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    基于血清代謝組學(xué)的2型糖尿病大鼠運動干預(yù)的定量生物學(xué)研究

    2016-07-18 09:33:20李蕾劉承宜
    體育學(xué)刊 2016年4期
    關(guān)鍵詞:組學(xué)造模定量

    李蕾 劉承宜

    摘 要:基于血清代謝組學(xué)和定量差異探討2型DM大鼠的運動干預(yù)機(jī)制。Sprague dawley大鼠分為正常對照組(NC)、DM模型組(DMC)和DM運動干預(yù)組(DME)。DMC和DME組大鼠予以高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周,以40 mg/kg腹腔注射鏈脲佐菌素造模穩(wěn)定1周。DME組大鼠實施游泳運動干預(yù)8周。采用超高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLC/Q-TOF MS)技術(shù)對不同組別大鼠的血清進(jìn)行代謝組學(xué)分析,利用定量差異對代謝組學(xué)獲得的生物標(biāo)記物進(jìn)行篩選。結(jié)果顯示:1)DME組、DMC組和NC組的血清代謝譜明顯分離,表明DME組血清代謝譜與DMC組和NC組之間有顯著的變化;2)血清中精氨酸、脯氨酸-甜菜堿、二十碳五烯酸、亞麻酸、丙基肉堿、單甘油酸酯(24:6)、肉毒堿、1-磷酸鞘氨醇、葡糖酸、和磷酸膽堿(20:3)共10種代謝產(chǎn)物在DMC組和NC組間存在顯著性定量差異(l>0.80),除了單甘油酸酯(24:6)和磷酸膽堿(20:3)外,8周游泳訓(xùn)練可以將DME大鼠體內(nèi)的其它8種物質(zhì)恢復(fù)到與NC組沒有顯著性差異(l<0.47)。結(jié)果表明:(1)游泳訓(xùn)練可以完全康復(fù)2型DM大鼠。(2)多不飽和脂肪酸和精氨酸代謝有望成為今后研究運動干預(yù)2型DM機(jī)制的新鮮靶點。

    關(guān) 鍵 詞:運動醫(yī)學(xué);2型糖尿病;運動干預(yù);代謝組學(xué);定量差異;大鼠

    中圖分類號:G804.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號:1006-7116(2016)04-0140-05

    Quantitative biological study of exercise intervention on type 2 diabetes mellitus

    rats based on serum metabonomics

    LI Lei1,LIU Cheng-yi2

    (1.School of Physical Education,Huaibei Normal University,Huaibei 235000,China;2.Laboratory of Laser Sports Medicine,School of Physical Education,South China Normal University,Guangzhou 510006,China)

    Abstract: In order to probed into the mechanism of exercise intervention on type 2 diabetes mellitus (DM) rats based on serum metabonomics and quantitative difference, the authors divided Sprague Dawley rats into a normal control group (NC), a DM control group (DMC) and a DM exercise group (DME), fed the rats in groups DMC and DME with high-sugar high-fat feed for 4 weeks, and intraperitoneally injected them with streptozotocin at a dose of 40 mg/kg body weight for 1 week in order to stabilize model establishment, implemented swimming intervention on the rats in group DME for 8 weeks, carried out a metabonomic analysis on the serum of the rats in different groups by using ultra performance liquid chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry (UPLC/Q-TOF MS), screened biomarkers acquired from the metabonomic analysis by utilizing quantitative difference, and revealed the following findings: 1) there was a clear separation of serum metabolic profile of the rats in groups DME, DMC and NC, indicating that there was a significant change in serum metabolic profile between the rats in group DME and the rats in groups DMC and NC; 2) between the rats in groups DMC and NC, there was a significant quantitative difference in Arginine, Proline betaine, Eicosapentaenoic acid, Linolenic acid, Propionyl-L-carnitine, MG(24:6), Carnitine, Sphingosine-1-phosphate, Gluconic acid and PE(20:3)(l>0.80), except MG(24:6) and PE(20:3) were completely recovered after 8-week exercise intervention(l<0.47). The said findings indicate the followings: 1) swimming training can fully rehabilitate type 2 DM rats; 2) polyunsaturated fatty acid and arginine metabolism are hopefully to become new targets of study of the mechanism of exercise intervention on type 2 DM in the future.

