白介素-6反式信號(hào)通路抑制劑改善大鼠急性胰腺炎肺損傷

張衛(wèi)中　辛棟軼　張丹婷　廖南生

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白介素-6反式信號(hào)通路抑制劑改善大鼠急性胰腺炎肺損傷

張衛(wèi)中辛棟軼張丹婷廖南生

318020浙江臺(tái)州，臺(tái)州市第一人民醫(yī)院普外科

急性胰腺炎(AP)是臨床常見的急腹癥，約20%～30%患者可發(fā)展成為以胰腺局部壞死和臟器功能衰竭為特征的重癥急性胰腺炎(SAP)。急性肺損傷(acute pancreatitis associated acute lung injury，APALI)是其最常見的并發(fā)癥，患者可出現(xiàn)低氧血癥、急性呼吸窘迫綜合征等臨床表現(xiàn)[1]。研究表明，白細(xì)胞介素6(IL-6)在APALI的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。IL-6根據(jù)其跨膜信號(hào)傳遞形式不同在炎癥中的作用也不同，其信號(hào)傳遞通路主要分為兩種，即經(jīng)典信號(hào)通路和反式信號(hào)通路[2]。目前眾多研究集中在經(jīng)典信號(hào)通路，很少涉及到IL-6反式信號(hào)通路。本研究采用人工合成的特異性抑制劑(sgp130Fc)阻斷該信號(hào)通路，闡明其在大鼠APALI發(fā)病中的保護(hù)作用。

一、材料及方法

1．動(dòng)物模型建立及分組：健康SD雄性大鼠72只，體重(247±35)g，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。按隨機(jī)表法將大鼠分為假手術(shù)組、ANP組、干預(yù)組，每組24只。大鼠急性壞死性胰腺炎(ANP)模型按照本課題組建立的經(jīng)膽胰管逆行注射5%牛黃膽酸鈉(Sigma公司)0.1 ml/100 g體重的方法制備[3]。假手術(shù)組注射等容積生理鹽水；干預(yù)組大鼠在制模前30 min腹腔注射sgp130Fc(江蘇弗泰生物科技提供)100 μg/kg體重(1 mg凍干粉溶于10 ml蒸餾水)。于造模后3、12、24 h分批處死大鼠，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)8只。

2．肺組織髓過氧化物酶(MPO)檢測(cè)：取肺組織0.1 g，置冰生理鹽水中洗凈后制備組織勻漿，4℃ 2 300 r/min離心30 min，取上清液0.1 ml加0.167 mol/L鄰聯(lián)茴香胺二鹽酸化物以及0.0005%過氧化氫混合液2.9 ml，在恒溫紫外分光光度計(jì)460 nm處連續(xù)記錄A460值1 min，以A460值·g-1·min-1表示MPO的活性[4]。

3．肺組織含水量測(cè)定：取相同部位的肺組織100 mg，置70℃電熱干燥箱內(nèi)烘烤24 h，稱干重，以肺組織濕/干比重[(肺濕重-肺干重)/肺干重]表示肺組織含水量。

4．肺微血管通透性檢測(cè)：造模后12 h通過左股靜脈注射FITC-標(biāo)記的血清蛋白5.0 mg/kg體重(Sigma Chemical公司)，12 h后抽血，離心分離血清，-80℃保存；同時(shí)氣管內(nèi)插入18號(hào)血管導(dǎo)管，用4 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)灌洗肺泡腔，收集肺泡灌洗液(Balf)，重復(fù)3次。用熒光分光計(jì)分別測(cè)量血清和Balf的FITC熒光，激發(fā)光494 nm，發(fā)射光520 nm。以Balf與血清FITC的熒光率比值表示肺微血管滲透性。

5．大鼠肺組織病理學(xué)檢測(cè)：取剩余肺組織置液氮中保存。融化后常規(guī)行病理學(xué)檢查。參考Kusske等[5]和Mayer等[6]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行肺臟病理評(píng)分。

二、結(jié)果

1．肺組織MPO活性變化：假手術(shù)組大鼠肺組織MOP活性為(0.56±0.04)A460值·g-1·min-1；ANP 3、12、24 h組分別為(2.21±0.52)、(4.71±0.32)、(7.84±0.11)A460值·g-1·min-1，均顯著高于假手術(shù)組，且隨時(shí)間延長而增加；干預(yù)3、12、24 h組分別為(1.86±0.17)、(2.54±0.27)、(5.74±0.19)A460值·g-1·min-1，干預(yù)12、24 h組肺MOP活性均顯著低于ANP同時(shí)間點(diǎn)組，但仍顯著高于假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。

2. 肺組織含水量的變化：假手術(shù)組大鼠肺含水量為1.57±0.14，ANP 3、12、24 h組分別為3.79±0.21、3.93±0.14、4.11±0.07，均顯著高于假手術(shù)組，且隨時(shí)間延長而增加；干預(yù)3、12、24 h組大鼠肺組織含水量分別為3.47±0.15、3.19±0.11、3.75±0.14，干預(yù)組12、24 h組肺含水量均顯著低于ANP同時(shí)間點(diǎn)組，但仍顯著高于假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。

