考馬斯亮藍法定量評估綠茶澀味強度

宋亞賽，寧井銘，張正竹，丁玎，方駿婷，宛曉春

(安徽農(nóng)業(yè)大學 茶與食品科技學院，茶樹生物學與資源利用國家重點實驗室，安徽 合肥，230036)

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考馬斯亮藍法定量評估綠茶澀味強度

宋亞賽，寧井銘，張正竹，丁玎，方駿婷，宛曉春*

(安徽農(nóng)業(yè)大學 茶與食品科技學院，茶樹生物學與資源利用國家重點實驗室，安徽 合肥，230036)

摘要苦澀味是構成綠茶滋味的重要因子，但缺乏客觀的評價方法。文中對121個綠茶樣品中主要化學成分進行主成分和因子分析，得到了F1：苦、F2：鮮、F3：澀、F4：酸和F5：爽5個滋味復合因子，并篩選出36個茶樣進行定量感官澀味評估和考馬斯亮藍法測定。結果表明：5個滋味復合因子能很好地解釋綠茶“苦澀、鮮爽”的呈味特點；唾液淀粉酶沉淀指數(shù)與鮮味因子得分呈顯著負相關(P<0.05)，定量感官澀味得分與EGCG(表沒食子兒茶素沒食子酸酯)呈顯著正相關(P<0.01)，而唾液淀粉酶沉淀指數(shù)、定量感官澀味得分及澀味因子得分間相關性未達到顯著水平，綠茶茶湯澀味的產(chǎn)生不僅與酚類物質對唾液蛋白的沉淀有關，可能還存在其他的影響因素。

關鍵詞綠茶；澀味強度；定量評估；考馬斯亮藍法；唾液淀粉酶沉淀指數(shù)

澀味是口腔上皮細胞暴露在明礬或單寧溶液中，產(chǎn)生的一種干燥、收斂、粗糙的復合感覺[1]，適度的澀味被認為是構成綠茶口感與風味必不可少的因素之一[2]。研究表明，酯型兒茶素是形成綠茶苦澀味的主體成分[3-4]，咖啡堿、蘆丁等具有增強酯型兒茶素澀味強度的作用[5]，而茶氨酸、谷氨酸等鮮味氨基酸被認為可以降低綠茶的苦澀感[2]。所以，綠茶茶湯的澀感是多種成分共同作用的結果，但其成分間相互作用的機理尚不明確。近年來，ALESSANDRA RINALDI等人通過SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)法測定紅酒中酚類物質與唾液蛋白的結合沉淀反應，并利用SPI(唾液蛋白沉淀指數(shù)，saliva protein precipitation index)來評估紅酒的澀味強度，其分析結果與感官審評結果較一致[6-7]。KUMIKO HARA等人證明綠茶中EGCG(表沒食子兒茶素沒食子酸酯)具有明顯沉淀唾液蛋白的作用，而所沉淀蛋白中主要含有α-唾液淀粉酶[8]。

目前，評價綠茶滋味品質特征主要采用感官審評方法，該方法更適合評價綠茶整體特征，但對于單一滋味的呈味強度并不能量化評價。在感官審評中，澀味容易受苦味和酸味影響，澀味的延續(xù)效應也會帶來干擾，隨著茶湯攝取濃度、攝取量、單位時間攝取次數(shù)的增加而增強[6]。另外，審評人員的身體狀況、個人喜好，審評時茶湯的溫度、pH、離子濃度等都會對審評結果產(chǎn)生影響。

本研究采用考馬斯亮藍法，通過測定綠茶茶湯與α-唾液淀粉酶的結合沉淀反應，探究評估綠茶茶湯澀味強度的可行性。研究結果為探究定量評估綠茶茶湯澀感，以及影響茶湯澀感的各呈味成分間的相互作用關系，提供了新思路。

