匍枝根霉淀粉發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的條件研究

周若飛，湯斌，李松，闞清華

(安徽工程大學(xué) 微生物發(fā)酵安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽 蕪湖，241000)

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匍枝根霉淀粉發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的條件研究

周若飛，湯斌*，李松，闞清華

(安徽工程大學(xué) 微生物發(fā)酵安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽 蕪湖，241000)

摘要以匍枝根霉TP-02(Rhizopus stolonifer TP-02)為出發(fā)菌株，首次利用淀粉水解液為主要碳源，快速合成纖維素酶。從碳源、氮源、培養(yǎng)溫度、初始pH、裝液量和接種量等方面研究該菌株的產(chǎn)酶條件。獲得最佳培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件為：10%淀粉水解液，麩皮浸出汁5%，NH4Cl 0.5%，KH2PO40.5%，MgSO4·7H2O 0.4%，CaCl2 0.4%，酵母粉0.6%；發(fā)酵溫度30 ℃，裝液量80 mL/(250 mL)，初始pH 5.0，接種量8%。通過(guò)搖瓶實(shí)驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件后，獲得濾紙酶活為9.66 IU/mL。研究中進(jìn)一步利用該培養(yǎng)基在5 L發(fā)酵罐中發(fā)酵至60 h時(shí)酶活達(dá)到最大值，其中濾紙酶活、外切酶活、內(nèi)切酶活和β-葡萄糖苷酶分別為16.51、15.39、11.48和6.17 IU/mL。與以往纖維素類(lèi)物質(zhì)為碳源發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶相比，淀粉水解液發(fā)酵獲得的纖維素酶酶系組成有了較大的變化，特別是關(guān)鍵的外切酶活有了大幅度提高，而發(fā)酵時(shí)間縮短了將近1倍。

關(guān)鍵詞匍枝根霉；淀粉水解液；發(fā)酵；纖維素酶

纖維素酶己在食品、醫(yī)藥、飼料、造紙和生物質(zhì)能源等工業(yè)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用[1-2]，但仍受限于居高不下的生產(chǎn)成本問(wèn)題，主要表現(xiàn)為以下兩個(gè)方面：其一，纖維素酶產(chǎn)生菌株的發(fā)酵酶活力相對(duì)較低，一直是大規(guī)模生產(chǎn)急需解決的問(wèn)題，也是長(zhǎng)期制約纖維素酶大量生產(chǎn)并限制其應(yīng)用的主要因素[3]；其二，目前使用的絲狀真菌由于菌種特性和培養(yǎng)條件等因素使得纖維素酶發(fā)酵時(shí)間普遍較長(zhǎng)，成本過(guò)高。因此，在目前纖維素酶的發(fā)酵生產(chǎn)和研究領(lǐng)域中，選擇廉價(jià)易得的發(fā)酵碳源并大幅降低發(fā)酵時(shí)間依然是快速降低纖維素酶發(fā)酵成本的有效途徑之一。已報(bào)道的可發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的碳源主要有工業(yè)纖維素、麥麩、農(nóng)作物秸稈及乳糖等。自然界中，很多絲狀真菌能利用這些碳源很好地產(chǎn)纖維素酶，且分泌的纖維素酶酶系完全，然而發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)一直無(wú)法解決[4-5]。

目前研究纖維素類(lèi)碳源發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶比較多，真菌利用淀粉發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶報(bào)道比較少[6-7]。本文以匍枝根霉為研究對(duì)象，濾紙酶活為主要考量目標(biāo)，首次利用淀粉水解液作為主要碳源，研究淀粉水解液發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的條件，尋找出一種適合匍枝根霉利用淀粉水解液發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的工藝條件。

1材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1菌種

匍枝根霉TP-02(RhizopusstoloniferTP-02)，本實(shí)驗(yàn)室從黃山生態(tài)林中采集并分離出1株高產(chǎn)纖維素酶菌種。

