Biolog-Eco法檢測尸體微生物群落的代謝功能變化

江鑫鈺，王江峰，朱光輝，馬孟云，賴　躍，周　暉（．汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東 汕頭 5504；．蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部法醫(yī)學(xué)系，江蘇 蘇州 5；．深圳市公安局刑警支隊(duì)，廣東 深圳 58040）

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Biolog-Eco法檢測尸體微生物群落的代謝功能變化

江鑫鈺1，王江峰2，朱光輝1，馬孟云3，賴躍3，周暉3
（1．汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東 汕頭 515041；2．蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部法醫(yī)學(xué)系，江蘇 蘇州 215123；3．深圳市公安局刑警支隊(duì)，廣東 深圳 518040）

摘要：目的 檢測死后不同時(shí)間尸體上微生物群落功能多樣性的變化并評(píng)估其在死亡時(shí)間推斷中的應(yīng)用價(jià)值。方法 采用Biolog-Eco微平板對(duì)野外實(shí)驗(yàn)中來自于死后0～240h豬和人尸體的肛門拭子進(jìn)行微生物群體的培養(yǎng)，監(jiān)測其引起的光密度值變化，結(jié)合法醫(yī)病理學(xué)及蠅類演替，觀察自然腐敗尸體微生物群落的代謝特性及其變化。結(jié)果 微生物代謝功能多樣性與蛆蟲數(shù)量變化呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。冷凍在0h對(duì)每孔顏色平均變化率影響最大，48h后基本消失，192h后尸體微生物群落多樣性相對(duì)不穩(wěn)定。主成分分析將31種碳源綜合為5個(gè)主成分（累積貢獻(xiàn)率＞90%）。碳源tsquare分析顯示，N-乙酰-D-葡萄糖氨和L-絲氨酸是推斷人和豬樣品PMI（0～240h）的優(yōu)勢(shì)碳源。結(jié)論 Biolog-Eco法能表現(xiàn)死亡后0～240h尸體上微生物群落對(duì)部分碳源利用的代謝差異，有望為死亡時(shí)間推斷提供新依據(jù)。

關(guān)鍵詞：法醫(yī)病理學(xué)；微生物學(xué)；代謝；Biolog生態(tài)板

死亡時(shí)間（postmortem interval，PMI）推斷一直是法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域重要的研究課題之一，法醫(yī)學(xué)者已經(jīng)從尸體現(xiàn)象、直腸溫度變化、眼球玻璃體化學(xué)物質(zhì)的變化、核酸的變化［1］、昆蟲演替［2］等多角度進(jìn)行了研究，但并沒有促成該問題的完美解決。

尸體腐敗的主要外界原因是昆蟲和微生物的共同作用，近年來對(duì)尸體上活的生物（昆蟲）進(jìn)行了大量研究［3］。Biolog-EcoPlate（以下簡稱Biolog生態(tài)板）技術(shù)是一種廣泛應(yīng)用的研究微生物的方法，通過微生物對(duì)不同碳源的消解來反映微生物的種類及群落特征。尸

1　材料與方法

1.1腐敗過程模擬和樣品采集

本次野外實(shí)驗(yàn)于2013年8月在深圳市公安局法醫(yī)檢驗(yàn)中心（22°37′51.15″N，114°09′14.79″E）進(jìn)行，該地屬南亞熱帶海洋季風(fēng)氣候，全年溫和暖濕，屬于中國的高溫多雨地區(qū)［6］。本實(shí)驗(yàn)采用人（冷凍尸體解凍至室溫后進(jìn)行，尸長170 cm、質(zhì)量49.5 kg）和豬（質(zhì)量40.5kg）尸體進(jìn)行野外腐敗模擬實(shí)驗(yàn)。其中人尸體系捐贈(zèng)，豬直接從市場購買，用鐵錘擊打顱頂處死。在相同時(shí)間將人尸體和豬尸體置于相同的野外環(huán)境，進(jìn)行法醫(yī)病理學(xué)、昆蟲學(xué)及微生物學(xué)變化觀察。對(duì)人和豬尸體分別取其死后（人尸體為解凍后）0、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240 h的肛門拭子標(biāo)本各1份，用testo175-H1電子溫濕度記錄儀（德國TESTO公司）分別記錄人、豬直腸溫度（距離肛門約10cm）和環(huán)境溫度。

