應(yīng)用PCR-FINS技術(shù)鑒定金槍魚(yú)罐頭中金槍魚(yú)種類(lèi)

安麗艷，孟鎮(zhèn)，仇凱*，鐘其頂，楊彤暉，郭新光

1(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100015) 2(全國(guó)食品發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)化中心，北京，100015)

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應(yīng)用PCR-FINS技術(shù)鑒定金槍魚(yú)罐頭中金槍魚(yú)種類(lèi)

安麗艷1,2，孟鎮(zhèn)1,2，仇凱1,2*，鐘其頂1,2，楊彤暉1,2，郭新光1,2

1(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100015) 2(全國(guó)食品發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)化中心，北京，100015)

摘要為考察金槍魚(yú)罐頭中DNA降解程度以及鑒定金槍魚(yú)罐頭中金槍魚(yú)種類(lèi)，文中根據(jù)魚(yú)類(lèi)線粒體基因組(m tDNA)細(xì)胞色素b(cyt b)基因和12S rDNA基因，利用3對(duì)通用引物分別擴(kuò)增片段大小為 358 bp(cyt b)、224 bp(12S rDNA)、123bp(cyt b)的目的片段，同時(shí)，基于123 bp線粒體cytb基因片段，通過(guò)法醫(yī)信息核苷酸測(cè)序(PCR-FINS)技術(shù)來(lái)鑒別金槍魚(yú)罐頭中金槍魚(yú)的種類(lèi)，并對(duì)17個(gè)市售金槍魚(yú)罐頭樣品進(jìn)行金槍魚(yú)種類(lèi)鑒定。結(jié)果表明：金槍魚(yú)罐頭中DNA降解嚴(yán)重，其片段大小在100～200 bp；該研究建立的PCR-FINS技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)金槍魚(yú)罐頭中金槍魚(yú)種類(lèi)的準(zhǔn)確鑒別；17個(gè)市售金槍魚(yú)罐頭樣品中，58.8%來(lái)源于價(jià)格低廉的鰹魚(yú)，其次還包括長(zhǎng)鰭金槍魚(yú)、青干金槍魚(yú)、扁鮀鰹、鮪魚(yú)。

關(guān)鍵詞PCR-FINS；金槍魚(yú)罐頭；種類(lèi)鑒定

金槍魚(yú)類(lèi)是硬骨魚(yú)綱、輻鰭亞綱、鱸形目、鯖科中金槍魚(yú)屬、狐鰹屬、舵鰹屬、鰹屬和鮪屬的統(tǒng)稱(chēng)，多達(dá)17個(gè)金槍魚(yú)品種[1]。金槍魚(yú)罐頭因其營(yíng)養(yǎng)美味、食用方便、貨架期長(zhǎng)、便于攜帶等特點(diǎn)，深受廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)[2]。然而，金槍魚(yú)罐頭市場(chǎng)魚(yú)目混雜，標(biāo)示不清[3]，市面上所銷(xiāo)售的金槍魚(yú)罐頭，大多僅標(biāo)示為金槍魚(yú)罐頭，未標(biāo)注所用原料的具體種屬信息。

水產(chǎn)加工品的原料品種鑒別已成為水產(chǎn)加工行業(yè)中面臨的重要問(wèn)題之一。2003年，歐盟建立了魚(yú)類(lèi)及其制品標(biāo)簽法，明確規(guī)定魚(yú)類(lèi)制品必須貼有標(biāo)明商業(yè)名稱(chēng)、生產(chǎn)方法和捕獲區(qū)域的標(biāo)簽[4]。美國(guó)食品藥品管理局(FDA)列出一個(gè)可食水產(chǎn)品名單，規(guī)定水產(chǎn)品標(biāo)示必須使用該名單中規(guī)定的名稱(chēng)[5]。我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB7718—2011《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)預(yù)包裝食品標(biāo)簽通則》也明確要求，食品名稱(chēng)應(yīng)清晰的反映食品的真實(shí)屬性[6]。

目前，國(guó)內(nèi)對(duì)魚(yú)類(lèi)罐頭魚(yú)源性成分鑒別尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。本研究采用PCR-FINS方法對(duì)金槍魚(yú)罐頭食品魚(yú)源性成分進(jìn)行鑒定，旨在建立高效、便捷的金槍魚(yú)罐頭中金槍魚(yú)種類(lèi)的PCR-FINS鑒定方法。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

金槍魚(yú)罐頭，購(gòu)自當(dāng)?shù)氐某?。黃鰭金槍魚(yú)生魚(yú)片作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2主要試劑

