RNA可視化原位雜交技術對感染細胞中豬瘟病毒RNA定位與分布

張玉杰，趙　燕，徐　璐，張乾義，陳　鍇，孫永芳，鄒興啟，朱元源，趙啟祖，寧宜寶，王　琴

（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所/國家豬瘟參考實驗室，北京 100081）

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RNA可視化原位雜交技術對感染細胞中豬瘟病毒RNA定位與分布

張玉杰，趙燕，徐璐，張乾義，陳鍇，孫永芳，鄒興啟，朱元源，趙啟祖，寧宜寶，王琴

（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所/國家豬瘟參考實驗室，北京 100081）

摘要：【目的】為研究CSFV RNA在體外感染細胞中的分布及定位，建立了一種準確、敏感的RNA可視化原位雜交技術?！痉椒ā勘狙芯客ㄟ^比對GenBank中公布的CSFV、BVDV和BDV全序列，避開BVDV和BDV的同源區(qū)，設計了CSFV RNA及內參基因β-actin的特異探針。以CSFV中等致病力毒株（HeBHH1/95）為參考毒株，在PK15細胞中培養(yǎng)病毒，加入RNA可視化原位雜交的特異探針和相應試劑，采用熒光共聚焦顯微鏡進行成像觀察。通過綜合分析觀測結果、熒光強度、重復性等因素，采用正交試驗優(yōu)化了對原位雜交過程中具有重要影響的蛋白酶K濃度和甲醛固定時間，建立了CSFV RNA可視化原位雜交技術，并與FAT方法比較該技術靈敏度；用我國目前流行的CSFV 1.1、2.1、2.2、2.3基因亞型及BVDV、PPV、PRV和PCV-2病毒進行特異性試驗。最終，以CSFV強致病力毒株（SM）接種PK15細胞，病毒感染后0.5、1、3、6、8、10、14、18、24、36、48、72、96h（hours post inoculation，hpi）取樣，每個時間點2個重復，采用CSFV RNA可視化原位雜交技術進行檢測。為佐證病毒蛋白在細胞中的定位及分布，同時采用FAT方法對SM株E2蛋白在PK15細胞中的表達情況進行動態(tài)研究?！窘Y果】采用該技術在熒光共聚焦顯微鏡下可觀察到CSFV RNA在細胞中的定位；當?shù)鞍酌窴濃度為1∶1 000、甲醛固定時間為30min時為最優(yōu)反應條件；靈敏度試驗表明該技術對病毒的檢測極限為10-8/200μL，比FAT高3.5個數(shù)量級；特異性試驗結果顯示該探針能與CSFV 1.1、2.1、2.2、2.3亞型結合，與BVDV、PPV、PCV-2、PRV無交叉反應。采用該技術對CSFV RNA感染后在靶細胞中的定位與分布研究結果顯示∶0.5hpi在胞核和胞漿均能檢測到RNA，0.5—6hpi RNA主要分布于胞核內并在核內富集；10hpi胞漿內RNA逐漸增多，胞核內RNA逐漸減少，24hpi RNA主要集中在胞漿內細胞核周圍；36hpi核外RNA大量聚集增多，72hpi達到峰值；96hpi RNA總量有所下降。而FAT結果顯示：8hpi在少數(shù)細胞的胞漿內檢測到病毒E2蛋白，10—24hpi蛋白表達數(shù)量一直較少；36hpi蛋白表達量不斷增多，72hpi達到最大值；96hpi熒光信號由強變弱。病毒蛋白在細胞漿內的聚集數(shù)量與細胞漿中RNA含量成正相關?！窘Y論】首次建立了CSFV RNA可視化原位雜交檢測技術，并對CSFV強致病力毒株在細胞中的RNA定位分布進行了研究，發(fā)現(xiàn)病毒RNA吸附和進入靶細胞的時間早于0.5hpi，觀察到CSFV RNA有在細胞核內的生活史。

關鍵詞：豬瘟病毒；定位；分布；RNA可視化原位雜交；熒光抗體試驗（FAT）

聯(lián)系方式：張玉杰，E-mail：zyj-0811@sohu.com。趙 燕，E-mail：zhaoyan82882@126.com。張玉杰、趙燕為同等貢獻作者。通信作者王琴，Tel：010-61255400；E-mail：wq551@vip.sina.com