1.2微生物懸浮液的制備和Biolog生態(tài)板的接種

分別在裝有肛門拭子的微量離心管中加入1mL 的Tris鹽緩沖液（0.01 mol/L），5℃下渦旋振蕩1 h （140 r/min），拭子在無菌條件下從溶液中取出，加入另一只微量離心管，重復(fù)上述操作2次；合并處理液，在500×g下離心2min，除去顆粒雜質(zhì)。上清液倒入第二無菌離心管中，在8000×g下離心10min，用Tris鹽緩沖液反復(fù)洗滌4～6次，沉淀物為微生物細(xì)胞。倒出Tris鹽緩沖液并用相同體積質(zhì)量濃度為8.5 g/L的無菌NaCl溶液取代。渦旋振蕩2min，使細(xì)胞懸浮，裝入比色管。將樣品用無菌的NaCl溶液稀釋，使D590維持在0.13±0.02［7］。將制備好的菌懸液加入Biolog生態(tài)板（Biolog-EcoPlateTM，美國BIOLOG公司）中（150μL/孔），在30℃下培養(yǎng)，每隔12h用Multiskan Spectrum全波長酶標(biāo)儀（美國Thermo Electron公司）讀取590nm和750nm下的光密度值（D590和D750），連續(xù)測定240h［8］。

溫度可能是影響微生物存活和生長的最重要的因素［9］，BIOLOG公司建議最好選擇最有利于有機(jī)體生存和生長的溫度培養(yǎng)生態(tài)板，按照標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)溫度而不按照實(shí)際環(huán)境溫度培養(yǎng)溫度培養(yǎng)微生物可能會(huì)增加所監(jiān)測的微生物代謝模式的偏差［10-12］，為便于平行對(duì)照，選擇死后0～480h的肛溫均值的近似值30℃作為培養(yǎng)溫度，該溫度高于Biolog生態(tài)板的一般培養(yǎng)溫度（25℃）。

1.3數(shù)據(jù)處理

1.3.1微生物代謝活性

用每孔顏色平均變化率（average well color development，AWCD）來描述。AWCD是每個(gè)碳源孔D590減去D750，再減去對(duì)照孔光密度值后取31種碳源的平均值［13］。

1.3.2微生物群落代謝功能的多樣性

Biolog生態(tài)板溫育72～96h時(shí)，微生物對(duì)碳源的利用基本穩(wěn)定，即光密度的變化趨于穩(wěn)定［14］，因此選取96h的光密度值進(jìn)行分析，采用香農(nóng)多樣性指數(shù)（H′）、香農(nóng)均度指數(shù)（SE）、Mclntosh指數(shù)（U）和Mclntosh均勻度（Mclntosh evenness，ME）指數(shù)來反映微生物群落代謝功能的多樣性及評(píng)估豐富度和均度。H′和SE顯示了微生物群落功能多樣性的高低，該指數(shù)包含兩個(gè)因素：其一是平均光密度值，即豐富度，當(dāng)全板的光密度值為0時(shí)，H′達(dá)最小值0；其二是種類中個(gè)體分配上的均勻性，即各孔光密度值變化的均勻性增加也會(huì)使多樣性提高。豐富度指數(shù)（S）表示顏色變化孔的數(shù)目，微孔的光密度值≥0.2，則認(rèn)為是陽性值，并計(jì)入微生物群落的豐富度。U與ME是基于群落物種多維空間上歐式距離的多樣性指數(shù)。

1.3.3碳源代謝指紋圖譜

以微生物對(duì)三大營養(yǎng)物質(zhì)的代謝途徑將生態(tài)板上的31種碳源分成4大類：糖類及其衍生物、氨基酸及其衍生物、脂肪酸和脂類、代謝中產(chǎn)物和次生代謝物，分別占12種、6種、5種和8種。