3．肺微血管通透性變化：假手術(shù)組、ANP 24 h組、干預(yù)24 h組肺微血管通透性分別為9.48±0.26、20.89±0.34、11.66±0.13，ANP組肺微血管通透性顯著高于假手術(shù)組，干預(yù)組較ANP組顯著減輕，但仍顯著高于假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.01)。

4．肺組織病理學(xué)改變：假手術(shù)組肺組織無明顯的病理改變；ANP組大鼠肺泡壁明顯增厚、間質(zhì)充血、白細(xì)胞浸潤，隨時(shí)間延長而加重；干預(yù)組大鼠肺組織的病理改變明顯減輕(圖1)。假手術(shù)組，ANP 3、12、24 h組，干預(yù)3、12、24 h組大鼠肺組織病理評(píng)分分別為(0.55±0.52)、(2.25±0.47)、(5.26±0.84)、(5.31±0.69)、(2.14±0.2)、(3.36±0.59)、(3.28±0.71)分，ANP組、干預(yù)組均顯著高于假手術(shù)組，干預(yù)12、24 h組又顯著低于ANP同時(shí)間點(diǎn)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.01)。

圖1假手術(shù)組(1A，HE×100)、ANP組(1B，HE×200)、干預(yù)組(1C，HE×200)肺組織病理改變

討論IL-6信號(hào)通路有兩種，一是經(jīng)典信號(hào)通路，該通路中IL-6與細(xì)胞膜上的IL-6受體(IL-6R)結(jié)合后經(jīng)受體關(guān)聯(lián)的gpl30向胞內(nèi)傳遞次級(jí)信號(hào)，但I(xiàn)L-6R僅僅在肝細(xì)胞、部分上皮細(xì)胞和白細(xì)胞膜上表達(dá)。在反式信號(hào)通路上， IL-6與游離于細(xì)胞外液中的sIL-6R結(jié)合成復(fù)合體，然后再結(jié)合至膜表面的gpl30亞單位，進(jìn)而完成信號(hào)傳遞[7-8]。因?yàn)間p130蛋白幾乎在所有的細(xì)胞中表達(dá)，故該信號(hào)通路更加廣泛。

gpl30為分子量130 000的糖蛋白，共有14個(gè)潛在N-糖基化位點(diǎn)。在生理情況下，gpl30不能直接與配基IL-6結(jié)合，當(dāng)IL-6與IL-6R結(jié)合使IL-6R的構(gòu)象發(fā)生變化后迅速與兩個(gè)gpl30分子結(jié)合，形成高親和力的結(jié)合位點(diǎn)，而可溶性gp130(sgpl30)可抑制sIL-6R/IL-6復(fù)合物的活性[8]。人工合成的sgpl30為IgG1-Fc融合蛋白的形式(sgp130Fc)，具備與自然狀態(tài)下sgp130相同的功能，即特異性抑制IL-6反式信號(hào)通路的發(fā)生而對(duì)經(jīng)典信號(hào)通路無任何抑制作用。

IL-6在AP患者中明顯升高，且與AP的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，也是最早發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)與SAP并發(fā)肺損傷有密切關(guān)系的炎性遞質(zhì)[9]。炎癥發(fā)生時(shí)，循環(huán)系統(tǒng)必須提供足夠數(shù)量的sIL-6R與IL-6結(jié)合形成復(fù)合體，否則反式信號(hào)通路將無法實(shí)現(xiàn)。本課題組曾報(bào)道[3]，ANP大鼠血sIL-6R水平顯著高于假手術(shù)組，說明ANP時(shí)sIL-6R數(shù)量明顯升高，可與IL-6充分結(jié)合介導(dǎo)反式信號(hào)通路。外源性應(yīng)用sgp130Fc與sIL-6R/IL-6復(fù)合體結(jié)合后，導(dǎo)致sIL-6R和IL-6R數(shù)量明顯下降。

本研究預(yù)先應(yīng)用sgp130干預(yù)ANP大鼠，結(jié)果顯示，干預(yù)后大鼠的肺組織病理學(xué)評(píng)分、MPO活性及微血管通透性均較ANP組明顯改善，推測(cè)其是通過抑制IL-6反式信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。

參考文獻(xiàn)

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[2]Zhang H, Neuh?fer P, Song L, et al. IL-6 trans-signaling promotes pancreatitis-associated lung injury and lethality[J]. J Clin Invest, 2013, 123(3):1019-1031. DOI: 10.1172/JCI64931.

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(本文編輯：呂芳萍)

DOI:10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2016.03.014

基金項(xiàng)目：2014年臺(tái)州市科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(14SF06)

通信作者：張衛(wèi)中，Email：zhangweizhong11@hotmail.com

(收稿日期：2015-12-15)