0 引言

【研究意義】豬瘟（classical swine fever， CSF）是由豬瘟病毒（classical swine fever virus， CSFV）引起的豬的高度接觸性、致死性傳染?。?］， 造成了養(yǎng)豬業(yè)的極大損失［2-3］，被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列為必須報告的法定傳染病之一。致病機理的研究是從根本上控制疫病的途徑之一，而病毒的增殖過程又是 CSFV致病機理研究的重要內容之一。病毒成分的合成是病毒增殖過程的關鍵，包括病毒 RNA的復制和病毒蛋白的合成，因此在病毒RNA水平上研究CSFV的感染及復制機制具有重要的科學價值。本文旨在建立一種新的可視化原位雜交方法，用于研究CSFV RNA在細胞內的定位和分布規(guī)律，對闡述CSFV的致病機理具有重要的理論指導依據(jù)?！厩叭搜芯窟M展】國內外研究多集中于CSFV感染過程中免疫、病毒載量等領域，已經(jīng)證實CSFV能在豬體內絕大多數(shù)的組織器官中進行感染和復制，病毒載量與不同器官和組織嗜性以及病程密切相關［4］。但是 CSFV在感染細胞后，RNA在細胞內的定位和分布情況仍不十分清楚。RNA可視化檢測技術是基于原位雜交技術發(fā)展起來的一種新型RNA原位雜交技術。在癌癥研究中，Babij等使用原位雜交技術驗證了 STK33激酶活性與癌癥細胞功能的相關性［5］，通過此方法還驗證了各受體mRNA的表達動態(tài)變化對乳癌的影響［6］。在病毒研究上，HONKAVUORI等也使用RNA原位雜交技術驗證了新型小 RNA病毒在土耳其禽類中的存在［7］。最近，NANBO對埃博拉病毒RNA在體外靶細胞中的復制規(guī)律進行了研究，發(fā)現(xiàn)病毒吸附和進入靶細胞時間早于6 h，12—48 dpi病毒RNA在細胞內完成復制并釋放入旁細胞［8］?！颈狙芯壳腥朦c】RNA可視化原位雜交檢測技術在動物病毒方面的研究還少見報道［9-11］，尚未用于對CSFV致病機理的研究。本研究建立了一種RNA可視化原位雜交技術，將CSFV體外感染PK15細胞后，采用該方法對CSFV RNA進行細胞內定位，有助于了解CSFV RNA在靶細胞上的復制與分布動態(tài)。【擬解決的關鍵問題】從RNA 分子水平上對CSFV在感染細胞中的定位和分布動態(tài)進行研究，為闡明CSFV致病機制建立一種特異、靈敏和準確的RNA可視化原位雜交技術。

1 材料與方法

試驗于2014年6月至2015年5月在中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所檢測技術研究室國家豬瘟參考實驗室完成。

1.1 引物與探針

對GenBank公布的CSFV SM株（AF333000）全序列、牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）（JQ799141）全序列和綿羊邊界病毒（border disease virus， BDV）（ KC963426）全序列進行綜合比對，避開與BVDV、BDV的同源區(qū)，設計了兩條特異性CSFV探針（P1位于 5′-UTR 112—210堿基序列，P3位于NS5B 基因11426—11573堿基序列）以及標記探針（P2：標記Cy3紅色熒光）；同時對豬看家基因β-actin（ACTB）（AK237086）的mRNA序列設計特異性探針作為內參（標記FITC綠色熒光）。CSFV RNA可視化原位雜交探針設計合成由豬瘟參考實驗室與北京諾沃安泰生物科技有限公司合作完成。

CSFV 基本探針序列為：

P1： GGA CTA GCA AAC GGA GGG ACTA GCC GTA GTG GCG AGC TCC CTG GGT GGT CTA AGT CCT GAG TAC AGG ACA GTC GTC AAT AGT TCG ACG TGA GCA GGA GC

P2：TAT GAT TTA TTG CAA GCC CAG AGG TAC GGT ATA GAA GAC GGG ATA AAT ATC ACC AAA TCC T

P3： AGG TGG TCA GAC AAC ACT TCT AGT TAC ATG CCG GGG AGA AAT ACA ACC ACA ATC CTA GCT AAA ATG GCC ACA AGG TTA GAT TCC AGT GGT GAG AGG GGT ACC ATA GCA TAT GAG AAA GCA GTA GCA TTC AGC TTC CTG CTG ATG TAC T；

ACTB基本探針序列如下：

TTC CTT CCT GGG TAT GGA ATC CTG TGG CAT CCA CGA AAC TAC CTT CAA CTC AAT CAT GAA

1.2 試驗材料

1.2.1 毒株背景 CSFV石門株（SM）、豬瘟兔化弱毒疫苗株（C-Strain）、SXDT/2001株、HeBHH1/95株、HeNBY1/96株均保存于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所國家豬瘟參考實驗室，經(jīng)豬瘟熒光抗體染色技術（fluorescent antibody technique，F(xiàn)AT）和電鏡觀察等鑒定為陽性［12-13］；BVDV、PRV（豬偽狂犬病病毒）、PPV09/79株（豬細小病毒）由國家獸醫(yī)菌種保藏中心提供，保存于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所國家豬瘟參考實驗室；PCV-2（豬圓環(huán)病毒II型）由浙江大學周繼勇教授惠贈。樣品背景信息如表1。