1.3.4主成分分析（principal component analysis，PCA）

將Biolog生態(tài)板的31種碳源測定結(jié)果形成的描述微生物群落代謝特征的多元向量變換為互不相關(guān)的主元向量（如PC1、PC2等主元向量的分量），在降維后的主元向量空間中可以用點(diǎn)的位置直觀地反映其不同的底物利用特征。

1.3.5統(tǒng)計(jì)分析

本實(shí)驗(yàn)采用SPSS軟件對(duì)所測得的光密度值進(jìn)行差異顯著性及相關(guān)性分析，用Matlab統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行主成分分析（PCA矩陣及霍特林T2）。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2　結(jié)果

2.1人、豬直腸溫度及環(huán)境溫度變化

實(shí)驗(yàn)期間人、豬尸體溫度及環(huán)境溫度變化見圖1。環(huán)境溫度變化趨勢(shì)較平穩(wěn)，平均氣溫為29.0℃（最高32.8℃，最低25.6℃）；豬直腸溫度在0～24 h呈下降趨勢(shì)，24～48 h上升至環(huán)境溫度，之后持續(xù)上升并在168h出現(xiàn)最高溫度43.7℃，之后呈下降趨勢(shì)，并在240h降至環(huán)境溫度；人直腸溫度在0～48h從較低的解凍后溫度上升至環(huán)境溫度，無尸冷的過程，24 h后的變化趨勢(shì)同豬直腸溫度。

2.2第一波蠅類昆蟲的發(fā)生情況

所檢測的0～240 h是第一波蠅類昆蟲大頭金蠅和緋顏裸金蠅的活躍期，在人尸體及豬尸體上兩種蠅類的出現(xiàn)情況一致，按幼蟲、蛹和成蟲的發(fā)生情況進(jìn)行分級(jí)統(tǒng)計(jì)見表1。

2.3AWCD值的變化特征

對(duì)豬和人尸體上死后不同時(shí)期肛門拭子制得的菌懸液進(jìn)行培養(yǎng)，監(jiān)測得其各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的AWCD值，采用培養(yǎng)96h的Biolog生態(tài)板光密度值繪得人和豬樣品的AWCD值變化曲線（圖2）。

表1　不同死亡時(shí)間人類及豬尸體上第一波蠅類的發(fā)生情況

豬樣品的AWCD值在0～24 h呈下降趨勢(shì)，在24～48 h回升，48～96 h呈急劇下降趨勢(shì)，96～144 h有輕微回升，168～240h趨于較低水平；人樣品的AWCD值在0h較豬樣品低，在72h升高到與豬樣品同等水平，并在72～240h的變化趨勢(shì)同豬樣品一致。

人和豬AWCD值相關(guān)性分析：0～240h的相關(guān)系數(shù)為0.769（P＜0.05）；剔除0h的AWCD值，相關(guān)系數(shù)為0.905（P＜0.05）；剔除0～48 h的AWCD值，相關(guān)系數(shù)為0.930（P＜0.05）。

2.4微生物多樣性指數(shù)

豬和人尸體上微生物群落的多樣性指數(shù)見表2～3。

表2　豬尸體不同PMI微生物群落的多樣性指數(shù)?。ā纒）

表2　豬尸體不同PMI微生物群落的多樣性指數(shù)　（±s）

PMI/h　S多樣性指數(shù)H′　SE　U　ME 0 15　3.370±0.047　1.022±0.014　5.768±0.830　0.988±0.005 24　21　3.328±0.052　1.021±0.016　4.587±0.681　0.981±0.004 48　25　3.316±0.054　1.018±0.016　6.101±1.071　0.983±0.009 72　17　3.280±0.057　1.019±0.018　5.064±0.885　0.978±0.006 96　18　2.806±0.088　1.219±0.038　1.740±0.224　1.028±0.002 120　15　2.629±0.097　1.142±0.042　2.370±0.363　1.001±0.004 144　17　3.103±0.072　1.036±0.024　3.341±0.545　0.971±0.003 168　11　2.226±0.108　1.242±0.060　1.967±0.311　1.031±0.007 192　5　1.519±0.111　1.096±0.080　1.787±0.360　0.948±0.016 216　6　1.610±0.098　1.161±0.071　1.776±0.432　0.872±0.023 240　4　1.937±0.106　1.081±0.059　2.238±0.556　0.902±0.021

