從麥胚清蛋白分離制備高活性抗氧化肽

陳思遠(yuǎn)，劉永祥，曹小舟，張逸婧，陳海娟，沈新春

（南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院/江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心/江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210023）

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從麥胚清蛋白分離制備高活性抗氧化肽

陳思遠(yuǎn)，劉永祥，曹小舟，張逸婧，陳海娟，沈新春

（南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院/江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心/江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210023）

摘要：【目的】探究能有效地從小麥胚芽清蛋白二步雙酶酶解物中分離得到高活性抗氧化肽的工藝。【方法】以小麥胚芽清蛋白為原料，DPPH自由基清除率和Fe2+螯合能力為抗氧化活性的評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)胰蛋白酶進(jìn)行酶解，依次采用超濾膜和凝膠過(guò)濾色譜（Sephadex G-75）對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，篩選出活性較高的組分；采用堿性蛋白酶對(duì)獲得的活性較高組分進(jìn)行酶解，通過(guò)凝膠過(guò)濾色譜（Sephadex G-15）和反相高效液相色譜（RP-HPLC）分離純化其酶解產(chǎn)物；采用質(zhì)譜技術(shù)（ESI-TOF MS/MS）對(duì)抗氧化活性最高的組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定?！窘Y(jié)果】分離得到3個(gè)活性組分（峰）Pa、Pb、Pc，采用DPPH法和Fe2+螯合能力測(cè)定法測(cè)定其抗氧化活性的結(jié)果都顯示，在3個(gè)組分中，提取率為23.1％的組分Pb抗氧化活性最強(qiáng)（P＜0.05），因此選取組分Pb進(jìn)行下一步堿性蛋白酶酶解。該酶解物經(jīng)Sephadex G-15分離后得到Pd和Pe兩個(gè)組分（峰），經(jīng)抗氧化活性測(cè)定，選取提取率為52.1％的高抗氧化活性組分Pd（P＜0.05）進(jìn)一步通過(guò)RP-HPLC進(jìn)行疏水性分離，得到P1、P2、P3、P4、P5五個(gè)活性組分（峰），其中提取率為7.3％的組分P3的抗氧化活性最強(qiáng)（P＜0.05），其DPPH自由基清除率和Fe2+螯合能力的EC50值分別為1 mg·mL-1、0.6 mg·mL-1。最后通過(guò)質(zhì)譜技術(shù)（ESI-TOF MS/MS）鑒定組分 P3的結(jié)構(gòu)，得到其氨基酸序列為 AREGETVVPG，分子量為1 013.51 Da，純度約為85％，與用化學(xué)方法合成的多肽AREGETVVPG（純度95％以上）的抗氧化活性相比，結(jié)果沒(méi)有顯著差異（P＞0.05）?！窘Y(jié)論】二步雙酶酶解結(jié)合超濾膜、凝膠過(guò)濾色譜和RP-HPLC等蛋白分離純化技術(shù)為直接得到單一的高活性抗氧化肽提供了技術(shù)參考。

關(guān)鍵詞：小麥胚芽；清蛋白；二步雙酶酶解；分離純化；抗氧化肽

聯(lián)系方式：陳思遠(yuǎn)，E-mail：824170843@qq.com。通信作者沈新春，Tel：13675121836；E-mail：shenxinchun@njue.edu.cn