CTAB裂解液[4% CTAB，100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，1.4 mol/L NaCl，20 mmol/L EDTA(pH 8.0)]；TE緩沖液(0.01 mol/L Tris，0.001 mol/L EDTA，pH 8.0)；Taq DNA聚合酶、dNTPs、100 bp Marker，均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖、三氯甲烷/異戊醇體積比241、無(wú)水乙醇、異丙醇。

1.3主要儀器

冷凍離心機(jī)，美國(guó)Sigma公司；T gradient PCR擴(kuò)增儀，德國(guó)Biometra公司；DYY-8C型高壓電泳儀，北京六一儀器廠；CV-1000型凝膠成像系統(tǒng)，法國(guó)VIBER LOURMAT公司；壓力蒸汽滅菌鍋(LS-B50L)，上海醫(yī)用核子儀器廠。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1DNA提取

取100 mg金槍魚(yú)罐頭肌肉組織樣品于2 mL離心管中，加入1 mLV(三氯甲烷)∶V(甲醇)∶V(水)=1∶2∶0.8，室溫靜置過(guò)夜，5 000 r/min離心3 min，棄上清液，無(wú)菌去離子水清洗樣品，樣品組織于-40 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

參考UNSELD[7]的研究，并進(jìn)行適當(dāng)修改。取上述組織樣品，加入1mL CTAB提取液[4% CTAB，100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，1.4 mol/L NaCl，20 mmol/L EDTA(pH 8.0)]，65℃溫育1～2 h，期間每隔15 min顛倒混勻1次。溫育后，離心取上清液，等體積的V(三氯甲烷)∶V(異戊醇)=24∶1抽提2次。加2/3體積預(yù)冷的異丙醇沉淀DNA，-20 ℃，1 h。離心棄上清液，沉淀用體積分?jǐn)?shù)70%預(yù)冷的乙醇洗滌2次，干燥。沉淀用100 μL TE(0.01 mol/L Tris，0.001 mol/L EDTA，pH 8.0)緩沖液溶解，冰凍保存。

1.4.2基因擴(kuò)增

為了考察金槍魚(yú)罐頭中DNA降解程度，以7種不同加工工藝的金槍魚(yú)罐頭為研究對(duì)象，1.4.1提取的線粒體基因組DNA為模板，參考文獻(xiàn)[8-9]，根據(jù)魚(yú)類(lèi)線粒體基因組(mt DNA)cytb基因和12Sr DNA 基因，選取3對(duì)通用引物(見(jiàn)表1)進(jìn)行PCR反應(yīng)。

表1　通用引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物大小

PCR擴(kuò)增體系為25μL：10×PCR buffer(Mg2+)2.5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)2μL，20 pmol/μL引物各1 μL，模板DNA 2 μL，Taq DNA Polymerase 0.3 μL(1.5U)，ddH2O 16.2 μL。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性300 s，94 ℃變性30 s，相應(yīng)退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)，最后在72 ℃延伸300 s。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4.3市售樣品基因擴(kuò)增

將市面上采集的17個(gè)金槍魚(yú)罐頭樣品的線粒體基因組DNA利用通用引物59-3/59-5進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并送往華大測(cè)序公司測(cè)序。

1.4.4數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用NCBI的BLAST程序，把所有樣品的PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已有金槍魚(yú)線粒體cytb基因序列進(jìn)行比較。

2結(jié)果與分析

2.1金槍魚(yú)罐頭DNA降解程度

由于金槍魚(yú)罐頭在加工過(guò)程中需經(jīng)過(guò)高溫高壓處理，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[10-11]，DNA片段降解嚴(yán)重，為了考察金槍魚(yú)罐頭中DNA降解程度，同時(shí)保證獲取足夠數(shù)量和質(zhì)量的DNA模板以適用于后續(xù)的分子生物學(xué)研究，使用表1中3對(duì)通用引物對(duì)提取的線粒體基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖見(jiàn)圖1，匯總結(jié)果見(jiàn)表2。

M-100bp Mark; 1-陽(yáng)性對(duì)照(黃鰭金槍魚(yú)生魚(yú)片)；2-金槍魚(yú)罐頭(咖喱口味)；3-塊裝金槍魚(yú)(礦泉水浸罐頭)；4-油浸長(zhǎng)鰭金槍魚(yú)罐頭；5-長(zhǎng)鰭金槍魚(yú)(水浸)；6-金槍魚(yú)罐頭(原味)；7-金槍魚(yú)罐頭(沙拉醬味)；8-長(zhǎng)鰭金槍魚(yú)罐頭(橄欖油浸漬)；9-空白圖1　3對(duì)通用引物(59-3/59-5、12S-F/12S-R、Cyt bL/ Cyt bH)PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1　PCR amplification results of three universal primers(59-3/59-5、12S-F/12S-R、Cyt bL/ Cyt bH)

