5種甘肅道地中藥對衰老小鼠免疫功能影響的比較研究

王 昱

（隴南師范高等專科學(xué)校生化系，甘肅 成縣 742500）

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5種甘肅道地中藥對衰老小鼠免疫功能影響的比較研究

王 昱

（隴南師范高等?？茖W(xué)校生化系，甘肅 成縣 742500）

［摘 要］目的：研究5種甘肅道地中藥對衰老小鼠免疫功能影響的差異。方法：將70只健康小鼠隨機分成正常組、模型組、紋黨組、紅芪組、當(dāng)歸組、大黃組和半夏組，采用D-半乳糖建立亞急性衰老小鼠模型，檢測每組小鼠的脾臟和胸腺指數(shù)，血IL-1、IL-2、IL-4含量及T淋巴細(xì)胞亞群，T淋巴細(xì)胞增殖能力，脾胸腺超氧化物歧化酶（SOD），谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性和丙二醛（MDA）含量。結(jié)果：與正常組相比，模型組小鼠脾臟和胸腺指數(shù)，血IL-1、IL-2、IL-4、CD4+T細(xì)胞和CD4+/CD8+T細(xì)胞比值，脾T淋巴細(xì)胞增殖能力，脾和胸腺SOD、GSH-Px活性均顯著降低，MDA含量顯著升高（p<0.05，p<0.01）。與模型組比較，各中藥組小鼠脾臟和胸腺指數(shù)，血IL-1、IL-2、IL-4、CD4+T細(xì)胞和CD4+/CD8+T細(xì)胞比值，脾T淋巴細(xì)胞增殖能力，脾和胸腺SOD、GSH-Px活性均呈增高趨勢，MDA含量均呈降低趨勢，紋黨組和紅芪組上述指標(biāo)改變更為明顯。結(jié)論：紋黨和紅芪水提物對衰老小鼠某些免疫功能的調(diào)節(jié)作用優(yōu)于當(dāng)歸、大黃和半夏。

［關(guān)鍵詞］道地中藥；衰老；免疫；小鼠

衰老是生命過程中不可抗拒的自然規(guī)律。隨著我國老年人口比重的增加和老年性相關(guān)疾病的增多，衰老與延緩衰老已經(jīng)逐步成為我國重大的公共衛(wèi)生問題［1］。研究認(rèn)為，免疫功能的衰退是造成機體衰老的重要原因，免疫系統(tǒng)從根本上參與了機體的衰老過程［2］。中醫(yī)藥獨特的理論體系為人們提供了一條有別于其他藥物防治衰老的新治療途徑。由于中藥具有活性成分多、作用靶點多、給藥途徑多、不良反應(yīng)小等特點，使其具有獨特優(yōu)勢，在抗衰老的研究中顯示出巨大的優(yōu)勢和潛力，其藥理學(xué)功能有延緩衰老、抗氧化、調(diào)節(jié)體液免疫、促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖、影響免疫器官的質(zhì)量和單核巨噬細(xì)胞的功能等［3-4］。

甘肅省隴南地區(qū)有許多優(yōu)質(zhì)的道地中藥材，其中以文縣的紋黨、武都的紅芪、宕昌的當(dāng)歸、禮縣的大黃和西和的半夏最為馳名。已有文獻(xiàn)報道，紋黨、紅芪、當(dāng)歸、大黃和半夏有延緩衰老、抗氧化、抗病毒和提高機體免疫力等功能［5-9］。本研究制備了D-半乳糖致衰老小鼠模型，分析比較紋黨、紅芪、當(dāng)歸、大黃和半夏對衰老小鼠免疫功能影響的差異，為進(jìn)一步指導(dǎo)臨床合理用藥奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