0 引言

【研究意義】抗氧化肽是一種由氨基酸組成的小分子多肽（大多數(shù)少于20個(gè)氨基酸），屬于一種生物活性肽。與大分子的肽鏈蛋白質(zhì)相比，顯示出更高的活性，具有清除自由基和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的功能，能夠維持人體自由基的平衡，進(jìn)而提高機(jī)體抗衰老、抗疾病的能力。來(lái)源于動(dòng)、植物蛋白的天然抗氧化活性多肽由于低毒、高效等特點(diǎn)，作為食品添加劑（人工抗氧化劑的最優(yōu)替代品）和保健食品因子應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、飼料等領(lǐng)域，具有廣闊的開(kāi)發(fā)前景?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】研究表明，小麥胚芽蛋白［1］及其酶解產(chǎn)物［2］都具有很強(qiáng)的抗氧化活性，且水解能夠提高麥胚蛋白的抗氧化活性［3-4］。賈俊強(qiáng)等［5］利用堿性蛋白酶對(duì)小麥胚芽中4種蛋白進(jìn)行酶解比較研究后，發(fā)現(xiàn)清蛋白酶解物的抗氧化活性最強(qiáng)，球蛋白最弱。因此，推斷麥胚清蛋白中可能蘊(yùn)藏著一些具有高抗氧化活性的天然多肽序列，以其作為原料制備天然抗氧化肽具有很強(qiáng)的可操作性。目前，制備抗氧化肽的方法主要有化學(xué)水解法、酶解法和發(fā)酵法［6］，其中具有降解位點(diǎn)特異、重復(fù)性高的酶解法是最常用的方法，其不足之處是酶解后的組分多，難以分離得到單一的組分。程云輝［7］、DIAO［8］等分別對(duì)單酶酶解麥胚蛋白制備抗氧化肽的工藝條件進(jìn)行了探究和優(yōu)化，得到了具有清除DPPH自由基和超氧陰離子自由基較強(qiáng)的混合多肽組分。ZHU等［9］利用堿性蛋白酶酶解麥胚蛋白獲得抗氧化肽，并采用多種體外方法測(cè)定其抗氧化活性，結(jié)果表明混合多肽組分具有很強(qiáng)的自由基清除和Fe2+螯合能力。程云輝等［10］對(duì)制備麥胚蛋白抗氧化肽的水解用酶進(jìn)行了系統(tǒng)的篩選后發(fā)現(xiàn)，堿性蛋白酶制備的麥胚混合多肽的抗氧化活性最強(qiáng)。這是由于堿性蛋白酶的特異性酶切位點(diǎn)多，水解效率高，更有利于將大分子蛋白水解成小分子的肽。此外，張麗霞等［11］選用堿性蛋白酶和胰蛋白酶對(duì)麥胚蛋白進(jìn)行雙酶酶解制備抗氧化肽，結(jié)果表明雙酶組合的水解度高于單一酶解法，有利于提高肽的轉(zhuǎn)化率。然而，由于水解組分更多，更難以分離純化篩選出單一的抗氧化肽。胰蛋白酶作為一種限制性消化酶，酶解位點(diǎn)僅為賴氨酸和精氨酸，而且它只作用于暴露在蛋白表面的賴氨酸和精氨酸，而不能水解包裹在蛋白內(nèi)部的這兩種氨基酸，得到的產(chǎn)物是具有不同功能和活性的抗胰蛋白酶結(jié)構(gòu)域或片段［12］，由于酶解組分較少，有利于進(jìn)行初步分離和篩選。因此，本研究選用麥胚清蛋白為原料，有望通過(guò)二步雙酶酶解法（對(duì)麥胚清蛋白的胰蛋白酶酶解物進(jìn)行初步分離后，篩選出較高抗氧化活性組分再進(jìn)行堿性蛋白酶酶解）來(lái)制備出單一的高抗氧化活性的肽?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前的研究多集中在對(duì)麥胚蛋白酶解物粗產(chǎn)品的活性測(cè)定上［13-14］，缺乏對(duì)于其構(gòu)效關(guān)系和活性機(jī)制等方面的深入闡述，而純化出單一的組分是解決上述問(wèn)題的關(guān)鍵和前提。由于酶解后的產(chǎn)物組成十分復(fù)雜，可能含有多肽、寡肽、氨基酸甚至小分子蛋白，給肽的分離純化造成了很大的難度，難以一次性從復(fù)雜的酶解物中篩選出具有高抗氧化活性的單一肽段，因此，合理選擇水解用酶，并建立可行且有效的、重復(fù)性高的蛋白質(zhì)酶解和純化體系是十分必要的。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】依據(jù)胰蛋白酶和堿性蛋白酶水解特性的不同，通過(guò)二步雙酶酶解法水解麥胚清蛋白，并結(jié)合多種多肽的分離純化技術(shù)，從麥胚清蛋白中篩選出高活性的天然抗氧化肽，以期為抗氧化肽的分離和篩選建立一種行之有效的方法，并為動(dòng)植物源多肽的抗氧化作用機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于 2014年在南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院及江蘇省糧油品質(zhì)控制及深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 材料與試劑