1材料與方法

1.1材料

121個不同產(chǎn)地綠茶樣品如表1所示。分別為湖北5個、四川5個、山東11個、陜西11個、廣東3個、云南1個、安徽27個、浙江19個、江蘇10個、湖南11個、貴州2個、廣西2個、福建2個、河南3個、江西7個、日本2個。每個產(chǎn)地都按照不同等級、不同品類進行隨機取樣，1～36號樣品進行了定量感官審評和考馬斯亮藍法測定。

1.2試劑與儀器

咖啡堿、EGC(表沒食子兒茶素)、C(兒茶素)、EC(表兒茶素)、EGCG、ECG(表兒茶素沒食子酸酯)、GA(沒食子酸)等標準品，純度均>99%，購于美國Sigma公司；色譜級純乙腈、純甲醇和純乙酸，美國Tedia公司；氨基酸與茶氨酸的混合標樣,氨基酸分析專用試劑AccQ.Tag(包括衍生化試劑AccQ.Fluor和磷酸緩沖鹽)，購于美國Waters公司；改良型Bradford蛋白濃度測定試劑盒，購于生工生物工程(上海)有限公司；α-唾液淀粉酶，購于Cellbio 生物(上海)有限公司；實驗所用的其他理化分析試劑均為分析純；HPLC用水為屈臣氏蒸餾水。

表1　121個不同產(chǎn)地綠茶樣品

HPLC系統(tǒng)：Waters 600高效液相色譜儀、600型的四元泵、熒光檢測器(型號為2475)、紫外可見光檢測器(型號2489)和Waters Empower色譜管理系統(tǒng)。HPLC氨基酸分析柱為美國Waters公司的AccQ.Tag C18氨基酸專用分析柱，HPLC色譜分析柱：Phenomenex Luna 5 μm, C18, 250 mm×4.6 mm Column；HPLC兒茶素色譜分析柱：Symmetry C18,5 μm,250 mm×4.6 mm Column.日本HITACHI公司的U-5100UV/VIS紫外分光光度計。

1.3實驗方法

1.3.1主要化學成分含量測定

兒茶素及咖啡堿含量測定，參照GB/8313—2008《茶葉中茶多酚和兒茶素含量的檢測方法》[9]；18種游離氨基酸含量測定參照Waters公司AccQ.Tag化學試劑包使用方法，色譜柱:AccQ.Tag C18氨基酸專用分析柱；干物質含量測定參照GB/T 8303—2013《茶 磨碎試樣的制備及其干物質含量測定》[10]。

1.3.2茶湯制備

按照GB/T 8302—2013《茶 取樣》[11]，GB/T 8303—2013《茶 磨碎試樣的制備及其干物質含量測定》[12]，稱取磨碎后茶樣3.00 g，加入150 mL沸水，浸提5 min，離心(3 500 r/min，10 min)，檢測備用。

1.3.3定量感官審評分析

感官審評人員的訓練和篩選參照SHU KANEKO等人的方法，最終選擇安徽農(nóng)業(yè)大學茶與食品科技學院四名評茶員進入最終審評小組。定量感官分析參照線性標度法[13](國際標準《BS ISO 4121:2003 Sensory analysis-Guidelines for the use of quantitative response scales》)和排序法[14](國際標準《BS ISO 16820:2004 Sensory analysis-Methodology Sequential analysis》)的方法原理，對澀味強度進行打分，不澀1分，微澀2分，較澀3分，澀4分，極澀5分。4位評茶員評分的平均值作為每個茶樣澀味強度的最終值。

1.3.4α-唾液淀粉酶——Bradford法

按照生工公司改良型Bradford蛋白濃度測定試劑盒方法建立BSA標準曲線；準確稱量100 mg人源α-唾液淀粉酶溶解于10 mL 37 ℃ ddH2O，離心(3 500 r/min，5 min)，取上清液作為α-唾液淀粉酶母液。

制樣：分別取300 μL α-唾液淀粉酶母液和100 μL樣品茶湯于1.5 mL離心管，記作C0；300 μL α-唾液淀粉酶母液和100 μL ddH2O,記作C1，100 μL樣品茶湯和300 μL ddH2O,記作C2?？焖贉u旋2～3 s，于37 ℃水浴20 min,反應后將混合物離心(10 000 r/min，10 min)取上清液。