1.2.2 細胞 PK15、ST、MBDK均保存于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所國家豬瘟參考實驗室。

1.2.3 試劑和儀器 RNA 可視化原位雜交試劑（蛋白酶、洗液、DAPI等）購自諾沃安泰生物科技有限公司；豬瘟單克隆抗體：WH303，由英國 AHVLA Trevor Drew 教授提供；Lab-Tek II Chamber Slide購自美國Thermo Fisher Scientific公司。熒光共聚焦顯微鏡：Olympus，型號UltraVIEW VoX。

表1　CSFV RNA可視化原位雜交試驗所用樣品背景信息Table 1 The samples background information of CSFV RNA visualization ISH test

1.3 實驗用參考毒株（HeBHH1/95 株）TCID50測定

在 24孔板中培養(yǎng) PK15細胞，當細胞密度為70％—80％時，將 HeBHH1/95 株進行梯度稀釋（從10-1到10-6），分別接種PK15細胞，每個稀釋度4孔，每孔200μL。37℃ 5％CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)72h，采用FAT方法測定病毒的TCID50。

1.4 CSFV RNA可視化原位雜交技術的建立

在8孔膠室蓋玻片中培養(yǎng)PK15細胞，當細胞密度為 70％—80％時，每孔接種 200μL滴度為 104.5TCID50/200 μL的HeBHH1/95株，37℃ 5％CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)72 h。小心吸掉培養(yǎng)基，PBS輕輕洗滌2次，加入4％甲醛溶液室溫固定約30 min；PBS洗滌3次，加入Solution I，室溫孵育5 min；PBS洗滌2次，加入蛋白酶處理一定時間，加入探針在 40℃經(jīng)多步孵育并洗滌；最后經(jīng)熒光探針標記并孵育30 min，加入工作濃度的DAPI 染料著染細胞核，PBS洗細胞2次，最后加入200 μL的PBS后，采用熒光共聚焦顯微鏡，控制工作溫度為5—20℃，波長488/550 nm，在避光的環(huán)境中使用20×物鏡進行成像。

1.4.1 反應條件優(yōu)化 采用正交試驗優(yōu)化蛋白酶K濃度和甲醛固定時間，蛋白酶K濃度梯度設置為：1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000；甲醛固定時間分別設置為：30 min和60 min（表2）。綜合考慮檢測結果、熒光強度、重復性等因素，確定最優(yōu)反應條件。

表2　蛋白酶K濃度和甲醛固定時間的優(yōu)化Table 2 The optimization of proteinase K concentration and the formalin fix time

1.4.2 靈敏度試驗 將上述HeBHH1/95毒株（104.5TCID50/200μL）進行10倍梯度稀釋（從10-1到10-10），分別接種2組PK15細胞，每個稀釋度3孔，每孔200 μL。37℃吸附1 h后補加維持液200 μL。置于37℃ 5％CO2培養(yǎng)箱中72 h后，分別采用CSFV RNA可視化原位雜交技術和CSFV FAT方法進行靈敏度比較試驗。

1.4.3 特異性試驗 分別取表 1中所列的不同基因亞型CSFV及其它相關病毒BVDV、PPV、PRV和PCV-2質控樣本接種各自的靶細胞，每種病毒接種2 組PK15細胞，每組3孔。37℃ 5％CO2培養(yǎng)72 h后，取1組細胞用CSFV RNA可視化原位雜交技術進行檢測，在熒光共聚焦顯微鏡下觀察結果；另一組細胞采用每種病毒的相應抗體進行染色。

1.5 CSFV RNA定位及分布規(guī)律研究

取200 μL（103.67TCID50/ 200μL）CSFV強致病力SM毒株接種密度為70％—80％的 PK15細胞于8孔膠室蓋玻片，病毒感染后0.5、1、3、6、8、10、14、18、24、36、48、72和96 h取樣，每個時間點2個重復，采用CSFV RNA可視化原位雜交技術進行檢測。

1.6 CSFV E2蛋白的定位及分布規(guī)律

取200 μL（103.67TCID50/ 200 μL）CSFV強致病力SM毒株接種密度為70％—80％的PK15細胞于細胞培養(yǎng)皿，同時設不接毒對照，病毒感染后每1 h收集細胞，固定，采用CSFV E2蛋白單克隆抗體（WH303）進行FAT染色。

2 結果

2.1 條件優(yōu)化

通過對蛋白酶K工作濃度和甲醛固定時間的正交試驗，綜合考慮熒光強度、重復性等因素，結果顯示當?shù)鞍酌窴工作濃度為1∶1 000，甲醛固定時間為30 min時，陰性對照背景信號最弱，細胞板中細胞損失最少，對細胞形態(tài)影響最小，有最高的信背比（陽性信號與背景干擾信號間的比值）。因此，確定蛋白酶K的工作濃度為1∶1 000，甲醛的固定時間為30 min。