小麥胚芽由江蘇省淮安新豐面粉廠提供。

胰蛋白酶，生工生物工程（上海）股份有限公司；堿性蛋白酶Alcalase 2.4 L，丹麥諾維信生物技術(shù)有限公司；DPPH，美國(guó)Sigama公司；Sephadex G-75、Sephadex G-15，美國(guó)GE公司；乙腈、三氟乙酸（TFA），美國(guó)BD公司；其他試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司；電子分析天平，德國(guó)賽多利斯公司；SL-N系列電子天平，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；臺(tái)式恒溫振蕩器，太倉(cāng)市強(qiáng)樂(lè)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；標(biāo)準(zhǔn)型旋轉(zhuǎn)混勻儀，美國(guó)賽洛捷克公司；Milli-Q純水機(jī)、Labscale小型切向流超濾系統(tǒng)，默克密理博公司；蛋白純化系統(tǒng)，上海滬西分析儀器廠有限公司；酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio Tek公司；半制備液相儀，美國(guó) Waters公司；Triple TOF 5600+，ABSCIEX公司。

1.3 小麥胚芽清蛋白的制備

1.3.1 脫脂麥胚粉的制備 稱取一定質(zhì)量的小麥胚芽置于具塞錐形瓶中，加入5倍體積的正己烷，在30℃恒溫振蕩器中振蕩脫脂12 h后，換用3倍體積的正己烷繼續(xù)脫脂12 h。脫脂后的小麥胚芽平鋪在托盤(pán)中，通風(fēng)櫥中晾干，用高速萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎并過(guò)100目篩。將脫脂麥胚粉分裝，并在4℃下真空密封保存。

1.3.2 麥胚清蛋白的提取 麥胚清蛋白的提取依據(jù)OSBOREN［15］分級(jí)法，并稍作修改。取一定量的的脫脂麥胚粉，用去離子水按 1∶10（W/V）的料液比混合，并在40℃水浴中攪拌提取1 h，提取液在4℃條件下8 000 r/min離心30 min，取上清液；在上清液中緩慢加入硫酸銨配成飽和度為75％的溶液，在4℃下攪拌2 h使清蛋白鹽析沉淀；將上述溶液在4℃條件下13 000 r/min離心30 min，取沉淀；將沉淀透析除鹽并冷凍干燥即得到麥胚清蛋白粉。

1.4 麥胚抗氧化肽的制備和分離純化

1.4.1 胰蛋白酶酶解清蛋白制備抗氧化肽 麥胚清蛋白溶于 0.1 mol·L-1、pH 7.6的磷酸鹽緩沖液（KH2PO4-K2HPO4），配制成濃度為1％（W/V）的蛋白溶液，并盛放在50 mL離心管中；加入胰蛋白，加酶量為7 000 U·g-1蛋白；將50 mL離心管固定在旋轉(zhuǎn)混勻儀上，生化培養(yǎng)箱中于37℃反應(yīng)6 h。反應(yīng)結(jié)束后，在90℃水浴中加熱3 min滅酶，冰上冷卻，隨后在4℃、13 000 r/min離心20 min，棄去沉淀，將上清液在-20℃保存。

1.4.2 超濾膜分離 選用截流分子量為10 KDa的超濾膜對(duì)酶解物進(jìn)行分離。首先，用0.1 mol·L-1的磷酸鹽緩沖液將上一步反應(yīng)制備得到的胰酶酶解物稀釋為0.1％（W/V）的溶液，并用0.45 μm的濾膜過(guò)濾除去不溶物。將蛋白溶液倒入超濾杯中，調(diào)節(jié)泵的壓力使進(jìn)口端壓力不超過(guò) 20 psi，出口端的壓力不超過(guò) 30 psi，超濾過(guò)程在4℃下進(jìn)行。收集分子量小于10 KDa的濾過(guò)液，透析除鹽，冷凍干燥，凍干粉在-20℃密封保存。