1.1.2培養(yǎng)基

(1)種子培養(yǎng)基(10%麩皮浸出汁)：稱(chēng)取100 g麩皮，加入800 mL蒸餾水煮沸30 min，4層紗布過(guò)濾，定容至1 000 mL。

(2)20%淀粉水解液：稱(chēng)取200 g玉米淀粉放入1 000 mL燒杯中，加入800 mL蒸餾水和6 g高溫α-淀粉酶，60 ℃水浴酶解30 min，定容至1 000 mL。

(3)液體發(fā)酵培養(yǎng)基：取500 mL 20%淀粉水解液和500 mL 10%麩皮浸出汁混勻后分別加入NH4Cl 0.5%，KH2PO40.5%，MgSO4·7H20 0.4%，CaCl20.4%，酵母粉0.6%，PEG4000 0.02%，微量元素液0.000 2%。

1.1.3試劑

分析純微晶纖維素，水楊苷，購(gòu)自上海生物工程有限公司；羧甲基纖維素鈉，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；玉米淀粉，購(gòu)自成武大地玉米開(kāi)發(fā)有限公司；細(xì)菌高溫α-淀粉酶(40 000 U/mg)，購(gòu)自山東龍?jiān)锕こ逃邢薰?；雙圈牌定量濾紙，購(gòu)自杭州沃華濾紙有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.4主要儀器和設(shè)備

QHZ-123B組合式全溫度振蕩培養(yǎng)箱； BIOTECH-5BG-15JSA-3000PLC 自動(dòng)發(fā)酵罐；723可見(jiàn)分光光度計(jì)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1種子活化

將超低溫(-80 ℃)保存的菌種劃線接種到PDA斜面上，于30 ℃恒溫培養(yǎng)3 d。

1.2.2種子制備及發(fā)酵

用無(wú)菌水洗下培養(yǎng)3 d斜面上的孢子，并稀釋至每毫升孢子濃度為108個(gè)，接入100 mL種子液中培養(yǎng)24 h后，按10% 接種量吸取種子液到80 mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，每隔6 h取樣并測(cè)發(fā)酵液相關(guān)酶活。每組3個(gè)平行，每個(gè)平行重復(fù)測(cè)定3次。以上培養(yǎng)條件均為200 r/min、30 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)。

1.2.3酶活測(cè)定

粗酶液的制備：培養(yǎng)發(fā)酵12 h后，用移液器每隔6 h從產(chǎn)酶培養(yǎng)基中取1 mL酶液于1.5 mL離心管中，5 000 r/min離心10 min，取上清液用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(0.05 mol/L，pH 4.8)進(jìn)行適當(dāng)稀釋?zhuān)糜跍y(cè)酶活。

濾紙酶活的測(cè)定：國(guó)際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)(International Union of Pure and Applied Chemistry,IUPAC)推薦的標(biāo)準(zhǔn)方法[8]測(cè)定。

CMC酶活的測(cè)定:以CMC為底物，采用文獻(xiàn)[9]的方法測(cè)定。

CBH酶活的測(cè)定：以微晶纖維素為底物，采用文獻(xiàn)[10]的方法測(cè)定。

β-葡萄糖苷酶酶活的測(cè)定：以水楊苷為底物，采用文獻(xiàn)[11]的方法測(cè)定。

1.2.4碳氮源對(duì)產(chǎn)纖維素酶的影響

將匍枝根霉種子液以10%接種量接種到不同淀粉水解液的培養(yǎng)基中，研究主要碳源淀粉水解液對(duì)產(chǎn)纖維素酶的影響；以10%的接種量接種到含有0.4%的單一氮源(硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、硝酸鉀、尿素)培養(yǎng)基中，考察單一氮源對(duì)產(chǎn)纖維素酶的影響；再以10%的接種量接種到含有0.5%的不同有機(jī)氮源(蛋白胨、酵母粉、牛肉浸膏、酵母浸膏，豆餅粉)的復(fù)合氮源培養(yǎng)基中，研究復(fù)合氮源對(duì)產(chǎn)纖維素酶的影響。在此基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)研究碳氮源對(duì)產(chǎn)纖維素酶的影響。菌株在上述條件下自然pH，裝液量為80 mL，培養(yǎng)溫度為30 ℃，200 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)54 h，分別測(cè)定其濾紙酶活。