2.2 靈敏度結果比較

通過對CSFV RNA可視化原位雜交方法和FAT方法對HeBHH1/95株的靈敏度比較試驗，結果顯示：CSFV RNA可視化原位雜交方法檢測HeBHH1/95株的極限度為10-8（圖1）。FAT方法檢測的極限度為10-4.5（圖2）。前者比后者高3.5個數(shù)量級。

圖1　CSFV RNA可視化原位雜交方法靈敏度試驗Fig.1 Sensibility test results of CSFV RNA visualization ISH method（200×）

圖2　CSFV FAT法靈敏度試驗Fig.2 Sensibility test results of CSFV FAT method（100×）

2.3 特異性試驗結果

通過對不同基因亞型的CSFV和相關病毒的特異性試驗，結果表明CSFV RNA 可視化原位雜交方法能在感染細胞中特異性的檢測到SM、C-Strain、SXDT2011、HeBHH1/95、HeNBY1/96的陽性信號（紅色熒光，圖3）；而在BVDV、PPV、PRV、PCV-2的感染細胞則無陽性信號，且BVDV、PPV、PRV、PCV-2均在各自的靶細胞中正常生長（圖 4）。說明CSFV RNA可視化原位雜交方法具有良好的特異性。

紅色熒光代表CSFV RNA陽性信號，綠色熒光為β-actin信號； 未感染病毒的陰性細胞樣本作為對照； “+”代表原位雜交陽性結果，“-”代表原位雜交陰性結果Red fluorescent represents positive siginal of CSFV RNA， green fluorescent represents β-actin siginal；Using negative cell samples without infected as control；“+”represcents ISH test result is positive，“-”represcents ISH test result is negative圖3　CSFV RNA 可視化原位雜交方法特異性試驗Fig.3 The specificity test results of CSFV RNA visualization ISH（400×）

2.4 CSFV RNA定位及分布動態(tài)研究

將按試驗方案收集的 SM 株感染細胞用 CSFV RNA可視化原位雜交方法進行檢測。結果顯示：0.5 hpi就可在胞核與胞漿內均能檢測到病毒RNA，0.5—6 hpi病毒RNA主要存在于胞核內并在胞核內聚集增多， 8 hpi胞漿內RNA含量有增多的趨勢，直到 18 hpi胞漿內的RNA含量逐漸增多，胞核內RNA逐漸減少；24 hpi病毒RNA主要定位在細胞核周圍；36—72 hpi病毒RNA在核外大量積累增多，72 hpi胞漿內RNA含量達到最大值，96 hpi胞漿內RNA總量有所下降（圖5）。

2.5 CSFV E2蛋白染色

將按試驗方案收集的 SM株感染細胞用 CSFV FAT法進行檢測。結果顯示，8 hpi可在少數(shù)細胞的胞漿內檢測到熒光，而在此前檢測不到熒光，10—24 hpi被熒光染色的陽性細胞數(shù)量一直較少； 36 hpi隨著感染時間的延長，感染細胞的數(shù)量不斷增多，72 hpi陽性細胞數(shù)量達到最大值；96 hpi陽性細胞數(shù)量有所下降且熒光強度變弱。（圖6）

圖4　BVDV、PRV、PCV-2和PPV在細胞中正常生長Fig. 4 Regular growth picture of BVDV， PRV， PCV-2 and PPV in cells （100×）

圖5　SM株RNA在PK15細胞上的分布動態(tài)Fig.5 The distribution dynamics results of SM strain RNA in PK15 cells （200×）

圖6　PK15細胞感染SM株后不同時間FAT檢測Fig.6 FAT test results of SM strain in infected PK15 cells （100×）

