹鋼細(xì)胞濾網(wǎng)過(guò)濾。將濾液接種25 cm細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。貼壁30-40 min后，更換培養(yǎng)液以去除不貼壁的腺上皮細(xì)胞和血細(xì)胞(基質(zhì)細(xì)胞在40 min內(nèi)貼壁，腺上皮細(xì)胞貼壁時(shí)間大于30 min)。48 h后全量更換培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)達(dá)到瓶底的70%-80%時(shí)進(jìn)行傳代。對(duì)P1代的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行蛻膜化誘導(dǎo)，誘導(dǎo)方法為加入10-7M MPA和5×10-4M 8-Br-cAMP(M+A)，誘導(dǎo)72 h。

1.2.2Real-Time PCR方法檢測(cè)標(biāo)志子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化程度的分子PRL和IGFBP-1 mRNA的表達(dá) 對(duì)P1代的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞按M+A法進(jìn)行蛻膜化誘導(dǎo)，培養(yǎng)72 h后，按Trizol說(shuō)明書(shū)的步驟提取基質(zhì)細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，稀釋后按Real-Time PCR試劑盒方法進(jìn)行PRL和IGFBP-1基因的擴(kuò)增。跟據(jù)GeneBank檢索人PRL和IGFBP-1的mRNA序列，應(yīng)用Primer Premier5.0軟件并參考相關(guān)文獻(xiàn)，選取引物。PRL引物序列：上游：5＇-CAC TAC ATC CAT AAC CTC TC-3＇下游：5＇-ATG CTG ACT ATC AAG CTC AG-3＇，IGFBP1引物序列:上游：5＇-TAT GAT GGC TCG AAG GCT CTC-3＇,下游：5＇-GTA GAC GCA CCA GCA GAG TC-3＇。將合成的cDNA產(chǎn)物加入體系中進(jìn)行PCR反應(yīng)，分別擴(kuò)增樣本目的基因和管家基因β-actin，利用Ct值進(jìn)行定量分析，檢測(cè)mRNA表達(dá)量的變化。

1.2.3ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞上清液中PRL和IGFBP-1蛋白的分泌對(duì)P1代的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞體外誘導(dǎo)蛻膜化培養(yǎng)，按(M+A)法。分別于24、48和72 h收集細(xì)胞上清液，按ELISA試劑盒稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，留取的細(xì)胞上清液，4°C，1 000 r/min，離心20 min；依次加入樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，再加入所需的一抗，經(jīng)孵育，洗滌后加二抗，37℃孵育1 h，用PBS洗滌3次，每次間隔2 min，分別加入ABC工作液，37°C孵育30 min，用PBS洗滌5次，每次間隔2 min，加入TMB顯色，孵箱中孵育20-30 min，避光顯色，加入終止液終止顯色。用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm測(cè)各孔OD值。

2結(jié)果

2.1原代子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)及蛻膜化模型的構(gòu)建對(duì)原代培養(yǎng)的人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞P1代進(jìn)行蛻膜化誘導(dǎo)，加入10-7M MPA和5×10-4M 8-Br-cAMP(M+A)。如圖1所示：A圖為原代培養(yǎng)的人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞呈梭狀，為分散型生長(zhǎng)。B圖為蛻膜化誘導(dǎo)72 h后的人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞增大圓潤(rùn)，增殖明顯，排列緊密。均在普通光學(xué)顯微鏡下100×下觀(guān)察。