1.2.5培養(yǎng)條件對(duì)產(chǎn)纖維素酶的影響

以10%的接種量接種到80 mL產(chǎn)酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于不同培養(yǎng)溫度26、28、30、32、34 ℃發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶，研究培養(yǎng)溫度對(duì)菌株產(chǎn)纖維素酶的影響；分別以2%、4%、6%、8%、10%的接種量接種到80 mL產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)，研究接種量對(duì)菌株產(chǎn)纖維素酶的影響；以10%的接種量接種到80 mL酶培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，于30 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)，研究初始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響；以10%的接種量接種不同體積(40、60、80、100、120 mL)的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，于30 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)，考察裝液量對(duì)產(chǎn)纖維素酶的影響；菌株在上述條件下于200 r/min恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)66 h。

1.2.6優(yōu)化后的培養(yǎng)基上罐發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶

在上述搖瓶發(fā)酵的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究上罐發(fā)酵的產(chǎn)纖維素酶情況。在5 L發(fā)酵罐中，裝液量為3.2 L，接種量為8%，發(fā)酵溫度為30 ℃，pH為5.0，溶氧控制為25%左右發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶，發(fā)酵12 h后每隔6 h取樣測(cè)定發(fā)酵液的纖維素酶酶活。通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)基優(yōu)化后上罐發(fā)酵酶活力變化情況，確定此發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)酶效果及酶系配比。

2結(jié)果與分析

2.1碳氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響

2.1.1淀粉水解液對(duì)產(chǎn)酶的影響

利用高溫α-淀粉酶水解淀粉得到淀粉水解液作為主要碳源，發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶，并分別從淀粉百分比、加酶量、水解溫度與水解時(shí)間4個(gè)方面進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如圖1所示。確定淀粉百分比為10%、加酶量為0.3%、水解溫度為60 ℃，水解時(shí)間為30 min，得到的淀粉水解液最適合發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶。

A-不同水解時(shí)間，淀粉含量為15%，加酶量為0.2%，水解溫度為70 ℃；B-不同加酶量，淀粉含量為15%，水解時(shí)間為30 min，水解溫度為70 ℃；C-不同水解溫度，淀粉含量為15%，加酶量為0.3%，水解時(shí)間為30 min；D-不同淀粉含量：加酶量為0.3%，水解時(shí)間為30 min，水解溫度為60 ℃。圖1　不同淀粉水解液對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.1　Effect of different starch hydrolyzate on enzyme production

2.1.2單一氮源對(duì)產(chǎn)纖維素酶的影響

由圖2可知，相對(duì)于其他氮源，氯化銨為氮源時(shí)濾紙酶活最高，因此選擇氯化銨作為無(wú)機(jī)氮源。

圖2　氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.2　Effect of different nitrogen on enzyme production

2.1.3復(fù)合氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響

由圖3可知，在0.4%的氯化銨無(wú)機(jī)氮源基礎(chǔ)上添加0.5%的酵母粉有機(jī)氮源獲得濾紙酶活最高，故選擇添加0.5%的酵母粉。

圖3　有機(jī)氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.3　Effect of different organic nitrogen on enzyme production

2.1.4碳氮源正交實(shí)驗(yàn)

正交實(shí)驗(yàn)L9(33)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，淀粉水解液、氯化銨、酵母粉對(duì)匍枝根霉產(chǎn)纖維素能力依次是淀粉水解液>氯化銨>酵母粉，即碳源淀粉水解液濃度對(duì)酶活影響最大，其次是氮源氯化銨濃度，最后是氮源酵母粉濃度。故選擇酶活力最高的培養(yǎng)條件，即淀粉水解液10%、氯化銨0.5%、酵母粉0.6%。方差結(jié)果顯示，其中碳源對(duì)匍枝根霉發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶影響顯著(P<0.05)(見(jiàn)表3)。