3 討論

3.1 RNA可視化原位雜交檢測技術

RNA可視化原位雜交檢測技術的原理是通過設計目的基因“Z”型結構的特異探針，利用“Z”型結構探針的下半部分與經(jīng)蛋白酶消化后暴露的靶 RNA雜交，之后預雜交液與“Z”型結構探針的上半部分結合，雜交液再與預雜交液結合，通過3次特異性的序列雜交出現(xiàn)信號擴增現(xiàn)象。一個裝配完整的信號擴增樹有400個探針標簽的結合位點，當探針上的所有目標寡核苷酸片段都結合到靶 RNA轉錄本上時，一個轉錄樣本便可產生8 000倍的放大效應。接著加入堿性磷酸酶，該酶會破壞底物形成紅點沉淀表明靶RNA存在，再通過熒光共聚焦顯微鏡把目標 RNA顯影出來。該技術可在不進行RNA分離、反轉錄和PCR情況下，僅需要樣品制備、雜交、檢測3個步驟即可完成對某個細胞中特定RNA拷貝數(shù)情況進行定位和檢測。而傳統(tǒng)的電子顯微鏡只能檢測成熟病毒粒子而無法定位病毒RNA，且靈敏性低；熒光定量PCR技術雖能對CSFV RNA總量進行檢測，但無法對RNA進行細胞內定位。RNA可視化原位雜交檢測技術恰恰彌補了上述缺點，通過收集病毒RNA紅色熒光和β-actin看家基因綠色熒光，同時將細胞核染成藍色，在熒光共聚焦顯微鏡下進行病毒RNA和細胞核相對位置的觀察。熒光共聚焦顯微鏡由于是激光和熒光 的共聚焦成像以及 Pinhole的應用阻止了焦點以外的干擾衍射光和散射光，使其具有 16bit的高分辨率。多通道采集圖像的功能很方便地使共聚焦具有同時獲取不同光譜段的熒光信號的功能。并通過Volocity Demo軟件處理得到層疊效應圖像，克服了傳統(tǒng)熒光原位雜交法（fluorescence in situ hybridization， FISH）信號集團強度低、靈敏度差的劣勢，其靈敏度顯著高于FAT法及熒光定量PCR法。2013年SEIMON等用RNA原位雜交檢測技術在瀕臨滅絕的東北虎腦組織中檢測到犬瘟熱病毒RNA的存在［15］；2012年HURTADO等也采用 RNA原位雜交技術檢測到了小鼠舌上皮細胞中 Y受體的分布［16］。以上學者都采用不同的RNA原位雜交技術對組織細胞中的特定病毒進行了定位和檢測，說明RNA原位雜交方法具有很好的可行性和特異性，能準確的對體外培養(yǎng)細胞中的RNA進行定位和檢測。

3.2 CSFV RNA在感染細胞中的定位及分布

本研究首次建立了CSFV RNA可視化原位雜交檢測技術，其靈敏度比FAT方法高3.5個數(shù)量級，能特異性的識別中國目前流行的CSFV 1.1、2.1、2.2、2.3基因亞型，且與BVDV、PPV、PRV和PCV-2等常見的豬源病毒 RNA無交叉反應，具有靈敏度高、特異性強、直接在細胞中進行定位觀察等特點。通過對強致病力CSFV感染細胞后病毒RNA進行定位研究，表明CSFV接種其易感細胞后迅速侵染細胞，0.5 hpi便可在胞漿與胞核內同時檢測到病毒 RNA的存在，隨著感染時間的延長，胞漿內的RNA逐漸增多，24 hpi病毒 RNA主要集中在胞核周圍，36—72 hpi RNA在胞漿內大量復制增多，72 hpi達到最大值。此次研究首次在體外細胞中對 CSFV RNA進行了定位和分布動態(tài)的研究。

眾所周知CSFV感染細胞后，病毒RNA主要是在胞漿中復制。而本研究觀察到在感染早期，胞核內也檢測到病毒 RNA的存在，所以猜測這可能與細胞核內的某種蛋白有關。有文獻報道核不均一核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，hnRNPs）是存在于核漿中的一類核蛋白，參與病毒 RNA的合成與加工。例如丙型肝炎病毒（HCV）感染宿主細胞時，hnRNp AI參與病毒的復制過程，敲除宿主細胞的hnRNpAI會降低HCV RNA的復制［17］；在CSFV感染誘導PK-15細胞蛋白質組研究中也發(fā)現(xiàn)細胞中有4種hnRNPs的表達水平發(fā)生變化［18］，表明CSFV的復制同樣需要宿主細胞hnRNPs參與病毒RNA的合成與加工。另外病毒感染宿主細胞后，病毒RNA進入細胞核的現(xiàn)象可能也與CSFV某些蛋白的核定位有關。有研究表明正鏈和負鏈 RNA 病毒的蛋白定位到細胞核或者亞細胞結構，特別是核仁結構，有利于病毒的復制和轉錄［19］；也有報道CSFV C蛋白與宿主細胞核仁素蛋白（nucleolin，NCL）在核仁中存在共定位現(xiàn)象。當NCL被抑制后CSFV的復制能力下降［20］，CSFV通過作用于細胞核，為病毒的復制或調控提供便利［21］。近幾年研究發(fā)現(xiàn)黃病毒 C 蛋白的核定位與病毒的復制有關［22-23］，C蛋白在合成后幾分鐘即與病毒基因組 RNA相結合［24］，C蛋白的 N端與基因組RNA相結合，C端參與核衣殼的形成。因此CSFV RNA很可能在 C蛋白進行核定位時被 C蛋白攜帶進入胞核。因此推測，在CSFV感染早期（0.5—10 h），病毒RNA很可能也是被C蛋白一同攜帶進入細胞核，但是 CSFV RNA是如何進入細胞核并且在胞核中存在還有待深入研究。