圖1　子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞

2.2Real-Time PCR方法檢測(cè)GnRH-α對(duì)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化中PRL和IGFBP-1 mRNA的表達(dá)的影響原代培養(yǎng)的人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞P1代進(jìn)行蛻膜化誘導(dǎo)72 h，誘導(dǎo)同時(shí)加入不同濃度的GnRH-α(曲普瑞林)處理細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為4組，①空白對(duì)照組；②10-8g/ml濃度組；③10-7g/ml濃度組；④10-6g/ml濃度組；用Real-time PCR方法檢測(cè)蛻膜化中PRL和IGFBP1 mRNA的表達(dá)，結(jié)果如圖2和圖3所示:PRL mRNA隨著GnRH-α濃度的升高而表達(dá)增加，在10-8g/ml濃度組和10-7g/ml濃度組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P<0.05 vs空白對(duì)照組)；在10-6g/ml濃度組差異顯著(**P<0.01 vs 空白對(duì)照組)。IGFBP-1 mRNA在10-8g/ml濃度組表達(dá)降低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在10-7g/ml濃度組表達(dá)增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P<0.05 vs 空白對(duì)照組)；在10-6g/ml濃度組差異顯著(**P<0.01 vs 空白對(duì)照組)。

圖2　　　　GnRH-α對(duì)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化中PRL mRNA的表達(dá)的影響

圖3　　　　GnRH-α對(duì)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化中IGFBP-1mRNA的表達(dá)的影響

2.3ELISA方法檢測(cè)GnRH-α對(duì)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化上清液中PRL和IGFBP-1蛋白分泌的影響原代培養(yǎng)的人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞P1代進(jìn)行蛻膜化誘導(dǎo)，加入不同濃度的GnRH-α(曲普瑞林)處理細(xì)胞，分別在蛻膜化24、48和72 h收集細(xì)胞上清液，用ELISA方法檢測(cè)上清液中PRL和IGFBP-1蛋白的分泌。實(shí)驗(yàn)分為3組，①空白對(duì)照組； ②10-7g/ml濃度組；③10-6g/ml濃度組；結(jié)果如圖4和圖5所示:10-6g/ml濃度組上清液中的PRL蛋白量在蛻膜化72 h較空白對(duì)照組增加(*P<0.05 vs 空白對(duì)照組)； 10-7g/ml濃度組上清液中的IGFBP-1蛋白量在蛻膜化72 h較空白對(duì)照組增加(*P<0.05 vs 空白對(duì)照組)。

圖4　GnRH-α對(duì)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化上清液中PRL蛋白表達(dá)的影響

圖5　GnRH-α對(duì)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化上清液中IGFBP-1蛋白表達(dá)的影響

3討論

胚胎的種植通常發(fā)生在受精后的3-5天，進(jìn)入宮腔的胚胎和子宮內(nèi)膜按照一定的時(shí)間和空間順序分泌相關(guān)蛋白和局部因子，達(dá)到相互識(shí)別，相互融合進(jìn)而完成著床的過(guò)程。這其中包括子宮內(nèi)膜蛻膜化，囊胚孵出后的定位、黏附和滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵入，直至整個(gè)胚胎包埋在子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中，臨床上稱(chēng)這一時(shí)期的子宮內(nèi)膜為“種植窗”期。胚胎這種嚴(yán)格的時(shí)空定位現(xiàn)象提示胚胎激活和子宮內(nèi)膜對(duì)其接受性同步與否是其著床成功的關(guān)鍵因素，對(duì)于胚胎來(lái)說(shuō)，種植的第一道關(guān)口就是子宮內(nèi)膜的容受性，因此研究著床過(guò)程中子宮內(nèi)膜的蛻膜化對(duì)于臨床上輔助生殖技術(shù)中胚胎移植的成功具有重大的意義[5,6]。

目前的研究表明子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的蛻膜化過(guò)程有多種細(xì)胞因子，多種因素共同參與。其中胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)第二信使的cAMP在蛻膜化中起著關(guān)鍵作用。cAMP可以與子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞表面相關(guān)受體結(jié)合,激活G蛋白信號(hào)通路，調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜的蛻膜化。在人體外子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的誘導(dǎo)中,cAMP能顯著促進(jìn)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞合成分泌泌乳素(PRL),因此目前蛻膜化模型的建立多采用cAMP與醋酸甲羥孕酮的聯(lián)合誘導(dǎo)[7]。本實(shí)驗(yàn)也是采用這一經(jīng)典方法構(gòu)建了人體外子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化模型。