甘肅武都產(chǎn)紅芪、宕昌產(chǎn)當(dāng)歸、文縣產(chǎn)紋黨、禮縣產(chǎn)大黃、西和產(chǎn)半夏（由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)李唯教授鑒定）；D-半乳糖（北京優(yōu)尼康生物科技）；刀豆蛋白A（ConA）和四甲基偶氮唑鹽（MTT）（美國Sigma公司）；DMSO（上海碧云天生物技術(shù)公司）；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）（南京建成生物工程研究所）；小鼠白細(xì)胞介素1（IL-1β）、白細(xì)胞介素2（IL-2）、白細(xì)胞介素4（IL-4）ELISA試劑盒（武漢博士德生物工程研究所）；二氧化碳培養(yǎng)箱（日本 Sanyo公司）；PC5標(biāo)記的抗大鼠CD3抗體、FTTC標(biāo)記的抗大鼠CD4抗體、PE標(biāo)記的抗大鼠 CD8抗體（均為Biolegend公司）。FACS420型流式細(xì)胞儀（美國BD公司生產(chǎn)），U-1800型UV-VIS全自動分光光度計（日本 Tokyo），SpectraMaxM5型酶標(biāo)儀（Molecular Devices，美國），高速臺式冷凍離心機（TGL-16M，美國Beckman）等；70只清潔級昆明小鼠（蘭州大學(xué)實驗動物中心，生產(chǎn)許可證編號: SCXK（甘）2009-0004），體質(zhì)量18～20 g，雌雄各半。

1.2方法

1.2.1中藥水煎劑溶液的制備

稱取中藥50 g置砂鍋中，加10倍量水浸泡過夜，加熱至沸，改用文火煎30 min，趁熱濾過，濾渣另加8倍量水，同法煎煮30 min、濾過，合并2次濾液于燒杯中［10］，水浴濃縮后放涼至室溫，100 mL容量瓶定容，倒入輸液瓶中，蓋薄膜，壓膠塞和鋁蓋，高壓滅菌（表壓0.7 kg·cm-2、115℃、30 min），取出放涼稀釋為1 g·kg-1溶液備用。

1.2.2動物模型建立與給藥

健康昆明小鼠70只，同條件飼養(yǎng)，喂食普通固體飼料，自由飲水。隨機分正常組、模型組、紅芪組、當(dāng)歸組、紋黨組、大黃組和半夏組，每組10只。除正常組外，其余各組動物頸背部皮下注射10% D-半乳糖（10 mL·kg-1），每天1次，連續(xù)注射14 d，于第15 d天開始（每天繼續(xù)注射D-半乳糖），紅芪組、當(dāng)歸組、紋黨組、大黃組和半夏組每天灌胃藥物治療，給藥容積10 mL·kg-1，正常組和模型組每天灌胃等體積的生理鹽水，每天1次，各組連續(xù)給藥和造模32 d。

1.2.3計算脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)

于末次給藥的次日，每組小鼠稱體質(zhì)量后，頸椎脫臼處死各組小鼠，取小鼠的脾臟和胸腺，用生理鹽水洗凈，吸干生理鹽水，稱質(zhì)量。臟器指數(shù)（mg·g-1）=臟器濕重（mg）/小鼠體質(zhì)量（g）。

1.2.4 血清IL-1、IL-2、IL-4含量的測定

動脈采血，離心 10 min（3 000 r·min-1），取上清液，按照檢測試劑盒說明書操作，檢測小鼠血清中IL-1、IL-2、IL-4含量。

1.2.5外周血T淋巴細(xì)胞亞群分析

動脈采血，加入EDTA鈉鹽抗凝管中，用熒光團(tuán)標(biāo)記的單克隆抗體試劑與100 μL全血混勻，室溫避光孵育15 min。經(jīng)溶血儀處理后，采用流式細(xì)胞儀檢測分析T淋巴細(xì)胞百分率。

1.2.6脾T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)測定

處死動物后無菌取脾，置于盛有適量淋巴細(xì)胞分層液的平皿，洗去血跡，剪去筋膜組織，研碎脾臟，200目細(xì)胞篩網(wǎng)過濾，Hank’s液洗滌兩次，重新懸浮，調(diào)整細(xì)胞密度為1×107/mL。將細(xì)胞懸液加入96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，每個樣本設(shè)8個復(fù)孔，其中4孔每孔加100 μL Con A（終濃度為5 mg·L-1），另外4孔作為對照，于37℃ 5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)68 h，每孔加10 μL MTT（濃度為5 g·L-1），在振蕩器上振蕩混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。細(xì)胞培養(yǎng)終止后，棄上清，每孔加入100 μL DMSO，振蕩混勻，靜置數(shù)分鐘，測定每孔的 OD492 nm值。

1.2.7脾臟胸腺抗氧化能力的測定

取小鼠脾臟、胸腺組織，洗凈，冰浴勻漿，離心10 min（3 000 r·min-1），取上清液，按照試劑盒操作步驟測定SOD、GSH-Px活性和MDA含量。

1.2.8數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，LSD法進(jìn)行組間兩兩比較，以p< 0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1小鼠臟器指數(shù)比較