表1　正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

表2　正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3　實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析

2.2發(fā)酵條件對(duì)產(chǎn)酶的影響

2.2.1溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響

由圖4可知纖維素酶的合成與培養(yǎng)溫度有較大的關(guān)系，在較低溫度26 ℃時(shí)，由于菌株生長(zhǎng)緩慢，酶活高峰期延長(zhǎng)且酶活力比較低。當(dāng)培養(yǎng)溫度為30 ℃時(shí)，菌絲體旺盛生長(zhǎng)，酶分泌增多，酶活力增大，54 h時(shí)濾紙酶活達(dá)8.12 IU/mL。但若溫度持續(xù)升高，可能造成了菌株過(guò)早老化，酶分泌量減少，酶活力逐漸降低。

圖4　不同溫度對(duì)纖維素酶合成的影響Fig.4　Effects of different temperatures on cellulose production

2.2.2接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響

由圖5可知，接種量對(duì)產(chǎn)纖維素酶效果影響較為明顯，接種量為2%時(shí)，生長(zhǎng)緩慢，酶活最高點(diǎn)延遲且酶活力較小，當(dāng)?shù)浇臃N量為8%時(shí)，產(chǎn)酶水平達(dá)到峰值，濾紙酶活為8.83 IU/mL，當(dāng)接種量超過(guò)8%以后，產(chǎn)酶水平有所下降。

圖5　不同接種量對(duì)纖維素酶合成的影響Fig.5　Effects of different inoculum size on cellulose production

2.2.3初始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響

從圖6可以看出在pH 3.0～5.0，隨著pH的提高，濾紙酶活不斷增加，pH 5.0時(shí)達(dá)9.05 IU/mL。pH超過(guò)5.0之后，產(chǎn)酶水平開(kāi)始下降。

圖6　不同pH對(duì)纖維素酶合成的影響Fig.6　Effects of different pH on cellulose production

2.2.4裝液量對(duì)產(chǎn)酶的影響

由圖7可知，隨著裝液量的增加，濾紙酶活逐漸上升，由于匍枝根霉發(fā)酵過(guò)程中耗氧比較快，當(dāng)裝液量超過(guò)80 mL，產(chǎn)酶水平不升反降，這是由于供氧不足，不利于匍枝根霉的生長(zhǎng)與產(chǎn)酶。結(jié)果表明，250 mL三角瓶中裝入80 mL培養(yǎng)基能獲得最佳的產(chǎn)酶效果，濾紙酶活達(dá)9.66 IU/mL。

圖7　裝液量對(duì)纖維素酶合成的影響Fig.7　Effects of liquid on cellulose production

2.35 L罐發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶

由圖8可知，相比搖瓶，上罐在60 h時(shí)酶活達(dá)到最高點(diǎn)，F(xiàn)PA，CBH，CMC，BG分別為16.51，15.39，11.48，6.17 IU/mL，相對(duì)優(yōu)化前分別提高了54.8%，53.9%，47.5%，48.1%，可見(jiàn)通過(guò)對(duì)產(chǎn)酶條件的研究，使得匍枝根霉可以利用酶解淀粉作為主要碳源發(fā)酵，高效合成纖維素酶。于其他絲狀真菌發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶情況相比較，匍枝根霉利用淀粉水解液發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶在酶活力沒(méi)有減少的前提下，發(fā)酵時(shí)間大大縮短。

圖8　纖維素酶酶活發(fā)酵過(guò)程變化曲線Fig.8　Cellulase activity curve of the fermentation process