為了佐證 CSFV RNA在體外細胞中的定位與分布，同時采用FAT方法對SM株病毒蛋白在PK15細胞中進行增殖動態(tài)比較研究，結果顯示36—72 hpi病毒 RNA在核外大量聚集，與此同時胞漿內病毒蛋白的檢出量也大量增加；72 hpi胞核外的病毒RNA含量達到最大值，而此時病毒蛋白陽性細胞數(shù)量達峰值且熒光亮度最強；96 hpi胞核外RNA的含量有所降低，而病毒蛋白陽性細胞數(shù)量有所下降且熒光強度變弱。E2蛋白在細胞漿內的聚集數(shù)量與細胞漿中RNA含量成正相關。

4 結論

首次建立了可以對病毒 RNA進行細胞內定位的CSFV RNA可視化原位雜交檢測技術，證實該技術具有靈敏度高、特異性強等特點。采用該技術對CSFV強致病力SM毒株RNA在靶細胞上進行定位和分布研究，發(fā)現(xiàn)病毒RNA吸附和進入靶細胞的時間早于 0.5 hpi，胞核內的RNA含量明顯高于胞漿內。隨著感染時間的延長，10—18 hpi胞核內RNA量逐漸減少，胞漿內 RNA逐漸增多，24 hpi病毒RNA主要定位在胞漿，觀測到CSFV RNA在細胞核內的生活史。

References

［1］ 王琴，涂長春. 豬瘟. 北京：中國農業(yè)出版社，2015 ： 2-4. WANG Q， TU C C. Classical Swine Fever. Beijing：China Agricul True Press， 2015： 2-4. （in Chinese）

［2］ EDWARDS S， FUKUSHO A， LEFEVRE P C， LIPOWSKI A，PEJSAK Z， ROEHE P， WESTERGAARD J. Classical swine fever：the global situation . Veterinary Microbiology， 2000， 73（2）：103-119.

［3］ MEYERS G， THIEL H J， RUMENAPF T. Classical swine fever virus：recovery of infectious viruses from cDNA constructs and generation of recombinant cytopathogenic defective interfering particles. Journal of Virology， 1996， 70（3）： 1588-1595.

［4］ LIU J， FAN X Z， WANG Q， XU L， ZHAO Q Z， HUANG W， ZHOU YC， TANG B， CHEN L， ZOU X Q， SHA S， ZHU Y Y. Dynamic distribution and tissue tropism of classical swine fever virus in experimentally infected pigs. Journal of Virology， 2011（8）： 201.

［5］ BABIJ C， ZHANG Y， KURZEJA R J， MUNZLI A， SHEHABEDIN A，F(xiàn)ENANDO M， QUON K， KASSNER P D， RUEFLI-BRASSE A A，WATSON V J， FAJARDO F， JACKSON A， ZONDLO J， SUN Y，ELLISON A R， PLEWA C A， MIGUEL T S， ROBINSON J，MCCARTER J， SCHWANDNER R， JUDD T， CARNAHAN J，DUSSAULT I. STK33 kinase activity is nonessential in KRAS-dependent cancer cells. Cancer Research， 2011， 71（17）：5818-5826.

［6］ CHAE B J， BAE J S， YIM H W， LEE A， SONG B J， JEON H M，CHUN M H， JUNG S S. Measurement of ER and PR status in breast cancer using the QuantiGene2.0 assay. Pathology， 2011， 43（3）：248-253.

［7］ HONKAVUORI K S， SHIVAPRASAD H L， BRIESE T， STREET C，HIRSCHBERG D L， HUTCHISON S K， LIPKIN W L. Novel picornavirus in Turkey poults with hepatitis， California， USA. Emerging Infectious Diseases， 2011， 17（3）： 480.

［8］ NANBO A， WATANABE S， HALFMANN P， KAWAOKA Y. The spatio-temporal distribution dynamics of Ebola virus proteins and RNA in infected cells. Scientific Reports， 2013（3）：1206.

［9］ FEELEY E M， SIMS J S， JOHN S P， CHIN C R， PERTEL T， CHEN L M， GAIHA G D， RYAN B J， DONIS R S， ELLEDGE S J， BRASS A L. IFITM3 inhibits influenza A virus infection by preventing cytosolic entry. PLoS Pathogens， 2011， 7（10）：e1002337.

［10］ TING D T， LIPSON D， PAUL S， BRANNIGAN B W，AKHAVANFARD S， COFFMAN E J， CONTINO G， DESHPANDE V，JOHN A， LETOVSKY S， RIVERA M N， BARDEESY N，MAHESWARAN S， HABER D A. Aberrant overexpression of satellite repeats in pancreatic and other epithelial cancers. Science，2011， 331（6017）： 593-596.