染色：取混合物上清液100 μL，加入1 mL Bradford試劑，迅速混勻。混勻后，室溫靜置10 min，期間顛倒混勻2～3次。

測定：595 nm條件下，測定各樣品吸光值。根據(jù)標準曲線計算出蛋白濃度。C0值表示酚類物質與α-唾液淀粉酶結合反應后茶湯的蛋白含量水平，C1值表示原α-唾液淀粉酶的蛋白含量水平，C2值表示原茶湯的蛋白水平，則(C1+C2-C0)即為100 μL樣品茶湯沉淀出的唾液淀粉酶的蛋白含量。每組樣品需同時測定，從而消除茶湯中原可溶性蛋白含量的干擾，同時降低酚類物質與考馬斯亮藍染液反應所帶來的影響。最終，以沉淀出的唾液淀粉酶蛋白含量與原唾液淀粉酶的蛋白含量比值作為SAPI(唾液淀粉酶沉淀指數(shù)，saliva amylase precipitation index)，即

SAPI=(C1+C2-C0)/C1

(1)

SAPI值越高，表示該樣品對α-唾液淀粉酶沉淀能力越強。

1.4分析統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)基本分析在Excel中完成，主成分分析、因子分析及相關性分析等采用SPSS 17.0軟件進行運算，圖形繪制由Origin Pro8完成。

2結果與分析

2.1茶葉中主要呈味成分含量

分別測定121個綠茶樣品的兒茶素、咖啡堿和18種氨基酸含量，統(tǒng)計結果見表2、表3。EGCG是綠茶中主要的兒茶素類物質，茶氨酸是主要的氨基酸類物質，其中，EGCG和ECG被認為是主要的澀味成分，茶氨酸被認為是鮮味成分，可以緩解茶的苦澀味，增強甜味[15]，而高濃度的茶氨酸同時具有酸味。

表2　121個不同產(chǎn)地綠茶兒茶素與咖啡堿含量(占干物質含量/%)

表3　121個不同產(chǎn)地綠茶18種氨基酸含量(占干物質含量 mg/g)

2.2茶葉中主要呈味成分因子分析

對121個綠茶樣品的兒茶素、咖啡堿和18種游離氨基酸含量進行主成分分析和因子分析，原始數(shù)據(jù)經(jīng)過取樣適應性測量統(tǒng)計量(Kaiser-Meyer-Olkin, KMO)及Bartlett’s檢驗后發(fā)現(xiàn)，KMO值為0.879，Bartlett’s球形檢驗值為4 566，自由度為300，達0.01極顯著水平，表示適合進行因子分析[16]。

利用主成分分析進行因子提取，并以Varimax法進行因子轉軸，提取主特征值大于1的5個因子，特征值分別為12.76、3.01、2.48、1.42、1.07，解釋變異量分別為51.03%、12.05%、9.93%、5.68%、4.30%，累積的解釋變異量達82.98%，這表示因子分析結果能較好地代表原始變量。轉軸后因子負荷量分析結果如表4所示，選取每個因子中負荷值最大的1～3個變量(>0.5)進行統(tǒng)計，因子一解釋“纈氨酸”、“異亮氨酸”、“苯丙氨酸”、均具有苦味，所以將因子一，F(xiàn)1，命名為“苦味”；因子二，F(xiàn)2，可解釋“谷氨酸”、“茶氨酸”、“組氨酸”，其中“谷氨酸”、“茶氨酸”具有鮮味，“組氨酸”微苦，所以將因子二命名為“鮮味”；因子三，F(xiàn)3，可解釋“EGCG”、“ECG”和“咖啡堿”，所以將因子三命名為“澀味”；因子四，F(xiàn)4，主要僅解釋“沒食子酸”，具有酸味，所以將因子四命名為酸味，因子五，F(xiàn)5，主要解釋“C”、“EC”，具有柔和的澀感，所以定義為“爽”。因子分析結果很好地解釋了綠茶茶湯以苦澀、鮮爽為主體口感的呈味特征，利用該分析方法，并結合更全面得綠茶茶湯非揮發(fā)性成分含量的測定，可以更好地挖掘出綠茶茶湯中具有代表性的呈味特征成分。最終得到每個茶樣的5個因子得分，并進一步將各因子得分與定量感官審評得分和SAPI值進行皮爾遜相關性分析。