模型組小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)比正常組均降低（p<0.05），紋黨組小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)比模型組脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)顯著升高（p< 0.05），其余各給藥組間小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)與模型組相比，無明顯變化（p>0.05，如表1所示）。

2.2小鼠血清IL-1、IL-2、IL-4含量的比較

與正常組相比，模型組小鼠血清IL-1、IL-2、IL-4含量顯著降低（p<0.05，p<0.01）。與模型組相比，各給藥組小鼠血清IL-1、IL-2、IL-4含量均呈升高趨勢，但紋黨組和紅芪組小鼠血清IL-1、IL-2、IL-4含量顯著高于模型組（p<0.05，p<0.01），且紋黨組小鼠血清IL-1、IL-2、IL-4含量高于紅芪組（p< 0.05），其余各給藥組間小鼠血清IL-1、IL-2、IL-4含量與模型組相比，無顯著差異（p>0.05，如表2所示）。

表1　5種中藥對脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響Table 1 Effects of five kinds of Chinese herbs on spleen and thymus gland index（mg·g-1）

表2　5種中藥對血清IL-1、IL-2、IL-4含量的影響Table 2 Effects of five kinds of Chinese herbs on levels of serum IL-1，IL-2 and IL-4（ng·L-1）

2.3小鼠脾T淋巴細(xì)胞增殖能力比較

與正常組相比，模型組小鼠脾T淋巴細(xì)胞增殖能力顯著降低（p<0.01）。與模型組相比，紋黨組、紅芪組和當(dāng)歸組小鼠脾T淋巴細(xì)胞增殖能力顯著高于模型組（p<0.05，p<0.01），紋黨組小鼠脾T淋巴細(xì)胞增殖能力高于紅芪組和當(dāng)歸組（p< 0.05），紅芪組小鼠脾T淋巴細(xì)胞增殖能力與當(dāng)歸組間無顯著差異（p>0.05），大黃組和半夏組小鼠脾T淋巴細(xì)胞增殖能力與模型組相比，無顯著差異（p>0.05，如圖1所示）。

2.4外周血T淋巴細(xì)胞亞群的比較

與正常組比較，模型組小鼠 CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞及CD4+/CD8+T細(xì)胞比值明顯降低（p <0.05，p<0.01）。各給藥組與模型組比較，紋黨組和紅芪組CD4+T細(xì)胞及CD4+/CD8+T細(xì)胞比值增加明顯（p<0.05），CD8+T細(xì)胞無明顯變化（p >0.05），紋黨組和紅芪組間無顯著差異（p> 0.05），其他各組 CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞及CD4+/CD8+T細(xì)胞比值均無明顯變化（p>0.05，如表3所示）。

表3　5種中藥對外周血T淋巴細(xì)胞亞群的影響Table 3 Effect of five kinds of Chinese herbs on peripheral blood T lymphocyte subsets

2.5小鼠脾臟和胸腺SOD、GSH-Px、MDA比較

與正常組相比，模型組小鼠脾臟和胸腺SOD、GSH-Px活性顯著降低，MDA含量顯著增加（p< 0.01）。與模型組相比，各給藥組小鼠脾臟和胸腺SOD、GSH-Px活性均有升高趨勢，MDA均有降低趨勢，其中紋黨組、紅芪組和當(dāng)歸組小鼠脾臟和胸腺SOD、GSH-Px、MDA與模型組差異極顯著（p< 0.01），紋黨組、紅芪組和當(dāng)歸組間均無差異（p> 0.05）；大黃組和半夏組小鼠脾臟和胸腺 SOD、GSH-Px、MDA與模型組差異顯著（p<0.05），大黃組和半夏組間無顯著性差異（p>0.05，如表4所示）。

3　討論

衰老是機體的生理功能逐漸下降，組織器官逐步發(fā)生退行性改變，并最終走向死亡的過程。免疫學(xué)說認(rèn)為，免疫組織和免疫器官的功能狀態(tài)與衰老的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)，機體免疫功能失調(diào)，可誘發(fā)嚴(yán)重的疾病，加劇細(xì)胞、組織和器官的衰老過程［2］。據(jù)文獻(xiàn)報道，紋黨［5］、紅芪［6］、當(dāng)歸［7］、大黃［8］、半夏［9］及其有效提取物均可以通過調(diào)節(jié)機體體液免疫、細(xì)胞免疫和抗氧化等，來達(dá)到增強機體免疫功能的能力。為了更好地區(qū)別紋黨、紅芪、當(dāng)歸、大黃和半夏的藥理作用，實驗從免疫系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)著手，綜合比較紋黨、紅芪、當(dāng)歸、大黃和半夏水提物對衰老小鼠免疫功能的影響。