［11］ SEIMON T A， MCALOOSE D， RAPHAEL B， HONKAVUORI K S，CHANG T， HIRSCHBERG D L， LIPKIN W L. A novel herpesvirus in 3 species of pheasants： Mountain peacock pheasant （Polyplectron inopinatum）， malayan peacock pheasant （Polyplectron malacense），and congo peafowl （Afropavo congensis）. Veterinary Pathology， 2011，49（3）： 482-491.

［12］ 王在時，丘惠深，郎洪武. 豬瘟病毒野外分離物的研究，I豬瘟野毒的分離及初步鑒定. 中國獸藥監(jiān)察所研究報告匯編. 北京： 1999，14： 35-38. WANG Z S，QIU H S， LANG H W. The research of wild isolate of classical swine fever virus， I isolate and identify of classical swine wild strain. Research Report Complie of China Institute of Veterinary Drug Control， Beijing： 1999， 14：35-38. （in Chinese）

［13］ 丘惠深，郎洪武，王在時. 豬瘟病毒野外分離物的研究，II豬瘟野毒的純化及電鏡觀察. 中國獸藥監(jiān)察所研究報告匯編. 北京： 1999，14： 39-42. QIU H S， LANG H W， WANG Z S. The research of wild isolate of classical swine fever virus， II purification and electro microcopy observation. Research Report CVomplie of China Institute of Veterinary Drug Control， Beijing：1999，14：39-42. （in Chinese）

［14］ 劉俊， 王琴， 范學政， 徐璐，趙啟祖，黃偉，湯波，沙莎，周遠成，陳蕾，鄒興啟. 豬瘟病毒野毒株 TaqMan-MGB 熒光定量 PCR 鑒別方法的建立與應用. 中國農業(yè)科學， 2009， 42（12）：4366-4371. LIU J， WANG Q， FAN X Z， XU L， ZHAO Q Z， HUANG W， TANG B，SHA S， ZHOU Y C， CHEN L， ZOU Q Q. Differentation of wild-type viruses and HCLV vaccine of classical swine fever virus by one-step fluorescent Quantitative PCR using Taq-MGB probe technology. Scientia Agricultura Sinica， 2009， 42（12）：4366-4371. （in Chinese）

［15］ SEIMON T A， MIQUELLE D G， CHANG T Y， NEWTON A L，KOROTKOVA I， IVANCHUK G， LYUBCHENKO E， TUPIKOV A，SLABE E， MCALOOSE D. Canine distemper virus： an emerging disease in wild endangered amur tigers （Panthera tigris altaica）. Mbio，2013， 4（4）：16-16.

［16］ HURTADO M D， ACOSTA A， RIVEROS P P， BAUM B J，UKHANOV K， BROWN A R， DOTSON C D， HERZOQ H，ZOLOTUKHIN S. Distribution of Y-receptors in murine lingual epithelia. PLoS One， 2012， 7（9）：e46358

［17］ KIM C S，SEOL S K，SONG O K， PARK J H， JANG S K. An RNA—binding protein，hnRNP A1，and a scaffold protein，sptin 6，facilitate hepatitis C virus replication.Journal of Virology， 2007，81（8）：3852-3865.

［18］ 孫金福， 史子學， 郭煥成， 涂長春. 豬瘟病毒感染誘導 PK-15 細胞蛋白質組的改變. 中國畜牧獸醫(yī)學會， 2008年學術年會暨第六屆全國畜牧獸醫(yī)青年科技工作者學術研討會論文集， 2008. SUN J F，SHI Z X，GUO H C，TU C C. Swine fever virus infection induced PK 15 cells proteome changes. Chinese Association of Animal Science and Veterinary Medicine（CAAV），In 2008 annual meeting and sixth national CAAV youth academic semina conference proceeding， 2008. （in Chinese）

［19］ RUBBI C P， MILNER J， MILNER J.Disruption of the nucleolus mediates stabilization of p53 in response to DNA damage and other stresses. EMBO Journal， 2003， 22（22）： 6068-6077.

［20］ 張鑫， 時洪艷， 徐佳. 豬瘟病毒衣殼蛋白與宿主細胞核仁素蛋白相互作用. 中國預防獸醫(yī)學報， 2015， 37（6）： 430-433.ZHANG X， SHI H Y， XU J. Characteization of interaction between the capsid protein of classical swine fever virus and cellular nucleolin. Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine，2015，37（6）：430-433. （in Chinese）

［21］ 劉寧， 時洪艷， 陳建飛， 馮力， 張鑫， 胡桂學. 豬瘟病毒衣殼蛋白的細胞核定位研究. 中國預防獸醫(yī)學報， 2014， 36（1）： 71-72. LIU N， SHI H Y， CHEN J F， FENG L， ZHANG X， HU G X. Nucleus localization of classical swine fever virus capsid proteins in cells. Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine， 2014， 36（1）：71-72. （in Chinese）

［22］ MORI Y， OKABAYASHI T， YAMASHITA T， ZHAO Z， WAKITA T，YASUI K， HASEBE F， TADANO M， KONISHI E， MATSUURA Y. Nuclear localization of Japanese encephalitis virus core protein enhances viral replication. Journal of Virology， 2005， 79（6）：3448-3458.