表3　人尸體不同PMI微生物群落的多樣性指數(shù)?。ā纒）

表3　人尸體不同PMI微生物群落的多樣性指數(shù)　（±s）

PMI/h　S多樣性指數(shù)H′　SE　U　ME 0　27　2.889±0.086　1.067±0.032　3.091±0.505　0.984±0.004 24　26　3.083±0.074　1.013±0.024　4.734±0.963　0.965±0.010 48　26　3.301±0.055　1.026±0.017　4.252±0.567　0.984±0.003 72　25　2.733±0.094　0.965±0.033　7.289±3.116　0.939±0.139 96　10　3.179±0.065　1.100±0.023　3.017±0.493　0.995±0.003 120　10　3.059±0.076　1.130±0.028　2.748±0.315　1.016±0.002 144　20　2.999±0.079　1.059±0.028　3.968±0.743　0.979±0.008 168　6　2.675±0.096　1.115±0.040　2.533±0.386　0.997±0.004 192　4　1.698±0.103　1.055±0.064　2.437±0.823　0.851±0.061 216　4　2.329±0.103　1.300±0.058　2.148±0.379　1.044±0.010 240　6　1.728±0.107　1.247±0.077　1.425±0.219　0.988±0.006

人樣品H′值：在0～48 h呈上升趨勢(shì)，在72 h降低，在96 h回至之前水平，96～240 h呈下降趨勢(shì)，并在216 h時(shí)間點(diǎn)有短暫回升；相隔每24 h的人樣品H′指數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中差異最小值出現(xiàn)在120～144 h（P＜0.05），差異最大值出現(xiàn)在168～192 h （P＜0.05）。豬樣品H′值：在24～48h該指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其余時(shí)間點(diǎn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

SE值在人和豬的樣品上均較平穩(wěn)。

U值在人樣品的變化趨勢(shì)為：0～24h該指數(shù)呈上升趨勢(shì)、24～48h呈輕微下降趨勢(shì)、48～72 h呈顯著上升趨勢(shì)、并在72～96h急劇下降，之后趨向較低值。豬樣品U值的變化趨勢(shì)在72h以后與人樣品的變化相同，但在0、48h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)上顯著高于人樣品。

ME值在人和豬的樣品上表現(xiàn)較平穩(wěn)（表2）。

2.5碳源代謝指紋變化

對(duì)樣品的碳源代謝指紋變化見圖3。對(duì)四大類營養(yǎng)物質(zhì)的代謝隨PMI的增加總體上呈降低趨勢(shì)，在死亡早期（0～72 h）尸體上的微生物對(duì)四大類營養(yǎng)物質(zhì)的利用較均衡，后期則變化幅度較大；在死后192～240 h尸體上微生物群落對(duì)脂肪酸和脂類、氨基酸及其衍生物的利用占相對(duì)優(yōu)勢(shì)。

2.6主成分分析

（1）PCA矩陣：考察豬樣品PCA矩陣，第一、第二主成分的貢獻(xiàn)率分別為53.9393%、16.1919%，前4個(gè)主成分的貢獻(xiàn)率達(dá)87.9951%，前5個(gè)主成分的貢獻(xiàn)率達(dá)91.2063%；考察人樣品PCA矩陣，第一、第二主成分的貢獻(xiàn)率分別為49.569 9%、22.693 1%，前4個(gè)主成分的貢獻(xiàn)率達(dá)86.793 6%，前5個(gè)主成分的貢獻(xiàn)率達(dá)90.7285%，均采用前5個(gè)主成分。

（2）根據(jù)霍特林T2統(tǒng)計(jì)量尋找極端數(shù)據(jù)：將碳源的tsquare從小到大進(jìn)行排序，并與PMI一起顯示。豬樣品碳源tsquare分析顯示，N-乙酰-D-葡萄糖氨是距離中心最遠(yuǎn)的碳源，其次是吐溫80、L-絲氨酸、苯乙胺；人樣品碳源tsquare分析顯示，D-甘露醇是距離中心最遠(yuǎn)的碳源，其次是D-蘋果酸、N-乙酰-D-葡萄糖氨、L-絲氨酸。