表4　5種中藥對脾臟和胸腺SOD、GSH-Px、MDA的影響Table 4 Effect of five kinds of Chinese herbs on levels of SOD，GSH-Px and MDA in spleen and thymus gland

脾臟是人體最大的免疫器官，含有大量的淋巴細(xì)胞和巨嗜細(xì)胞，是機體細(xì)胞免疫和體液免疫的中心，同時也是重要的造血器官。胸腺是機體的中樞免疫器官，能產(chǎn)生淋巴細(xì)胞，并運送到淋巴結(jié)和脾臟等處［5］。所以，脾臟、胸腺指數(shù)是反應(yīng)機體免疫功能的重要指標(biāo)。本實驗結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠的脾臟、胸腺指數(shù)顯著降低；與模型組比較，紋黨組小鼠兩器官指數(shù)顯著升高，而其余各給藥組小鼠兩器官指數(shù)與模型組相比差異不顯著，表明紋黨對衰老小鼠重要臟器脾臟、胸腺具有較好的保護(hù)作用，與其他單一性抗衰老藥物相比，體現(xiàn)了紋黨抑制衰老的優(yōu)越性。

IL-1主要由活化的單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，能促進(jìn)T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的增殖分化，增強NK細(xì)胞的殺傷活性，也可以誘導(dǎo)其他多種細(xì)胞因子的分泌［11］。IL-2主要由T細(xì)胞產(chǎn)生，以自分泌和旁分泌方式發(fā)揮效應(yīng)，是機體免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中的核心物質(zhì)，能夠活化T細(xì)胞、刺激NK細(xì)胞增殖、增強NK殺傷活性及產(chǎn)生細(xì)胞因子、促進(jìn)B細(xì)胞增殖和分泌抗體、激活巨噬細(xì)胞等。IL-4主要由 CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生，主要作用于B細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞等4種靶細(xì)胞，具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用［12］。T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的免疫應(yīng)答為細(xì)胞免疫，一方面它可以與靶細(xì)胞特異性結(jié)合，直接殺傷靶細(xì)胞，另一方面它可以直接釋放淋巴因子，最終使免疫效應(yīng)擴大和增強，故T淋巴細(xì)胞增殖能力的強弱，可以反映機體細(xì)胞免疫功能的高低［13］。本實驗結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組小鼠血清IL-1、IL-2、IL-4含量及脾T淋巴細(xì)胞增殖能力顯著降低，這與文獻(xiàn)［12-13］報道一致。與模型組相比，各給藥組小鼠血清IL-1、IL-2、IL-4含量及脾T淋巴細(xì)胞增殖能力均呈升高趨勢，其中紋黨和紅芪效果更為明顯，表明紋黨和紅芪在提高衰老小鼠機體特異性免疫和非特異性免疫方面高于其他幾種中藥。

CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞是鑒定T細(xì)胞亞群的重要表面標(biāo)志。CD4+T細(xì)胞協(xié)助B細(xì)胞進(jìn)行分化和產(chǎn)生抗體，CD8+T細(xì)胞主要是具有殺傷和抑制作用，CD4+/CD8+T細(xì)胞比值能夠作為初步評估機體免疫系統(tǒng)是否維持在一個平衡狀態(tài)的重要指標(biāo)，其值下降表示免疫狀態(tài)受抑制［14］。所以，在抗衰老藥物的治療結(jié)果檢測中，常以T淋巴細(xì)胞的變化作為重要的參考指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠 CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞及 CD4+/ CD8+T細(xì)胞比值明顯低于正常組，提示D-半乳糖可造成機體細(xì)胞免疫功能受損。與模型組比較，灌服紋黨和紅芪均可顯著增加衰老小鼠外周血CD4+T細(xì)胞及CD4+/CD8+T細(xì)胞比值，而CD8+T細(xì)胞無顯著性差異，表明紋黨和紅芪在維持CD4+T細(xì)胞比例的相對平衡狀態(tài)方面，具有一定療效，但這種作用的分子機制還有待于進(jìn)一步研究。