1.4.3 凝膠過(guò)濾色譜分離（Sephadex G-75） 采用交聯(lián)葡聚糖Sephadex G-75對(duì)超濾后的組分進(jìn)行進(jìn)一步的分離和純化。Sephadex G-75干粉用去離子水充分溶脹，利用重力沉降原理裝填入25 mm×750 mm層析柱中，去離子水平衡；將1.4.2得到凍干粉溶于去離子水配成濃度為2％（W/V）的溶液，經(jīng)0.22 μm的濾膜過(guò)濾除去顆粒物，上樣量為柱體積的 5％；去離子水洗脫，流速為30 mL·h-1，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm，每10 min收集一管洗脫液，依據(jù)分離色譜圖將洗脫液合并，冷凍干燥，測(cè)抗氧化活性。

1.4.4 堿性蛋白酶酶解制備抗氧化肽 胰蛋白酶的酶解物經(jīng)過(guò)兩步分離后，取抗氧化活性最高的部分用堿性蛋白酶（Alcalase 2.4 L，酶活力：2.4 AU·mL-1）進(jìn)行酶解。樣品溶于0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖液（pH 8.0）配成濃度為3％（W/V）的蛋白溶液，加酶量0.15 AU/g蛋白，在50℃下酶解90 min。酶解過(guò)程在生化培養(yǎng)箱中進(jìn)行，利用旋轉(zhuǎn)混勻儀使酶解物混合均勻。反應(yīng)結(jié)束后，在90℃水浴中加熱3 min滅酶，冰上冷卻，冷凍干燥，凍干粉在-20℃密封保存。

1.4.5 凝膠過(guò)濾色譜分離（Sephadex G-15） 堿性蛋白酶酶解后的產(chǎn)物分子量較?。ㄒ话阈∮?.5 KDa），因此選用排阻體積為1.5 KDa的交聯(lián)葡聚糖SephadexG-15對(duì)其進(jìn)行分離和純化。Sephadex G-15干粉用去離子水充分溶脹，利用重力沉降原理裝填入15 mm ×600 mm層析柱中，去離子水平衡；堿性蛋白酶水解產(chǎn)物凍干粉溶于去離子水配成質(zhì)量百分濃度為2％的溶液，經(jīng)0.22 μm的濾膜過(guò)濾除去顆粒物，上樣量為柱體積的3％；去離子水洗脫，流速為24 mL·h-1，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm，每10 min收集一管洗脫液，依據(jù)分離色譜圖將洗脫液合并，冷凍干燥，測(cè)其抗氧化活性。

1.4.6 制備型 RP-HPLC分離 取上述純化步驟中抗氧化活性最高的組分，通過(guò)制備型 RP-HPLC，選用Waters XBridgeTMprep C18制備柱（300 ?，5 μm，10 mm×150 mm）進(jìn)行疏水性分離，分離條件如表 1，檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm，柱溫25℃。根據(jù)分離圖譜，對(duì)洗脫液進(jìn)行手動(dòng)收集，收集后冷凍干燥，并測(cè)抗氧化活性。流動(dòng)相A為含有0.1％（V/V）TFA和5％（V/V）乙腈的去離子水溶液，流動(dòng)相B為含有0.085％（V/V）TFA和20％（V/V）去離子水的乙腈溶液。

表1　RP-HPLC分離條件Table 1 Separation parameters for RP-HPLC

1.5 體外抗氧化活性測(cè)定

DPPH是一種自由基，在溶液中呈現(xiàn)紫色，517 nm下有吸收峰，加入自由基清除劑會(huì)使紫色變淡，褪色程度越高表明自由基清除能力越強(qiáng)［16-17］?？寡趸瘎┚哂序辖饘匐x子的作用，通過(guò)測(cè)定抗氧化劑對(duì)Fe2+螯合能力來(lái)表征其活性的高低［18-19］。

1.5.1 DPPH法 準(zhǔn)確稱量4.6 mg DPPH，用無(wú)水乙醇定容到100 mL，配成0.12 mmol·L-1的DPPH溶液，該溶液需避光保存、現(xiàn)用現(xiàn)配。將待測(cè)蛋白稀釋成不同濃度的溶液，取1 mL蛋白溶液和1 mL DPPH溶液混合均勻，25℃下避光反應(yīng)30 min，在517 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。試驗(yàn)需設(shè)置空白組（用不含樣品的溶液替代樣品）、對(duì)照組（用無(wú)水乙醇替代DPPH溶液）和試驗(yàn)組，每組設(shè)置3個(gè)平行。DPPH清除率計(jì)算公式如下：