提取的DNA質(zhì)量用不同長(zhǎng)度(123、224、358 bp)的目的片段來(lái)檢測(cè)。從圖1-A可以看出，所有樣品均可擴(kuò)增出123 bp目的片段，并且條帶明亮清晰。從圖1-B可以看出，3、4和8號(hào)罐頭樣品可以擴(kuò)增出224 bp的目的片段，1、2、5、6和7號(hào)罐頭樣品不能擴(kuò)增出224 bp目的片段。從圖1-C可以看出，除陽(yáng)性對(duì)照樣品外，所有的金槍魚(yú)罐頭樣品均不能擴(kuò)增出358 bp的目的片段。

表2　3對(duì)通用引物PCR擴(kuò)增結(jié)果匯總

注：“+”表示對(duì)應(yīng)的PCR檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，“-”表示對(duì)應(yīng)的PCR檢測(cè)結(jié)果為陰性。

結(jié)果說(shuō)明金槍魚(yú)罐頭中DNA降解嚴(yán)重，所獲得片段大小在100～200 bp，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[10-11]。主要原因是：(1)高溫加熱引起DNA的降解；(2)輔料的添加對(duì)DNA造成一定程度的損傷，如DNA對(duì)酸堿環(huán)境十分敏感，7號(hào)罐頭樣品添加有沙拉醬，樣品處于酸性環(huán)境中，使DNA降解程度更為嚴(yán)重。此外，罐頭中某些添加劑可能會(huì)對(duì)PCR擴(kuò)增造成一定的抑制作用。

2.2金槍魚(yú)罐頭樣品123 bp目的片段PCR擴(kuò)增及測(cè)序結(jié)果分析

以17個(gè)金槍魚(yú)罐頭樣品的線粒體基因組DNA

為模板，利用通用引物59-3/59-5進(jìn)行PCR擴(kuò)增，目的片段長(zhǎng)度為123 bp，擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖2。所有的樣品均可擴(kuò)增出清晰的條帶。將上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI上BLAST比對(duì)，比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表3。不同種類(lèi)的金槍魚(yú)所占百分比見(jiàn)表4。

M：M-100bp Mark；1-陽(yáng)性對(duì)照(黃鰭金槍魚(yú)生魚(yú)片)；2-金槍魚(yú)罐頭A；3-金槍魚(yú)罐頭B；4-金槍魚(yú)罐頭C；5-橄欖油浸金槍魚(yú)片；6-水浸金槍魚(yú)塊；7-水浸金槍魚(yú)；8-葵花籽油浸金槍魚(yú)；9-金槍魚(yú)罐頭(咖喱口味)；10-金槍魚(yú)罐頭(水浸)；11-金槍魚(yú)罐頭(植物油浸)；12-塊裝金槍魚(yú)(礦泉水浸罐頭)；13-橄欖油浸白肉金槍魚(yú)罐頭；14-金槍魚(yú)(辣味油浸罐頭)；15-油浸長(zhǎng)鰭金槍魚(yú)罐頭；16-長(zhǎng)鰭金槍魚(yú)(水浸)；17-植物油浸金槍魚(yú)；18-金槍魚(yú)罐頭(原味)；19-空白圖2　金槍魚(yú)罐頭樣品PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2　PCR amplification results of canned tuna