表4　主要化學成分旋轉成分矩陣a

提取方法 :主成分。 旋轉法 :具有 Kaiser 標準化的正交旋轉法。a. 旋轉在 6 次迭代后收斂。

2.3考馬斯亮藍法測定綠茶茶湯與α-唾液淀粉酶的結合沉淀結果

綠茶茶湯與α-唾液淀粉酶經(jīng)結合反應后離心，在離心管底部，可清晰地觀察到沉淀析出，如圖1所示。而原茶湯和原α-唾液淀粉酶溶液幾乎沒有沉淀析出，試驗現(xiàn)象說明綠茶茶湯確實有沉淀α-唾液淀粉酶的作用，其中EGCG被認為是主要的作用成分[8，17-18]。試驗所用α-唾液淀粉酶飽和母液的蛋白含量在220～240 μg/mL，標準蛋白曲線R2=0.997 8，在茶湯∶酶液(體積比)=1∶3水平下，茶湯對α-唾液淀粉酶的沉淀率在0.22～0.78之間，不同樣品間差異較大，如圖2所示。不同綠茶樣品對α-唾液淀粉酶的沉淀能力不同。在染色過程中，隨染色時間的延長，所測樣品的吸光值逐漸減少，這與考馬斯亮藍G-250染料分子之間，以及G-250與蛋白質復合物之間發(fā)生聚集反應有關，該改良型Bradford法蛋白濃度測定試劑盒能在一定程度上減少此類誤差，但嚴格控制每一個樣品的反應時間，有利于試驗結果更加穩(wěn)定可靠。

C1-原α-唾液淀粉酶溶液；C2-原茶湯溶液；C0-茶湯與α-唾液淀粉酶反應液圖1　綠茶茶湯對唾液淀粉酶的沉淀作用示意圖Fig.1　The precipitation of green tea infusion with saliva amylase

圖2　36個不同綠茶樣品的SAPIFig.2　The SAPI of 36 green tea samples in different production regions

2.4因子得分、SAPI和定量感官審評得分的皮爾遜相關性分析結果

對綠茶茶湯5個滋味因子得分、SAPI值與定量感官審評得分進行皮爾遜相關分析，結果如表5所示。SAPI值與鮮味因子得分呈顯著負相關(P<0.05)；與澀味因子得分呈正相關，但相關性系數(shù)較??；與定量感官審評澀味得分未表現(xiàn)出顯著相關性。定量感官審評澀味得分與EGCG含量呈極顯著正相關(P<0.01),同時澀味因子得分與EGCG含量呈極顯著正相關(P<0.01)，說明EGCG是影響澀味感官審評的重要因素。茶氨酸含量分別與苦味因子得分、鮮味因子得分呈極顯著正相關(P<0.01),與澀味因子呈極顯著負相關(P<0.01)，與酸味因子呈顯著正相關(P<0.05)，這可能說明茶氨酸在綠茶茶湯滋味構建中擔當了多重角色，需要進一步試驗證明。EGCG與酸味得分因子呈顯著負相關，而酸味因子主要解釋的是“GA”沒食子酸的含量，推測這可能與綠茶加工過程中EGCG的水解反應有關，同時EGCG與GA在呈味特征方面可能存在相互作用關系。

表5　SAPI，因子得分和定量感官審評澀味得分的皮爾遜相關性分析

*. 在 0.05 水平(雙側)上顯著相關；**. 在 0.01 水平(雙側)上顯著相關。

3結論和討論

5個表征綠茶滋味特征的復合因子，能解釋綠茶“苦澀、鮮爽”為主的呈味特點。同時，如果對綠茶樣品進行更全面的非揮發(fā)性成分測定，則有可能得到更具有代表性的滋味特征成分，該方法同樣適用于探究其他茶類的滋味特征因子。