    Key words: sports medicine;type 2 diabetes mellitus;exercise intervention;metabonomics;quantitative difference;rat

    DM運動干預(yù)研究已經(jīng)有90年的歷史了[1]。然而,對運動療法的防治機(jī)理仍缺乏系統(tǒng)深入的認(rèn)識;其臨床療效對疾病死亡率的影響依然不大。這可能與傳統(tǒng)的“還原論”思維指導(dǎo)下的實驗方法不足有一定關(guān)系[2](微觀靶點繁多,整體靶點不明確);也可能與傳統(tǒng)的完全依賴零假設(shè)統(tǒng)計檢驗(Null Hypothesis Statistical Testing,NHST)有一定關(guān)系[3-4]。

    “代謝組學(xué)”是指對生物體內(nèi)相對分子質(zhì)量小于1 000的低相對分子質(zhì)量代謝物的變化進(jìn)行檢測、確定、定量和分類,尋找它們在類型和數(shù)量上的變化與生理病理變化之間的關(guān)系和動態(tài)規(guī)律[5]。鑒于運動干預(yù)機(jī)制具有多靶點、非特異性、成組調(diào)節(jié)的特點,有學(xué)者認(rèn)為可以把“代謝組學(xué)”方法作為運動人體科學(xué)研究中的一個有力的新工具,并定義為“運動代謝組學(xué)”(sportomics)[2,6]。2型DM作為代謝性疾病的典型,是代謝組學(xué)方法非常適宜的研究對象。在利用代謝組學(xué)技術(shù)研究運動干預(yù)代謝紊亂的相關(guān)文獻(xiàn)中,急性運動的偏多,慢性運動的很少。尤其是缺乏對慢性疾病動物模型的長期的、縱向的研究??墒?,已有的代謝組學(xué)研究結(jié)果顯示,疾病和干預(yù)后機(jī)體的代謝紊亂物質(zhì)及代謝通路繁多,缺乏有效的篩選方法鎖定差異代謝物,導(dǎo)致機(jī)制闡釋泛泛而無針對性。因此,也限制了代謝組學(xué)方法在干預(yù)效應(yīng)研究中的應(yīng)用。劉承宜等[7-8]引入黃金分割常數(shù)來度量差異,并提出了定量差異的概念,為差異代謝物的篩選和更好地闡釋運動效應(yīng)的定量生物學(xué)內(nèi)涵提供了方法學(xué)支撐。

    因此,本研究依據(jù)文獻(xiàn)報道建立2型DM大鼠模型[9],采用超高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀(ultra-performance liquid chromatogra phy/quadrupole-

    time-of-flight mass spectrometry,UPLC /Q-TOF MS)分別對大鼠的血清樣本進(jìn)行測試分析,通過原始數(shù)據(jù)提取、歸一化處理、多維統(tǒng)計等對樣本進(jìn)行模式識別,比較分析不同組別大鼠的代謝狀態(tài),尋找運動干預(yù)改善2型DM大鼠內(nèi)源性代謝變化的生物標(biāo)記物及其相關(guān)代謝途徑,并利用定量差異對2型DM大鼠運動干預(yù)的生物標(biāo)記物進(jìn)行篩選,探討運動干預(yù)2型DM大鼠的定量生物學(xué)內(nèi)涵,為評價運動干預(yù)2型DM大鼠的治療作用提供實驗參考。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物造模與取材

    40只雄性Sprague dawley(SD)大鼠(140~160 g),購自南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場,飼養(yǎng)于揚州大學(xué)動物實驗中心,每日光照12 h,室溫(24±0.8) ℃,相對濕度60 %,自由飲水?dāng)z食。

    適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,通過隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)選取30只大鼠予以高糖高脂飼料(73.5%的基礎(chǔ)飼料、13%豬油、1%的膽固醇、0.5%膽鹽、8%蔗糖和4%的大豆粉,均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))喂養(yǎng)4周,之后以40 mg/kg實施腹腔注射STZ造模,觀察大鼠飲食、體質(zhì)量、尿量等生理指標(biāo),穩(wěn)定1周后剪尾取血測定空腹血糖和隨機(jī)血糖,以空腹血糖≥11.1 mmol/L為2型DM大鼠造模成功[9]。另10只大鼠給予適量生理鹽水腹腔注射對照,設(shè)為正常對照組(normal control,NC),普食喂養(yǎng)至實驗結(jié)束。