Ai：樣品組吸光值，Aj：對(duì)照組吸光值，A0：空白組吸光值。

以樣品濃度為橫坐標(biāo)，DPPH清除率為縱坐標(biāo)繪制曲線，求得清除50％ DPPH自由基所需樣品的濃度，即半數(shù)有效濃度，用EC50表示。EC50的數(shù)值越小則表示肽的抗氧化活性越強(qiáng)。

1.5.2 Fe2+螯合能力測(cè)定法 待測(cè)樣品溶于去離子水配制成不同濃度的蛋白溶液，F(xiàn)eCl2溶于去離子水配制成2 mmol·L-1的溶液，菲洛嗪溶于30％的乙酸鈉配制成5 mmol·L-1的溶液。1.5 mL樣品加入25 μL FeCl2溶液室溫振蕩5 min。加入50 μL菲洛嗪溶液，充分混勻后，室溫下反應(yīng)5 min，在562 nm下測(cè)吸光值。試驗(yàn)需設(shè)置樣品組、樣品空白組、對(duì)照組和對(duì)照空白組，每組3個(gè)平行。Fe2+螯合率計(jì)算公式如下：

S：樣品組，SB：樣品空白組，C：對(duì)照組，CB：對(duì)照空白組。

以樣品濃度為橫坐標(biāo)，F(xiàn)e2+螯合率為縱坐標(biāo)繪制曲線，求出螯合Fe2+的EC50值。

1.6 抗氧化肽的結(jié)構(gòu)鑒定

采用質(zhì)譜技術(shù)（ESI-TOF MS/MS）對(duì)制備型RP-HPLC分離得到的抗氧化活性最高的組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果采用數(shù)據(jù)處理軟件 SPSS17.0進(jìn)行Student-t檢驗(yàn)和LSD多重比較。

2 結(jié)果

2.1 胰蛋白酶酶解產(chǎn)物的分離和抗氧化活性測(cè)定

將胰蛋白酶酶解物依次經(jīng)過(guò)超濾膜和 Sephadex G-75分離，得到3個(gè)活性組分Pa、Pb、Pc，提取率分別為42.3％、23.1％和12.1％，分離色譜圖如圖1。分別采用DPPH法（圖2）和Fe2+螯合能力測(cè)定法（圖3）測(cè)3個(gè)組分的抗氧化活性。由圖2和圖3可知，兩個(gè)測(cè)定方法的結(jié)果一致，Pb的抗氧化活性最強(qiáng)，其次為Pc，Pa的抗氧化活性最弱，3個(gè)組分的抗氧化活性差異顯著（P＜0.05）。因此，選取組分 Pb進(jìn)行下一步堿性蛋白酶酶解。

圖1　胰蛋白酶酶解物的Sephadex G-75分離色譜圖Fig. 1 Chromatogram of tryptic hydrolysates separated by Sephadex G-75

不同字母表示差異顯著（P＜0.05）。下同Different letters refer to the significant differences （P＜0.05）. The same as below圖2　不同組分的DPPH清除能力Fig. 2 DPPH scavenging activity of different separate fractions

圖3　不同組分的Fe2+螯合能力Fig. 3 Fe2+chelating activity of different separate fractions

2.2 堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的分離和抗氧化活性測(cè)定

2.2.1 凝膠過(guò)濾色譜分離和抗氧化活性測(cè)定 Pb經(jīng)堿性蛋白酶酶解后，其酶解物通過(guò)凝膠過(guò)濾色譜（Sephadex G-15）分離，得到兩個(gè)活性組分Pd和Pe，提取率分別為52.1％和27.6％，分離色譜圖如圖4。通過(guò)DPPH法和Fe2+螯合能力測(cè)定法測(cè)兩個(gè)組分的抗氧化活性，結(jié)果如圖5和圖6。由測(cè)定結(jié)果可知Pd的抗氧化活性高于Pe，兩者的差異顯著（P＜0.05）。因此，選取組分Pd進(jìn)行下一步的RP-HPLC疏水性分離。