GnRH-α的降調(diào)節(jié)作用目前廣泛應(yīng)用于子宮內(nèi)膜異位癥患者的治療和IVF-ET技術(shù)控制性促排卵的長(zhǎng)方案中。研究表明子宮內(nèi)膜異位癥患者的在位子宮內(nèi)膜蛻膜化程度降低，是導(dǎo)致不孕的因素之一[8-10]。臨床上異位癥患者在接受GnRH-α治療后自然妊娠率增加，對(duì)于因不孕接受IVF-ET治療的異位癥患者選擇長(zhǎng)方案GnRH-α降調(diào)節(jié)后妊娠率較別的方案增加。這說(shuō)明GnRH-α可能對(duì)異位癥患者子宮內(nèi)膜的蛻膜化具有一定的作用。另外多項(xiàng)研究表明在IVF-ET術(shù)中接受凍融胚胎移植的患者，人工周期使用GnRH-α進(jìn)行預(yù)處理后，其臨床妊娠率較對(duì)照組提高，胚胎停育和異位妊娠的發(fā)生率降低[11,12]。這提示我們GnRH-α有助于改善子宮內(nèi)膜的容受性，提高妊娠率，利于胚胎的早期發(fā)育。那么GnRH-α是怎樣作用于子宮內(nèi)膜，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)使用 GnRH-a預(yù)處理后影響了子宮內(nèi)膜上胞飲突 的形成時(shí)間，與自然周期相比，胞飲突的形成時(shí)間平均提前 1 到2 天[13,14]，因此影響了子宮內(nèi)膜種植窗的發(fā)生時(shí)間。

在本研究中，我們探討了GnRH-a對(duì)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化的影響，發(fā)現(xiàn)GnRH-a可以促進(jìn)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的蛻膜化，和上述結(jié)果都表明了GnRH-a能夠直接作用于子宮內(nèi)膜，影響其容受性。為GnRH-α用于治療子宮內(nèi)膜異位癥引起的不孕癥提供了的新理論支持，也為臨床上研究GnRH-α在IVF-ET術(shù)胚胎移植中的作用提供了新的研究方向。GnRH-α通過(guò)怎樣的機(jī)制調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的蛻膜化仍需要我們進(jìn)一步的研究。

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基金項(xiàng)目：上海市科委基金項(xiàng)目(09411966600)

*通訊作者

文章編號(hào)：1007-4287(2016)06-0879-04

中圖分類(lèi)號(hào)：R392

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

(收稿日期：2015-12-17)

The roles of gonadotropin-releasing hormone agonist (GnRH-α) in the decidualization of endometrial stromal cells(ESCs)

JIAOTing-ting,LIUYu-jie,GAOYuan,etal.

(DepartmentofObstetricsandGynecology,ChanghaiHospitalofSecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China)

Abstract:ObjectiveTo study the roles of gonadotropin-releasing hormone agonist (GnRH-α) in the decidualization of endometrial stromal cells(ESCs).MethodsCulture primary human endometrial stromal cells,and build the decidualed human endometrial stromal cells model in vitro，treated with different concentrations of GnRH-α,Using Real-Time PCR to detect the the expression PRL(prolactin) and IGFBP-1 (insulin-like growth factor binding protein1) mRNA,which is the marker of decidualization,ELISA was also used to detect its expression in the cell supernatant ResultsIn 10-8g / ml concentration,10-7g / ml concentration and 10-6g /ml PRL mRNA expression increased,in 10-7g / ml concentration and 10-6g / ml IGFBP-1 mRNA expression increased(*P<0.05,**P<0.01);after decidualized for 72 hours，in 10-6g / ml concentration PRL protein increased in the cell supernatant，in 10-7g / ml concentration IGFBP-1 protein increased (*P<0.05).ConclusionGnRH-α increase the expression of PRL and IGFBP-1 mRNA in the the decidualization of ESCs.and also increase the PRL and IGFBP-1 protein expression in the cell supernatant.GnRH-α can promot the the decidualization of ESCs.

Key words:gonadotropin releasing hormone agonist;endometrial stromal cells;decidual;PRL;IGFBP-1