3　討論

微生物是自然界廣泛存在的一類生物，即使是一個(gè)活著的人，身體上的微生物數(shù)量也是其體細(xì)胞的十倍。而對(duì)于尸體，其微生物種類和數(shù)量更為繁多，在命案現(xiàn)場，很多尸體上會(huì)出現(xiàn)白色或灰色的霉斑，即霉尸。此外，在室內(nèi)的命案現(xiàn)場，經(jīng)常能發(fā)現(xiàn)飯菜長霉。近年來，隨著微生物檢測手段的提高，尸體上的微生物逐漸成為法醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)，由此而形成的一門學(xué)科就是法醫(yī)微生物學(xué)（forensic microbiology）或者法醫(yī)真菌學(xué)（forensic mycology）。

本研究采用Biolog生態(tài)板技術(shù)對(duì)人尸體和豬尸體240h以內(nèi)的微生物變化進(jìn)行了觀察，分別采用平均光密度值、微生物功能多樣性指數(shù)、碳源代謝指紋圖譜、主成分分析對(duì)微生物群落的變化情況進(jìn)行了檢測?？梢钥闯鲈谠缙谒劳鲭A段（約0～24h）死亡引發(fā)了機(jī)體正常菌群代謝功能的降低，之后是腐生菌群的繁盛期和尸食性蠅類一齡幼蟲期（約24～48 h），然后出現(xiàn)的AWCD值急劇下降期及蛆蟲的最繁盛時(shí)期 （約48～144h），說明大量蛆群的存在抑制了尸體上微生物群落的代謝功能，可能由于蛆蟲分泌物中有抗菌肽的成分能夠抑制和殺滅細(xì)菌［15］；在晚期（約168～240 h）由于營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，微生物群落的代謝功能趨于較低水平，結(jié)合組織形態(tài)學(xué)的觀察，144h會(huì)陰處已出現(xiàn)破口，取材部位覆蓋的軟組織減少，240h取材部位已暴露，能受到陽光照射，易受外來微生物污染，可能證實(shí)了在192 h后微生物代謝功能多樣性相對(duì)不穩(wěn)定的原因。人和豬AWCD值的相關(guān)性研究說明了冷凍對(duì)于尸體腐敗0h的影響最大，而冷凍對(duì)AWCD值的影響在24h后明顯減弱，48h后基本消失。微生物總體活性隨PMI的增加快于尸體肛溫的變化，反映尸體上微生物群落的代謝可導(dǎo)致尸溫的升高。同時(shí)，微生物群落對(duì)碳源底物利用的變化可間接反映當(dāng)時(shí)尸體上營養(yǎng)物質(zhì)的變化，糖類及其衍生物隨PMI的增加而減少，這可能是由于大多數(shù)的微生物都能穩(wěn)定利用糖類，而脂肪酸及脂類、氨基酸及其衍生物隨PMI增加在尸體上殘留的比例相對(duì)增高。主成分分析顯示，31種碳源可綜合為5個(gè)主成分（累積貢獻(xiàn)率＞90%），N-乙酰-D-葡萄糖氨和L-絲氨酸是推斷人和豬樣品PMI（0～240h）的優(yōu)勢(shì)碳源。

尸體的腐敗首先通過微生物的改變（真菌或者微生物）開始，隨后才是一系列節(jié)肢動(dòng)物的到達(dá)和嗜尸性昆蟲優(yōu)勢(shì)的顯現(xiàn)，在尸體上蠅類幼蟲繁盛之前即死后0～24h增加數(shù)個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)可能有益于對(duì)PMI更精確的推斷。在腐敗中晚期尸體上的微生物種群更替速度較早期更快，且受外界環(huán)境影響較大，尤其是空氣濕度（尸體水分含量）；Biolog生態(tài)板培養(yǎng)對(duì)象為好氧且相對(duì)生長較快的微生物類群，對(duì)于腐敗后期霉菌等真核微生物群體占主導(dǎo)的代謝模式無法呈現(xiàn)。