2.2.2 制備型RP-HPLC分離和抗氧化活性測(cè)定 Pd經(jīng)過(guò) RP-HPLC疏水性分離，被分成了 P1、P2、P3、P4、P55個(gè)峰，如圖7所示。5個(gè)峰的保留時(shí)間分別為P1：11.90—12.17 min，P2：12.28—12.55 min，P3：12.61 —12.88 min，P4：15.04—15.64 min，P5：16.99—17.38 min，其提取率分別為10.2％、6.1％、7.3％、11.3％和5.2％。采用DPPH法和Fe2+螯合能力測(cè)定法測(cè)5個(gè)組分的抗氧化活性，結(jié)果如圖8和圖9。由測(cè)定結(jié)果可知P3的抗氧化活性最高，P3與其他4個(gè)組分的活性差異顯著（P＜0.05），其 DPPH自由基清除率和 Fe2+螯合能力的EC50值分別為1 mg·mL-1和0.6 mg·mL-1。

綜上所述，經(jīng)過(guò)多步分離純化篩選得到抗氧化活性最高的組分P3，選擇其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定以確定其氨基酸序列。

2.3 抗氧化肽的結(jié)構(gòu)鑒定

圖4　堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的Sephadex G-15分離色譜圖Fig. 4 Chromatogram of alcalase hydrolysates separated by Sephadex G-15

圖5　不同組分的DPPH清除能力Fig. 5 DPPH scavenging activity of different separate fractions

圖6　不同組分的Fe2+螯合能力Fig. 6 Fe2+chelating activity of different separate fractions

圖7　Pd分離液相圖Fig. 7 Reversed-phase HPLC profiles of the fraction Pdseparated by Sephadex G-15

圖8　不同組分的DPPH清除能力Fig. 8 DPPH scavenging activity of different separate fractions

圖9　不同組分的Fe2+螯合能力Fig. 9 Fe2+chelating activity of different separate fractions

圖10　P3樣品總離子流圖Fig. 10 MS TIC of P3

圖11　P3樣品的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig. 11 MS/MS spectrum of P3

采用ESI-TOF MS/MS對(duì)P3的氨基酸序列進(jìn)行鑒定。樣品首先經(jīng)由RP-HPLC分離（圖10），再利用二級(jí)質(zhì)譜（MS/MS）使多肽碎片化（圖11），最后通過(guò)軟件對(duì)分子碎片進(jìn)行分析。由圖10可知經(jīng)過(guò)多步分離純化后，P3已達(dá)到了較高的純度（約為85％），組成相對(duì)單一。經(jīng)測(cè)定，其氨基酸序列可能為RAEGETVVPG或者AREGETVVPG，通過(guò)與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中的信息進(jìn)行比對(duì)，確定其氨基酸序列為AREGETVVPG。此外，通過(guò)化學(xué)方法合成純度在95％以上的多肽序列AREGETVVPG，對(duì)其體外抗氧化活性進(jìn)行了測(cè)定。P3的抗氧化活性與用化學(xué)方法合成的多肽AREGETVVPG（純度95％以上）相比，沒(méi)有顯著差異（P＞0.05）。

3 討論

酶解法制備抗氧化肽具有水解位點(diǎn)特異、重復(fù)性高的特點(diǎn)，然而傳統(tǒng)的雙酶酶解工藝仍然由于酶解后的組分多，難以從麥胚蛋白中分離純化制備單一的抗氧化肽。本研究首先采用酶解位點(diǎn)少且具有限制性消化特性的胰蛋白酶酶解麥胚清蛋白，其水解物組分相對(duì)較少，然后經(jīng)過(guò)超濾膜初步分級(jí)篩選，去除低抗氧化活性的大分子蛋白多肽，將較高抗氧化活性的小分子蛋白多肽經(jīng)Sephadex G-75分離得到3個(gè)組分（峰）。選取抗氧化活性高的組分進(jìn)行第二步堿性蛋白酶（酶解位點(diǎn)多、水解效率高）酶解得到小分子多肽，其酶解產(chǎn)物經(jīng)Sephadex G-15和RP-HPLC分離篩選出純度較高、相對(duì)單一的抗氧化活性肽。因此，本研究采用的二步雙酶酶解結(jié)合超濾膜、凝膠過(guò)濾色譜和RP-HPLC等蛋白分離純化技術(shù)為直接得到單一的高活性抗氧化肽提供了一種有效的工藝流程。