編號(hào)商品名Cytb序列號(hào)相似度/%鑒定結(jié)果 標(biāo)稱(chēng)原料2金槍魚(yú)罐頭AKF777811.1100Katsuwonuspelamis(鰹魚(yú))金槍魚(yú)3金槍魚(yú)罐頭BKF777811.1100Katsuwonuspelamis(鰹魚(yú))金槍魚(yú)4金槍魚(yú)罐頭CKF777811.1100Katsuwonuspelamis(鰹魚(yú))金槍魚(yú)5橄欖油浸金槍魚(yú)片KF777796.1100Thunnustonggol(青干金槍魚(yú))金槍魚(yú)6水浸金槍魚(yú)塊JN007677.198Thunnusalalunga(長(zhǎng)鰭金槍魚(yú))金槍魚(yú)7水浸金槍魚(yú)KF777811.198Katsuwonuspelamis(鰹魚(yú))金槍魚(yú)8葵花籽油浸金槍魚(yú)AB106835.1100Auxisthazard(扁鮀鰹)金槍魚(yú)9金槍魚(yú)罐頭(咖喱口味)KM605252.1100Katsuwonuspelamis(鰹魚(yú))金槍魚(yú)10金槍魚(yú)罐頭(水浸)JQ434036.198Katsuwonuspelamis(鰹魚(yú))金槍魚(yú)11金槍魚(yú)罐頭(植物油浸)—100Euthynnusaffinis(巴鰹)或Euthynnuslineatus(黑鮪)金槍魚(yú)12塊裝金槍魚(yú)(礦泉水浸)KF777796.1100Katsuwonuspelamis(鰹魚(yú))金槍魚(yú)13油浸白肉金槍魚(yú)罐頭KR023763.198Thunnusalalunga(長(zhǎng)鰭金槍魚(yú))金槍魚(yú)14金槍魚(yú)(辣味油浸罐頭)KF777811.1100Katsuwonuspelamis(鰹魚(yú))金槍魚(yú)15油浸長(zhǎng)鰭金槍魚(yú)罐頭KR023763.1100Thunnusalalunga(長(zhǎng)鰭金槍魚(yú))長(zhǎng)鰭金槍魚(yú)16長(zhǎng)鰭金槍魚(yú)(水浸)KR023763.1100Thunnusalalunga(長(zhǎng)鰭金槍魚(yú))長(zhǎng)鰭金槍魚(yú)17植物油浸金槍魚(yú)KF777811.1100Katsuwonuspelamis(鰹魚(yú))金槍魚(yú)18金槍魚(yú)罐頭(原味)KF777811.1100Katsuwonuspelamis(鰹魚(yú))金槍魚(yú)

注：“—”：表示不能對(duì)應(yīng)到具體的某一序列號(hào)。

本研究17個(gè)供試樣品中，能夠清晰的鑒定到原料物種水平的有16個(gè)樣品，10號(hào)樣品鑒定為巴鰹(E.affinis)或黑鮪(E.lineatus)。所有的樣品中，其中2個(gè)樣品能夠使消費(fèi)者清晰的了解該罐頭的魚(yú)源性成分，標(biāo)示到具體的種類(lèi)，其他15個(gè)樣品均標(biāo)示為金槍魚(yú)，對(duì)于具體的魚(yú)源性成分消費(fèi)者并不清楚。

表4　通用引物FINS鑒定結(jié)果

食品法典委員會(huì)CAC(CODEX STAN 70—1981)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，金槍魚(yú)屬、狐鰹屬、鰹屬和鮪屬中的14種金槍魚(yú)類(lèi)均可加工成金槍魚(yú)罐頭[12]，16個(gè)樣品符合該規(guī)定，而我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T24403—2009《金槍魚(yú)罐頭》中僅規(guī)定金槍魚(yú)罐頭原料為鰹魚(yú)和鮪魚(yú)類(lèi)[13]，11個(gè)樣品符合該規(guī)定。8號(hào)樣品鑒定為扁鮀鰹，不符合CAC標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定和我國(guó)《金槍魚(yú)罐頭》國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。

根據(jù)鑒定結(jié)果，所采集金槍魚(yú)罐頭樣品中有58.8%來(lái)源于價(jià)格低廉的鰹魚(yú)。這說(shuō)明市場(chǎng)上目前所銷(xiāo)售的金槍魚(yú)罐頭加工原料大部分為價(jià)格低廉的鰹魚(yú)，少數(shù)來(lái)自其他金槍魚(yú)種類(lèi)。基于11號(hào)樣品僅僅能夠鑒定到鮪魚(yú)屬，Genebank中關(guān)于黑鮪(E. lineatus)cytb基因序列相關(guān)信息較少，其中522 bp的黑鮪(E.lineatus)cytb基因序列與巴鰹(E.affinis)的線粒體cytb基因序列相比較，僅有3個(gè)堿基的差異，相似度高達(dá)99%，后續(xù)還需尋找其他區(qū)域cytb目標(biāo)基因或線粒體其他區(qū)域(比如COI基因)的目標(biāo)基因，將上述123 bp目標(biāo)基因與其他目標(biāo)基因結(jié)合起來(lái)進(jìn)行金槍魚(yú)種類(lèi)的鑒定，在一定程度上彌補(bǔ)單一分子標(biāo)記分析的不足。