在計(jì)算微生物多樣性指數(shù)時(shí)，本研究用的是培養(yǎng)96h的光密度值，不同研究人員在不同的報(bào)道中所采用的時(shí)間和方法并不統(tǒng)一，如采用72、96或120h［16］，應(yīng)按照群落在培養(yǎng)過程中進(jìn)入對(duì)數(shù)期的快慢來選擇，一般來說未經(jīng)冷凍的尸體微生物群落進(jìn)入對(duì)數(shù)期的速度快于冷凍尸體，腐敗早期尸體微生物群落進(jìn)入對(duì)數(shù)期的速度也快于后期。在有限的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，前者進(jìn)入對(duì)數(shù)期前的適應(yīng)期更短，生長曲線更接近于“S”型，后者更接近于“J”型。

由于利用人類尸體開展研究涉及倫理、宗教及道德等各方面問題，從而使得此類研究很難開展。本研究通過合法途徑采用了捐贈(zèng)的人類材料，還有待未來多地的重復(fù)試驗(yàn)才能得出結(jié)論，試驗(yàn)結(jié)果只作為特定的相似環(huán)境（深圳，高溫多雨）下尸體腐敗的參考，本研究所獲取的昆蟲學(xué)數(shù)據(jù)將另文報(bào)道。

由于我國尚無局部地區(qū)每小時(shí)的詳細(xì)氣象數(shù)據(jù)（如風(fēng)力、日照、紫外線指數(shù)、濕度、雨量、雨水質(zhì)量、土壤、水紋數(shù)據(jù)等）的公開網(wǎng)站，使得氣候因素作為輸入數(shù)據(jù)來推斷PMI受到阻礙，某些重要觀測值受到忽略，因此加強(qiáng)各學(xué)科、機(jī)構(gòu)的合作是腐敗尸體PMI推斷的趨勢(shì)。

參考文獻(xiàn)：

［1］趙子琴.法醫(yī)病理學(xué)［M］.第4版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2004：70-88.

［2］王江峰，胡萃，陳玉川，等.大頭金蠅蛹發(fā)育形態(tài)學(xué)用于死亡時(shí)間判斷的基礎(chǔ)研究［J］.寄生蟲與醫(yī)學(xué)昆蟲學(xué)報(bào)，2001，8（4）：232-236.

［3］王江峰，胡萃，陳玉川，等.溫度對(duì)大頭金蠅Chrysomyia megacephala（Fabricius）幼蟲體長變化的影響［J］.寄生蟲與醫(yī)學(xué)昆蟲學(xué)報(bào)，2002，9（2）：100-105.

［4］Kaeberlein T，Lewis K，Epstein SS.Isolating“uncultivable”microorganisms in pure culture in a simulated natural environment［J］.Science，2002，296（5570）：1127-1129.

［5］Konopka A，Oliver L，Turco RF Jr.The Use of Carbon Substrate Utilization Patterns in Environmental and Ecological Microbiology［J］.Microb Ecol，1998，35（2）：103-115.

［6］張永夏，邢福武.深圳大鵬半島種子植物區(qū)系研究［J］.武漢植物學(xué)研究，2006，24（2）：119-129.

［7］Classen AT，Boyle SI，Haskins KE，et al.Community-level physiological profiles of bacteria and fungi：plate type and incubation temperature influences on contrasting soils［J］.FEMS Microbiol Ecol，2003，44（3）：319-328.

［8］Selmants PC，Hart SC，Boyle SI，et al.Red alder （Alnus rubra）alters community-level soil microbial function in conifer forests of the Pacific Northwest，USA［J］.Soil Biology&Biochemistry，2005，37（10）：1860-1868.

［9］Madigan MT，Martinko JM，Stahl DA，et al.Brock Biology of Microorganisms［M］.13th ed.Benjamin Cummings，2010：134-138.

［10］Bossio DA，Scow KM.Impact of carbon and flooding on the metabolic diversity of microbial communities in soil［J］.Appl Environ Microbiol，1995，61（11）：4043-4050.

［11］Haack SK，Garchow H，Klug MJ，et al.Analysis of factors affecting the accuracy，reproducibility，and interpretation of microbial community carbon source utilization patterns［J］.Appl Environ Microbiol，1995，61（4）：1458-1468.