在前期研究中，根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量、離子特性、親和性和疏水性等不同的性質(zhì)，采用多種分離純化手段對(duì)酶解物進(jìn)行逐級(jí)分離篩選，在制備出較高活性、相對(duì)較少的多肽混合組分基礎(chǔ)上，通過(guò)質(zhì)譜鑒定出具有不同抗氧化活性肽［20-21］。SUETSUNA等［20］就利用凝膠過(guò)濾色譜 Sephadex G-25、陽(yáng)離子交換色譜SP-Sephadex C-25和RP-HPLC從酪蛋白中分離得到了具有不同自由基清除活性的混合多肽組分，并進(jìn)行質(zhì)譜鑒定出強(qiáng)自由基清除活性的多肽序列YFYPEL；PARK等［21］分別采用超濾膜、SP-Sephadex C-25、Sephadex G-25和HPLC從狹鱈的酶解物中分離得到了相對(duì)較少的混合多肽組分，通過(guò)質(zhì)譜鑒定出分子量為672 Da的抗氧化肽LPHSGY。但是，傳統(tǒng)的酶解分離純化工藝流程最終只能獲得相對(duì)較少的混合多肽組分，而本研究的工藝流程則能直接制備出純度較高、相對(duì)單一的抗氧化活性肽組分。

肽的抗氧化活性與肽的氨基酸種類、數(shù)量和排序有關(guān)。許多已分離出的抗氧化肽中含有疏水性氨基酸，例如CHEN等［22］從大豆蛋白中分離得到的6種抗氧化肽，其N-端都為疏水性氨基酸，AREGETVVPG中有疏水性氨基酸Ala（A）、Val（V）和Pro（P），這3種氨基酸對(duì)于抗氧化肽的活性可能發(fā)揮著重要的作用，尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，肽的抗氧化作用也與肽的構(gòu)象、序列有關(guān)，與抗氧化肽含有同等氨基酸量的混合物與肽的活性進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，肽的抗氧化活性更強(qiáng)，這就說(shuō)明構(gòu)象和氨基酸的排序?qū)﹄牡幕钚杂杏绊懀?3］。從豬肌原纖維蛋白中分離得到的肽IEAEGE具有很強(qiáng)的自由基清除活性和金屬離子螯合能力［24］，與麥胚抗氧化肽AREGETVVPG具有相同的氨基酸序列EGE；從海洋輪蟲(chóng)（Brachionus rotundiformis）中分離出的抗氧化肽LLGPGLTNHA和DLGLGLPGAH［25］均含有與麥胚抗氧化肽AREGETVVPG相同的序列PG。因此，推斷EGE和PG可能是具有抗氧化活性的特征序列，而AREGETVVPG的抗氧化活性高于上述肽，本研究的序列中有可能還含其他特征片段或是由于這些特征片段的綜合作用，但尚需進(jìn)一步的研究和驗(yàn)證。另外，采用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)還需進(jìn)一步的驗(yàn)證AREGETVVPG的體內(nèi)抗氧化活性，并對(duì)其抗氧化作用機(jī)制進(jìn)行闡釋。

4 結(jié)論

建立了從小麥胚芽清蛋白中有效地分離純化抗氧化肽的工藝流程。用胰蛋白酶限制性消化小麥胚芽清蛋白，獲得的組分相對(duì)較少，易于用超濾膜和凝膠過(guò)濾色譜Sephadex G-75進(jìn)行初步的篩選分離。繼而采用堿性蛋白酶Alcalase 2.4 L酶解上一步的抗氧化活性較高的分離產(chǎn)物可獲得活性更高的小分子肽，并通過(guò)凝膠過(guò)濾色譜Sephadex G-15和RP-HPLC分離純化得到純度較高、相對(duì)單一的 5個(gè)組分，對(duì)其中抗氧化活性最強(qiáng)的組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，確定其氨基酸序列為 AREGETVVPG，分子量為 1 013.51 Da。該抗氧化肽的DPPH自由基清除率和Fe2+螯合能力的EC50值分別為1 mg·mL-1和0.6 mg·mL-1，表明該抗氧化肽具有很強(qiáng)的抗氧化活性。綜上所述，本研究的二步雙酶酶解結(jié)合 3種蛋白分離純化技術(shù)的方法為直接得到單一的高活性抗氧化肽提供了一種有效的工藝參考。