SOD和GSH-Px是動物機體內(nèi)重要的抗氧化劑，MDA是自由基和脂質(zhì)過氧化的代謝終產(chǎn)物。因此，檢測組織中SOD及GSH-Px活性以及MDA含量，可以了解組織過氧化損傷的程度［15］。本實驗發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠脾臟和胸腺SOD、GSH-Px的活性均顯著低于正常組，MDA的含量顯著增加，經(jīng)紋黨、紅芪、當(dāng)歸、大黃和半夏灌胃處理后小鼠脾臟和胸腺SOD、GSH-Px的活性均顯著升高，MDA的含量顯著降低，與模型比較均有統(tǒng)計學(xué)意義，其中紋黨組、紅芪組和當(dāng)歸組小鼠脾臟和胸腺SOD、GSHPx、MDA與模型組間差異極顯著，表明這5種道地中藥在抗脂質(zhì)過氧化和清除氧自由基的作用方面具有相似的功能，而紋黨、紅芪、當(dāng)歸在提高機體抗氧化能力方面高于大黃和半夏。

綜上所述，紋黨、紅芪等水煎液對衰老小鼠免疫系統(tǒng)均有不同程度的調(diào)整作用，尤以紋黨、紅芪作用為甚。這種作用可能與免疫器官抗氧化酶活性、T淋巴細(xì)胞增殖力、T細(xì)胞亞群和細(xì)胞因子IL-1、IL-2、IL-4分泌等變化有關(guān)。據(jù)此，在治療臨床免疫相關(guān)疾病、延緩機體的衰老進(jìn)程時可以優(yōu)選紋黨和紅芪，也為道地中藥復(fù)方的開發(fā)提供了實驗依據(jù)。

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（責(zé)任編輯 柴 智）

Comparative Study on the Immune Function of Five Kinds of Gansu Authentic Chinese Herbal Medicines in Aging Mice

WANG Yu
（Department of Biology and Chemistry，Longnan Teachers College，Chengxian Gansu 742500，China）

Abstract:The objective of this research is to study the different influences of five kinds of Gansu authentic Chinese herbal medicines on the immune function in aging mice.Seventy mice were randomly divided into normal control group，model group，Codonopsis pilosula group，Astragali radix group，Angelica sinensis group，Rheum palmatum L group and Pinellia ternate group.Aging mice models were made by D-galactose.The indexes of spleen and thymus gland，the levels of serum interleukin-1β（IL-1），interleukin-2（IL-2），interleukin-4（IL-4），T lymphocyte subsets，proliferation of T cells，and the activities of superoxide dismutase（SOD），glutathione peroxidase（GSH-Px）and the content of malondialdehyde（MDA）in spleen and thymus gland were detected. Compared with normal control group，the indexes of spleen and thymus gland，the levels of serum IL-1，IL-2，IL-4，T lymphocyte subsets（CD4+and CD4+/CD8+），proliferation of T cells，and the activities of SOD，GSH-Px in spleen and thymus gland were markedly reduced in aging model group，the content of MDA was markedlyincreased（p<0.05，p<0.01）.Compared with model group，the indexes of spleen and thymus gland，the levels of serum IL-1，IL-2，IL-4，T lymphocyte subsets（CD4+and CD4+/CD8+），proliferation of T cells，and the activities of SOD，GSH-Px in spleen and thymus gland showed increasing trend，MDA content tended to decrease in herb groups（p<0.05，p<0.01）.These above indexes became more significant in the Codonopsis pilosula group and Astragali radix group.The results showed that the aqueous extracts of Codonopsis pilosula and Astragali radix have better regulation effects on the immune function in aging mice than those of Angelica sinensis，Rheum palmatum L and Pinellia ternata.

Key words:Authentic Chinese herbs；Aging；Immunity；Mouse

［中圖分類號］R 285.5

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

［文章編號］1005-0310（2016）02-0077-06

DOI：10.16255/j.cnki.ldxbz.2016.02.014

［收稿日期］2015-11-07

［基金項目］甘肅省自然科學(xué)基金項目（1107RJZK243），甘肅省高等學(xué)校科研資助項目（2015B-148）。

［作者簡介］王昱（1973-），男，甘肅省天水市人，隴南師范高等?？茖W(xué)校教授，研究方向為細(xì)胞與發(fā)育生物學(xué)。E-mail:gswangyu@126.com