    造模成功率約70%以上,結(jié)果與文獻(xiàn)報道相一致[9]。將造模成功的21只大鼠按血糖水平高低分成若干個區(qū)組,然后將每個血糖范圍的大鼠隨機(jī)分到兩個組。其中10只作為DM模型組(diabetes mellitus control,DMC),普食喂養(yǎng)8周至實驗結(jié)束。另11只作為DM運動干預(yù)組(diabetes mellitus exercise,DME),普食喂養(yǎng),游泳運動干預(yù),共8周,每周訓(xùn)練6 d,休息1 d,訓(xùn)練時間從20~60 min不等的逐漸適應(yīng),到適應(yīng)后90 min/d。8周后,運動組末次運動禁食12 h后,所有大鼠苯巴比妥鈉45 mg/kg腹腔注射麻醉,下腔靜脈取血,離心取血清,-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2 藥品與試劑

    鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)購自Sigma公司(貨號:S0130);液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC/MS)級乙腈、超高效液相色譜(ultra-performance liquid chromatography,UPLC)級甲醇購自Merck公司(Dannstadt,Gennany);甲酸購自CNW公司;其余試劑為市售分析純。實驗用水為屈臣氏蒸餾水。

    1.3 實驗儀器

    儀器分析平臺為UPLC/Q-TOF MS(Agilent,1290 Infinity LC,6530 UHD and Accurate-Mass Q-TOF/MS),分離色譜柱為C18色譜柱(Agilent,100 mm×2.1 mm,1.8 μm)。FRESCO 17離心機(jī)(ThermoFisher Scientific);SK5200HP超聲儀(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司);Mettler AE240天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司);EYEL MG-2200氮吹儀(TOKYO RIKA KIKAL C0LTD);Tissuelyser-24研磨儀(上海凈信科技);VORTEX渦旋儀(LABNET)。

    1.4 UPLC/Q-TOF MS實驗流程

    1)血清樣本前處理。樣本常溫下解凍后,移液槍精準(zhǔn)移取100 μL樣本,置于1.5 mL的離心管,采用甲醇沉淀蛋白,加入0.5 mL低溫甲醇,采用超聲破碎,低溫離心(15 000 r/min,5 min),吸取上清液;殘渣中再次加入0.5 mL的低溫甲醇,重復(fù)上述步驟,合并上清液。取200 μL上清液于進(jìn)樣小瓶中待測。

    2)色譜分離及質(zhì)譜條件。柱溫為40 ℃;流速0.4 mL / min;流動相組成A(水+質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%甲酸)、B(乙腈+質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.1 %甲酸);線性梯度洗脫條件:0~2 min,5% B;2~17 min,5%~95 % B;17~19 min,95% B。進(jìn)樣量為4 μL,自動進(jìn)樣器溫度4 ℃。

    鎖定質(zhì)量(Lock mass)使用亮氨酸-腦啡肽,以確保質(zhì)量的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。正離子模式下產(chǎn)生[M+H]+離子556.2771 u。負(fù)離子模式下產(chǎn)生[M-H]-離子554.2615 u。

    1.5 原始數(shù)據(jù)處理與多維統(tǒng)計分析

    使用基于R平臺的XCMS軟件對LC/MS數(shù)據(jù)進(jìn)行濾噪、峰對齊、歸一化等預(yù)處理,然后將編輯后的數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入Simca-P軟件(11.0 demo version,Umetrics AB,Ume,Sweden)進(jìn)行主成分分析(principal component analysis,PCA)、偏最小二乘法-判別分析(partial least squares-discriminant analysis,PLS-DA)和正交偏最小二乘-判別分析法(orthogonal partial least-square discriminant analysis,OPLS-DA)等多維統(tǒng)計分析,對數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理和信息挖掘。

    1.6 潛在生物標(biāo)記物的挖掘及鑒定

    本實驗尋找OPLS模型中的VIP(Variable Importance in the Projection)值,然后再進(jìn)行單維t檢驗,綜合VIP>1和P值(P<0.05)最終確定差異性表達(dá)代謝物。差異性代謝物的定性方法為:搜索在線數(shù)據(jù)庫(http://metlin.scripps.edu/)(比較質(zhì)譜的質(zhì)荷比m/z或者精確分子質(zhì)量mass),將獲得的二級質(zhì)譜圖與候選化合物進(jìn)行比對分析,鑒定化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