致謝：本論文在撰寫(xiě)過(guò)程中承蒙周建新教授的幫助，謹(jǐn)致謝意！

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（責(zé)任編輯 趙伶俐）

The Preparation Process for Isolation of a Highly Active Antioxidant Peptide Derived from Wheat Germ Albumin

CHEN Si-yuan， LIU Yong-xiang， CAO Xiao-zhou， ZHANG Yi-jing， CHEN Hai-juan， SHEN Xin-chun
（College of Food Science and Engineering， Nanjing University of Finance and Economics/Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety/Key Laboratory of Grains and Oils Quality Control and Processing， Nanjing 210023）

Abstract：【Objective】 The aim of this study is to develop an effective preparation process for obtaining highly active antioxidant peptide derived from wheat germ albumin using two-step dual-enzymatic hydrolysis. 【Method】 A two-step dual-enzymatic hydrolysis and separation were employed to screen the antioxidant peptide （AOP） from wheat germ albumin. The in vitro AOP's antioxidant activity was evaluated by DPPH radical scavenging activity and Fe2+chelating ability assays. The hydrolysate derived from tryptic hydrolysis of wheat germ albumin was fractionated by ultrafiltration according to molecular weight；then the fractions with high antioxidant capacity were further isolated by gel filtration chromatography （Sephadex G-75）. After that，the fraction with higher antioxidant activity was further hydrolyzed by an alcalase， and the hydrolysate was subjected to purification by Sephadex G-15 gel filtration chromatography and reversed-phase HPLC （RP-HPLC）， respectively. The highest antioxidant fraction was achieved and the structure was identified by ESI-TOF MS/MS. 【Result】 Hydrolysate derived from tryptic hydrolysisof wheat germ albumin was fractionated by ultrafiltration according to molecular weight. Three fractions， Pa， Pband Pcwere obtained from the fraction with high antioxidant capacity. The fraction Pbshowed the strongest antioxidant activity evaluated by DPPH radical scavenging activity and Fe2+chelating ability assays and its extraction yield was 23.1％. The fraction Pbwhich had the highest antioxidant activity was further hydrolyzed by an alcalase， and the hydrolysate was subjected to gel filtration chromatography （Sephadex G-15） and two more groups， Pdand Pewere obtained. The extraction yield of fraction Pdwhich had higher antioxidant capacity was 52.1％. After further purification by RP-HPLC， five fractions， P1， P2， P3， P4and P5were separated from the fraction Pd，and the fraction P3exhibited the highest antioxidant activity with the in vitro EC50values of DPPH radical scavenging activity at 1 mg/ml and Fe2+chelating ability at 0.6 mg/ml， respectively. The extraction yield of the fraction P3was 7.3％ in RP-HPLC step. Finally， employing the electrospray ionization-time-of-flight mass spectrometer （ESI-TOF MS/MS）， the structure of the fraction P3was identified. Its amino acids sequence， molecular weight and purity were AREGETVVPG， 1013.51Da and 85％， respectively. Consistently， the antioxidant capacity of the synthetic peptide with the same sequences （ purity ≥95％） showed the similar activity to the fraction P3（P＞0.05）. 【Conclusion】 The preparation process of a two-step dual-enzymatic hydrolysis in combination with ultrafiltration， gel filtration chromatography， and RP-HPLC was effective in separation， screen and purification of a highly active antioxidant peptide.

Key words：wheat germ； albumin； a two-step dual-enzymatic hydrolysis； separation and purification； antioxidant peptide （AOP）

收稿日期：2015-11-03；接受日期：2016-03-02

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（31271983）、江蘇省高校自然科學(xué)研究重大項(xiàng)目（14KJA550002）、2014年度江蘇省高校第四期“333工程”資助科研項(xiàng)目、2015年度江蘇省高校優(yōu)秀科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目、江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目