3討論

利用PCR測(cè)序法來(lái)進(jìn)行物種鑒定的方法稱(chēng)為FINS法[14]。FINS方法對(duì)物種進(jìn)行鑒別基于核苷酸序列變異，所以選取的目標(biāo)基因要有足夠的種間變異及較低的種內(nèi)變異[15]。在近親緣海洋動(dòng)物種屬鑒別中，線粒體DNA作為核外遺傳物質(zhì)，具有分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、嚴(yán)格的母系遺傳、無(wú)重組、快速進(jìn)化、多拷貝及穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)[16]，因此廣泛的用于分析進(jìn)化關(guān)系。在線粒體基因內(nèi)，由于不同的區(qū)域進(jìn)化速率存在差異，從而使得不同區(qū)域適于分析不同的分類(lèi)單位。對(duì)于遠(yuǎn)緣物種間的分析可采用相對(duì)保守的基因序列進(jìn)行比較，例如，rDNA基因相對(duì)比較保守，常用于種或科以上水平的研究[17]。對(duì)于一些親緣關(guān)系較近的物種則需要依靠進(jìn)化速率相對(duì)較快的區(qū)域進(jìn)行分析，例如，cytb和D-loop基因進(jìn)化較快，適合種群水平差異的檢測(cè)[18]，尤其是cytb的結(jié)構(gòu)和功能較為清楚，現(xiàn)已被廣泛地用于親緣關(guān)系和系統(tǒng)進(jìn)化的研究。

本研究結(jié)果表明，所采集的17個(gè)市售金槍魚(yú)罐頭中，58.8%來(lái)源于價(jià)格低廉的鰹魚(yú)，其次還包括長(zhǎng)鰭金槍魚(yú)、青干金槍魚(yú)、扁鮀鰹、鮪魚(yú)。從分類(lèi)學(xué)的角度講，這幾個(gè)品種都屬于金槍魚(yú)類(lèi)，在營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和價(jià)格上存在較大的差異，但是它們親緣關(guān)系比較近，外形和質(zhì)地比較相似，特別是經(jīng)過(guò)原料處理、蒸煮、殺菌等不同的加工工藝加工成罐頭后，消費(fèi)者很難判斷其真實(shí)的魚(yú)源性成分。此外，在某些種類(lèi)的金槍魚(yú)魚(yú)體內(nèi)，組氨酸含量比其他品種金槍魚(yú)高很多，比如扁舵鰹極易腐敗，肌肉中高含量的游離組氨酸在產(chǎn)組胺菌的作用下容易發(fā)生脫羧反應(yīng)，生成大量組胺，為扁舵鰹的食用安全帶來(lái)了隱患[19]。

本研究中采用的PCR-FINS方法能夠準(zhǔn)確、快速的實(shí)現(xiàn)金槍魚(yú)罐頭中魚(yú)源性成分的鑒定，具有較強(qiáng)的實(shí)用性和應(yīng)用價(jià)值，可為食品安監(jiān)部門(mén)提供一定的借鑒和技術(shù)支持，對(duì)保護(hù)消費(fèi)者合法權(quán)益、規(guī)范金槍魚(yú)罐頭市場(chǎng)、保障食品質(zhì)量安全具有重要意義。該P(yáng)CR-FINS技術(shù)的建立為我國(guó)《金槍魚(yú)罐頭》標(biāo)準(zhǔn)與國(guó)際相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)接軌提供了技術(shù)依據(jù)，將進(jìn)一步提升和規(guī)范我國(guó)的罐頭工業(yè)市場(chǎng)。

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Development of a method for the identification of tuna species in canned tuna by FINS

AN Li-yan1,2，MENG Zhen1,2，QIU Kai1,2*，ZHONG Qi-ding1,2，YANG Tong-hui1,2， GUO Xin-guang1,2

1(China National Research Institute of Food and Fermentation Industries, Beijing 100015, China)2(National Standardization Center of Food and Fermentation, Beijing 100015, China)

ABSTRACTThis study aims to investigate the degree of DNA degradation and the species of tuna in the canned tuna products based on the analysis of fish mitochondrial genome including cytochrome b and 12S rDNA gene. A set of universal primers was used to amplify the targeted fragements with the length of 358 bp(cyt b)，224 bp(12S rDNA)，123 bp(cyt b)respectively. PCR-FINS technology was used to identify the tuna species in the canned tuna products by sequencing cytb gene of 123 bp, and 17 canned tuna products sourced from market were tested. Results showed that a very high degree of degradation in the canned tuna products for the DNA fragment sizes ranging from 100bp to 200bp. This study eastablished a accurate and reliable PCR-FINS technology with the ability to identify tuna species. Out of the 17 canned tuna samples, there were a variety of less valued species used; most popularly 58.8% of them were made from Katsuwonus, the remaining from Thunnus alalunga, Thunnus tonggol, Auxis thazard and Euthynnus.

Key wordsPCR-FINS;canned tuna;species identification

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201606028

收稿日期：2015-10-16，改回日期：2015-12-07

第一作者：碩士研究生(仇凱為通訊作者)。