    1.7 定量差異

    劉承宜等[8-9]提出了定量差異的概念:對于任何兩個數(shù)x和y,它們之間的相對差異可以用l來度量,稱為l級定量差異:

    l=│logτ(x/y)│=│lg(x/y)/lgτ│

    基因組學(xué)[10]和蛋白質(zhì)組學(xué)[11]要求基因或蛋白質(zhì)上調(diào)后的倍數(shù)超過1.5或2.0,下調(diào)后的倍數(shù)低于0.667或0.5,相應(yīng)l的量級為0.84或1.44,顯然與分子細(xì)胞水平的l量級(0.80,1.27)比較接近,但后者比前者更加精細(xì),當(dāng)然有待實驗的進(jìn)一步驗證。本實驗依據(jù)定量差異對鑒定出的差異代謝物進(jìn)行篩選。

    2 研究結(jié)果及分析

    2.1 動物造模期體質(zhì)量特征和變化

    體質(zhì)量定量差異的顯著性量級為(0.27,0.47)[7-8]。如表1所示,高脂時(1)的模型組體質(zhì)量定量上顯著低于正常組(l>0.27),之后逐漸接近;注射STZ造模后,模型組大鼠體質(zhì)量迅速下降(l>0.27),且伴隨有飲水量和尿量明顯增多,毛色暗淡、缺乏光澤,精神萎靡,鼠籠潮濕,攝食量在短暫減少后有所增加,提示2型DM大鼠模型造模成功。另外,除了高脂時(2)之外,對照組與模型組的體質(zhì)量的統(tǒng)計差異和定量差異完全一致。

    2.2 運動對2型DM大鼠的改善作用

    血糖定量差異的顯著性量級為(0.80,1.27)[7-8]。如表2所示,NC組實驗期間體質(zhì)量穩(wěn)步增加(P<0.05,l>0.47),空腹血糖變化不明顯(l<0.80)。DMC組實驗期間體質(zhì)量幾乎不變(l<0.27),呈現(xiàn)消瘦、多飲、多食和多尿的“三多一少”癥狀,空腹血糖沒有顯著性變化(l<0.80)。經(jīng)過8周的運動干預(yù),DME組大鼠表現(xiàn)為消瘦癥狀顯著減輕,體質(zhì)量不增的狀況得到改善(P<0.05,l>0.27),同時空腹血糖水平顯著低于干預(yù)前(P< 0.05;l<0.80)。

    2.3 三組大鼠血清樣本的PCA模型

    主成分回歸產(chǎn)生的權(quán)重矩陣反映的是預(yù)測變量X之間的協(xié)方差,可以反映樣本之間的總體代謝差異和組內(nèi)變異度大小。模型參數(shù)為R2X=0.611;Q2=0.404。R2X代表模型的解釋率,大于0.4表示模型可靠。PCA得分表明,3組能夠達(dá)到較好地分離,且DME組位于DMC和NC組之間。

    2.4 定量差異篩選結(jié)果

    本實驗依據(jù)定量差異對鑒定出的差異代謝物進(jìn)行篩選,得到10個代謝物信息,如表3所示。相比于NC組大鼠,DMC組大鼠體內(nèi)的精氨酸(Arginine,Arg)、肉毒堿(Carnitine)、丙基肉堿(Propionyl-L-carnitine,PLC)、1-磷酸鞘氨醇(Sphingosine-1-phosphate,SPP)和葡糖酸(Gluconic acid)有顯著性升高(l<0.80),二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)、亞麻酸(linolenic acid,LA)和脯氨酸-甜菜堿(Proline betaine)顯著性降低(l<0.80),經(jīng)過8周游泳訓(xùn)練后,DME組大鼠體內(nèi)的這些物質(zhì)恢復(fù)到與NC組沒有顯著性差異(l<0.47)。

    相比于NC組大鼠,DMC組大鼠體內(nèi)的單甘油酸酯(Monoglyceride,MG)(24:6)(MG(24:6))和磷酸膽堿(Phosphatidylethanolamines,PE)(20:3)(PE(20:3))都有非常顯著性升高(l>1.27),經(jīng)過8周游泳訓(xùn)練后,DME組大鼠體內(nèi)的這些物質(zhì)都有非常顯著性降低,但還沒有恢復(fù)到NC組的水平。