［23］ TSUDA Y， MORI Y， ABE T， YAMASHITA T， OKAMOTO T，ICHIMURA T， MORIISHI， MATSUURA Y. Nucleolar protein B23 interacts with Japanese encephalitis virus core protein and participates in viral replication. Microbiology and Immunology， 2006， 50（3）：225-234.

［24］ 涂亦嫻. 豬瘟病毒 E2 基因的克隆及其 DNA 疫苗免疫效果的研究［D］. 烏魯木齊： 新疆大學， 2005. TU Y X. Research of CSFV E2 genic clone and immune effect of DNA vaccine［D］. Urumqi： Xinjiang University， 2005. （in Chinese）

（責任編輯 林鑒非）

Study of Location and Distribution of Classical Swine Fever Virus RNA in PK15 Cells by Visualization in Situ Hybridization Technology

ZHANG Yu-jie， ZHAO Yan， XU Lu， ZHANG Qian-yi， CHEN Kai， SUN Yong-fang， ZOU Xing-qi，ZHU Yuan-yuan， ZHAO Qi-zu， NING Yi-bao， WANG Qin
（China Institute of Veterinary Drug Control/National Classical Swine Fever Reference Lab， Beijing 100081）

Abstract：【Objective】In order to make researches on the RNA location and distribution of Classical Swine Fever Virus（CSFV）in infected PK15 cells， a rapid， accurate and sensitive in situ hybridization （ISH） technology was established. 【Method】After comparison with the complete sequences of CSFV， BVDV and BDV to avoid the homology regions， a set of specific probes of CSFV RNA andβ-actin were designed and synthesized. A reference strain CSFV （HeBHH1/95） was used to optimize the ISH technology through comparison several parameters such as fluorescence intensity， repeatability， protease K concentration and formalin fixation time. After these parameters were determined， an ISH technology was established. Fluorescent antibody test （FAT）was used to compare the sensitivity with the ISH technology. All the sub genotypes of CSFV （sub genotype 1.1， 2.1，2.2 and 2.3）which are present in China and other normal pig infectious virus （BVDV， PPV， PRV，PCV-2） were used to detect specificity of this ISH technology. A high virulent strain of CSFV （SM） was inoculated in PK15 cells. Infected cells were sampled at 0.5 hours post inoculation （hpi）、1， 3， 6， 8， 10， 14， 18， 24， 36， 48， 72， and 96hpi. Then FAT was performed in parallel to detect the expression and location of CSFV E2 protein. 【Result】CSFV RNA were detected in infected PK15 cells by using the ISH technology. The optimal concentration of protease K was 1：1 000 and the optimal time of formalin fixation was 30 minutes. The minimum of detection is 10-8/200μL which is 3.5 orders of magnitude higher than FAT. The specific tests showed that the ISH technology could react with sub genotypes 1.1， 2.1，2.2 and 2.3 of CSFV in China and has no cross reaction with BVDV， PPV， PRV，PCV-2 viruses. CSFV RNA ISH test results showed that CSFV RNA were firstly detected in nucleus at 0.5 hpi and gathered in nucleus from 0.5hpi to 6hpi； at 10hpi，there were more CSFV RNA gathered in cytolymph than before and less CSFV RNA were detected than before in nucleus；at 24hpi，CSFV RNA mainly gathered in cytolymph around nucleus； at 36hpi， more and more CSFV RNA gathered in cytolymph and got maximum at 72hpi； at 96hpi， the amount of CSFV RNA declined. The results of FAT showed that little E2 protein was detected in cytolymph at 8hpi. From 10hpi to 24 hpi， only few cells were detected positive. After 36hpi， the expression of E2 protein increased gradually and got to the maximum at 72hpi. But after 96hpi， the amount of E2 protein declined. The trend of E2 protein expression was in accord with CSFV RNA. 【Conclusion】 A visualization in situ hybridization technology was firstly established to detect CSFV RNA. The location and distribution of CSFV RNA was studied by using this technology. The results proved that CSFV RNA enters cell early than 0.5hpi and CSFV RNA has ever existed in nucleus.

Key words：Classical Swine Fever Virus （CSFV）； location； distribution； RNA in situ hybridization （ISH）； Fluorescent antibody test （FAT）

收稿日期：2015-12-31；接受日期：2016-03-28

基金項目：國家自然科學基金（31372434）