通過設計雙空白對照(原α-唾液淀粉酶空白組和原茶湯空白組)，和嚴格控制每一個樣品的反應時間及反應劑量，可以減少茶湯本身可溶性蛋白和茶湯中酚類物質與考馬斯亮藍染料分子間結合反應所帶來的干擾，從而提高試驗結果的準確性。但目前市售人源α-唾液淀粉酶標品純度低、活性小，這給試驗結果帶來不可避免的誤差。利用考馬斯亮藍法測定綠茶茶湯與α-唾液淀粉酶的沉淀結合反應，其反應條件和反應參數(shù)都需要更加系統(tǒng)的研究，該方法也同樣適用于探究其他茶類對α-唾液淀粉酶的沉淀能力，從而進一步探究其與滋味的關系。

通過皮爾遜分析，定量感官審評澀味得分和SAPI值未表現(xiàn)出顯著相關性，說明SAPI法不能夠完全取代感官審評來評估綠茶的澀味強度，感官審評中澀味強度的感知受口腔內酚類物質及其他呈味成分的共同影響，所以感官審評澀味得分與EGCG含量表現(xiàn)出顯著相關而與澀味因子得分未表現(xiàn)出顯著相關。SAPI法所表征的綠茶茶湯沉淀α-唾液淀粉酶的能力可能只與酚類物質的含量有關，而無法捕捉其他成分對澀味的影響，但有關綠茶茶湯中能夠沉淀α-唾液淀粉酶的化學成分還需要對反應后的上清液以及沉淀物進行細致分析才能確定，同時茶湯中可能存在著其他成分影響多酚類物質與α-唾液淀粉酶的結合反應。

本試驗是為了實現(xiàn)定量評估綠茶茶湯澀味強度而研究采用的一種新方法，雖然利用該方法表征出不同綠茶對α-唾液淀粉酶的沉淀能力，但是沉淀能力與定量感官澀味審評和茶湯澀味因子得分間均未表現(xiàn)出顯著相關性。據(jù)此，我們推測綠茶茶湯澀味的產(chǎn)生不僅與口腔中唾液蛋白的沉淀有關，可能還存在其它產(chǎn)生途徑。此外，利用SDS-PAGE法測定茶湯與唾液蛋白的結合沉淀反應來評估綠茶茶湯的澀味強度可能更具有實踐價值，有待于進一步探究。

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Study on the quantitative evaluation of green tea astringency intensity using Bradford method

SONG Ya-sai, NING Jing-ming, ZHANG Zheng-zhu, DING Ding,FANG Jun-ting, WAN Xiao-chun*

(State Key Laboratory of Tea Plant Biology and Utilization,College of Food Science and Technology， Anhui Agricultural University，Hefei 230036,China)

ABSTRACTNo method is available in evaluating the bitterness and astringency of green tea. Factors analysis was used to study the main chemical components in 121 green teas. Five main factors F1: bitterness, F2:umami, F3:astringency, F4:sourness and F5:refreshing were obtained, which could explain the feature of green tea taste. There are 36 samples which were measured by quantitative sensory evaluation and Bradford method, the result showed that the SAPI (saliva amylase precipitation index) and umami factor scores had significant negative correlation (P<0.05), quantitative sensory scores and EGCG had significant correlation(P<0.01); However, the correlation of SAPI, quantitative sensory scores and astringency factor scores was below the significant level. This indicated other possible influencing factors besides polyphenols precipitate saliva protein may need to be considered. This research can be used as a reference for the further study of the mechanism of astringency in green tea.

Key wordsgreen tea;astringency intensity;quantitative evaluation;Bradford method；SAPI

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201606025

基金項目：國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(茶葉)產(chǎn)業(yè)體系建設專項(CARS-23)；國家質量檢驗檢疫總局公益性項目(201410225)

收稿日期：2015-10-07，改回日期：2015-11-18

第一作者：碩士研究生(宛曉春教授為通訊作者,E-mail：xcwan@ahau.edu.cn)。