    3 討論

    3.1 定量差異

    本研究討論的體質(zhì)量屬于機(jī)體水平,l的顯著性量級為(0.27,0.47)。從表1可以看出,除了高脂時(2)之外,統(tǒng)計檢驗和l分析的結(jié)果完全一致。統(tǒng)計檢驗無法區(qū)分造模時和造模后,但l分析可以。造模時存在顯著性差異,造模后則存在非常顯著性差異。從表2可以看出,在干預(yù)期間,NC組體質(zhì)量非常顯著增加(l>0.47),但DMC組保持不變,DME組可以部分恢復(fù)體質(zhì)量,但與NC組差一個量級(0.27< l<0.47)。

    本研究討論的血糖和代謝組分屬于細(xì)胞分子水平,l的顯著性量級為(0.80,1.27)。從表2可以看出,干預(yù)期間,NC組和DMC組的血糖水平都保持不變(l<0.80),但DME組血糖顯著降低(l>0.80),而且最后血糖水平與相應(yīng)的NC組沒有顯著性差異(l<0.80)。

    3.2 生物標(biāo)記物的定量生物學(xué)內(nèi)涵

    大鼠體內(nèi)不能自行合成LA和EPA等多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA),必須直接從食物中攝取或由前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化[12]。轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究發(fā)現(xiàn),與生產(chǎn)C20 PUFA相關(guān)性較大的是△6去飽和酶和Elovl2延長酶[13]?!?去飽和酶是一種膜結(jié)合脂肪酸脫飽和酶,能催化脂肪酸碳鏈中C-C單鍵轉(zhuǎn)換成C=C雙鍵[14]。Elovl2延長酶屬于ELOVL家族,可以將飽和、單飽和脂肪酸延長為PUFA[15]。它的同源體Elovl3第一個被發(fā)現(xiàn),且與棕色脂肪增生和非顫抖性產(chǎn)熱有關(guān)[16]。本實驗中,DMC組大鼠體內(nèi)LA和EPA含量較NC組非常顯著性降低(l>1.270),可能是因為DM大鼠體內(nèi)物質(zhì)代謝分解加快,脂肪消耗較大所致,機(jī)體盡可能動員脂肪,提高脂肪酸利用率,肉毒堿含量也較NC組相應(yīng)增加。運動是否引起了脂肪酸碳鏈延長和脂肪酸脫氫反應(yīng)代謝途徑中的Elovl2延長酶和△6去飽和酶的活性,從而參與調(diào)控脂類合成和氧化代謝,值得關(guān)注和研究。該方向的研究可能為運動調(diào)節(jié)脂肪酸代謝在代謝性疾病防治作用中的貢獻(xiàn)提供機(jī)制參考。

    Ramírez-Zamora等[17]測定2型DM不正規(guī)治療患者和健康對照者血清和紅細(xì)胞中Arg、鳥氨酸(Ornithine,Orn)、瓜氨酸(Citruline,Cit)、尿素(Urea)等指標(biāo)含量發(fā)現(xiàn),DM患者改變了代謝物在血清和紅細(xì)胞之間的分布。紅細(xì)胞調(diào)節(jié)氮代謝,可能是通過上調(diào)Arg的血清代謝水平實現(xiàn)的。本實驗中,DMC組大鼠體內(nèi)Arg含量較NC組非常顯著性升高(l>0.80)。與Ramírez-Zamora等[17]人體研究結(jié)果還是吻合的。同時,也可能是2型DM大鼠體內(nèi)蛋白質(zhì)分解加速,導(dǎo)致內(nèi)源性Arg來源增多,而降解不足,其平衡被打破,導(dǎo)致血清含量顯著升高。8周的運動干預(yù)可以下調(diào)Arg含量至正常組水平,可能與運動促進(jìn)了大鼠機(jī)體內(nèi)源性Arg的動態(tài)平衡有關(guān)??赡苁沁\動中Cit調(diào)節(jié)了內(nèi)源性Arg的動態(tài)平衡[18]??梢?,骨骼肌作為運動的動力器官,骨骼肌Arg / NO代謝途徑在運動條件下的反應(yīng)和適應(yīng)以及與血液Arg/NO、及肝臟Urea循環(huán)之間的關(guān)系可成為今后研究運動改善代謝性疾病機(jī)制的新的關(guān)注點。

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