3討論

通過(guò)對(duì)匍枝根霉淀粉發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)基的優(yōu)化，得到最適產(chǎn)酶的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件如下：10%淀粉水解液(水解溫度60 ℃、水解時(shí)間30 min、加酶量0.3%、淀粉10%)，麩皮浸出汁5%，NH4Cl 0.5%，KH2PO40.5%，MgSO4·7H2O 0.4%，CaCl20.4%，酵母粉0.6%， PEG4000 0.02%，微量元素液0.000 2%，發(fā)酵溫度30 ℃，裝液量80 mL，初始pH 5.0，接種量8%，搖瓶發(fā)酵54 h后獲得濾紙酶活為9.66 IU/mL。該條件下匍枝根霉具有良好的產(chǎn)纖維素酶能力，分泌的酶系也比較完全且發(fā)酵時(shí)間縮短，5 L發(fā)酵罐發(fā)酵60 h時(shí)纖維素酶酶活達(dá)到最大值，獲得濾紙酶活，外切酶活，內(nèi)切酶活，β-葡萄糖苷酶分別為16.51，15.39，11.48，6.17 IU/mL。

本文首次利用淀粉發(fā)酵匍枝根霉產(chǎn)纖維素酶，與以往的利用纖維素直接誘導(dǎo)產(chǎn)纖維素酶有較大區(qū)別。目前關(guān)于纖維素誘導(dǎo)產(chǎn)纖維素酶研究比較多，普遍認(rèn)為纖維二糖有誘導(dǎo)產(chǎn)纖維素酶的作用，然而酶解淀粉快速高效合成纖維素酶沒(méi)有相關(guān)報(bào)道，其誘導(dǎo)機(jī)理也有待進(jìn)一步研究。與匍枝根霉稻草誘導(dǎo)產(chǎn)酶相比，利用淀粉水解液發(fā)酵所獲得的纖維素酶酶系配比發(fā)生了較大變化。其中，濾紙酶活提高了25.5%，內(nèi)切酶活雖然有所下降，但關(guān)鍵的外切酶活提高了近28倍，β-葡萄糖苷酶活變化不大[7]，其酶系組成變得更加合理。另外，匍枝根霉利用稻草發(fā)酵需要84 h達(dá)到酶活最高點(diǎn)，而酶解淀粉發(fā)酵只需要60 h，由此可見(jiàn)利用淀粉發(fā)酵能大大縮短發(fā)酵時(shí)間，并有效提高纖維素酶總酶活和酶解效率，具有良好的應(yīng)用前景。

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Studies on the fermentation conditions ofRhizopusstoloniferto produce cellulase by starch hydrolysate

ZHOU Ruo-fei,TANG Bin,LI Song,KAN Qing-hua

(Anhui Polytechnic University,Engineering Technololy Research Center of Anhui Microbial Fermentation,Wuhu 241000,China)

ABSTRACTStarch hydrolyzate was first utilized as the main carbon for Rhizopus stolonifer TP-02 to achieve a highly efficient production of cellulase. The fermentation conditions including carbon source, nitrogen source, temperature, initial pH, medium volume, and concentration of inoculum were optimized. The optimal medium and culture conditions were confirmed as follows: starch hydrolyzate of 10%, wheat bran extract of 5%, NH4Cl of 0.5%, KH2PO4 of 0.5%, MgSO4·7H2O of 0.4%, CaCl2 of 0.4%, yeast extract of 0.6%, fermentation temperature of 30 ℃, medium volume of 80 mL/ (250 mL), initial pH 5.0 and inoculation concentration of 10%. In the condition mentioned above, the filter paper activity could peak at 9.66 IU/mL. Enlarging the fermentation in a 5 L fermenter, the activity of cellulase reached the maximum value after 60 h. The activity of filter paper, exoglucanase, endoglucanase and β- glucosidase was 16.51 IU/mL, 15.39 IU/mL, 11.48 IU/mL and 6.17 IU/mL, respectively. Compared with conventional cellulose-based material as a carbon source for fermentation of cellulose enzyme, the composition of cellulase obtaining from fermentation of starch hydrolyzate had significant changes. Especially the critical exonuclease activity had greatly improved. The fermentation time had been nearly doubled shortened.

Key wordsRhizopus stolonifera; starch hydrolysate; fermentation; cellulose

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201606016

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31270135)

收稿日期：2015-12-24，改回日期：2016-01-23

第一作者：碩士研究生(湯斌教授為通訊作者，E-mail：tangbin@ahpu.edu.cn)。