［12］Gamo M，Shoji T.A method of profiling microbial communities based on a most-probable-number assay that uses BIOLOG plates and multiple sole carbon sources［J］.Appl Environ Microbiol，1999，65（10）：4419-4424.

［13］Stefanowicz A.The biolog plates technique as a tool in ecological studies ofmicrobial communities［J］. Polish J of Environ Stud，2006，15（5）：669-676.

［14］Magurran AE.Ecological diversity and its measurement［M］.New Jersey：Princeton University Press，1988：43-47.

［15］高磊，尹葉鋒，王壽宇，等.純化蛆蟲分泌物抗菌肽對(duì)糖尿病大鼠潰瘍創(chuàng)面的抗菌作用［J］.中國組織工程研究，2012，16（24）：4437-4440.

［16］金凌波，周峰，姚涓，等.磷高效轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)根際微生物群落的影響［J］.生態(tài)學(xué)報(bào)，2012，32（7）：2082-2090.

（本文編輯：張建華）

中圖分類號(hào)：DF795.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

doi：10.3969/j.issn.1004-5619.2016.03.003

文章編號(hào)：1004-5619（2016）03-0171-05

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81273352）

作者簡介：江鑫鈺（1988—），女，碩士研究生，主要從事法醫(yī)微生物學(xué)研究；E-mail：24273392@qq.com

通信作者：王江峰，男，教授，主要從事法醫(yī)昆蟲學(xué)研究；E-mail：wjf701125@aliyun.com 朱光輝，男，副教授，主要從事法醫(yī)昆蟲學(xué)研究；E-mail：ghzhu@126.com體上的微生物種類繁多，大部分在實(shí)驗(yàn)室無法培養(yǎng)［4］，Biolog生態(tài)板技術(shù)最大的特征是不用進(jìn)行微生物各種類的提純及培養(yǎng)。尸體上的微生物是一種發(fā)展迅速、代謝水平高的生物類群，適合用該法研究；同時(shí)，Biolog生態(tài)板技術(shù)操作簡單、快速、獲得數(shù)據(jù)量豐富［5］。本研究采用該方法對(duì)豬和人尸體上微生物群落隨PMI的變化情況進(jìn)行觀察。

收稿日期：（2015-01-06）

Detection of Metabolism Function of Microbial Community of Corpses by Biolog-Eco Method

JIANG Xin-yu1，WANG Jiang-feng2，ZHU Guang-hui1，MA Meng-yun3，LAI Yue3，ZHOU Hui3
（1.College of Medicine，Shantou University，Shantou 515041，China；2.Departmet of Forensic Medicine，Medical College of Soochow University，Suzhou 215123，China；3.Criminal Police Branch，Shenzhen Public Security Bureau，Shenzhen 518040，China）

Abstract：Objective To detect the changes of microbial community functional diversity of corpses with different postmortem interval（PMI）and to evaluate forensic application value for estimating PMI. Methods The cultivation of microbial community from the anal swabs of a Sus scrofa and a human corpse placed in field environment from 0 to 240h after death was performed using the Biolog-Eco Microplate and the variations of the absorbance values were also monitored.Combined with the technology of forensic pathology and flies succession，the metabolic characteristics and changes of microbial community on the decomposed corpse under natural environment were also observed.Results The diversity of microbial metabolism function was found to be negatively correlated with the number of maggots in the corpses.The freezing processing had the greatest impact on average well color development value at 0h and the impact almost disappeared after 48 h.The diversity of microbial metabolism of the samples became relatively unstable after 192 h.The principal component analysis showed that 31 carbon sources could be consolidated for 5 principal components（accumulative contribution ratio＞90%）.The carbon source tsquare-analysis showed that N-acetyl-D-glucosamine and L-serine were the dominant carbon sources for estimating the PMI（0=240h）of the Sus scrofa and human corpse.Conclusion The Biolog-Eco method can be used to reveal the metabolic differences of the carbon resources utilization of the microbial community on the corpses during 0-240 h after death，which could provide a new basis for estimating the PMI.

Key words：forensic pathology；microbiology；metabolism；Biolog-EcoPlate