• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    普通小麥轉(zhuǎn)錄因子基因TaWRKY35的克隆及功能分析

    2016-07-18 09:32:12劉自成苗麗麗王景一楊德龍毛新國(guó)景蕊蓮
    關(guān)鍵詞:非生物脅迫耐鹽性小麥

    劉自成,苗麗麗,王景一,楊德龍,毛新國(guó),景蕊蓮

    (1甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,蘭州 730070;2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所/農(nóng)作物基因資源與基因改良國(guó)家重大科學(xué)工程/農(nóng)業(yè)部農(nóng)作物種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室,北京 100081)

    ?

    普通小麥轉(zhuǎn)錄因子基因TaWRKY35的克隆及功能分析

    劉自成1,2,苗麗麗2,王景一2,楊德龍1,毛新國(guó)1,2,景蕊蓮2

    (1甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,蘭州 730070;2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所/農(nóng)作物基因資源與基因改良國(guó)家重大科學(xué)工程/農(nóng)業(yè)部農(nóng)作物種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室,北京 100081)

    摘要:【目的】非生物逆境是制約小麥生產(chǎn)的主要因素。WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族,參與對(duì)多種非生物逆境脅迫的應(yīng)答。普通小麥基因組中至少含有200個(gè)WRKY,目前僅對(duì)少數(shù)成員的功能進(jìn)行了鑒定。通過(guò)克隆小麥 WRKY轉(zhuǎn)錄因子 TaWRKY35并揭示其功能,為改良小麥的抗逆性提供基因資源。【方法】利用小麥全長(zhǎng)cDNA數(shù)據(jù)信息,從強(qiáng)抗旱小麥品種旱選10號(hào)中克隆逆境脅迫應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子基因TaWRKY35;采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù),分析目標(biāo)基因在不同發(fā)育時(shí)期、不同組織器官中的表達(dá)水平,以及在PEG-6000、NaCl、ABA和低溫等逆境脅迫下的表達(dá)模式;構(gòu)建目標(biāo)基因與GFP融合的表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化小麥原生質(zhì)體,以確定目標(biāo)蛋白在細(xì)胞中的作用位置;構(gòu)建TaWRKY35過(guò)表達(dá)載體,通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化擬南芥,揭示目標(biāo)基因的功能。【結(jié)果】TaWRKY35的開放閱讀框全長(zhǎng)1 134 bp,編碼377個(gè)氨基酸的蛋白。TaWRKY35的N端有一個(gè)典型的WRKY結(jié)構(gòu)域,C端有一個(gè)C2HC型的鋅指結(jié)構(gòu)域,屬于WRKY家族第Ⅲ亞家族。測(cè)序發(fā)現(xiàn)TaWRKY35編碼區(qū)序列非常保守,在32份多態(tài)性較高的六倍體小麥材料中未檢測(cè)到DNA多態(tài)性。TaWRKY35在小麥的不同發(fā)育時(shí)期、不同組織中均有表達(dá),其中在幼苗根基部表達(dá)量最高,約為苗期葉片中表達(dá)量的26倍;其次為幼芽根基,約為苗期葉片中表達(dá)量的21倍;接下來(lái)依次為孕穗期莖節(jié)、孕穗期穗、芽期根、孕穗期根、苗期根、胚芽、孕穗期葉片,而在幼苗葉片中表達(dá)水平最低;同時(shí)在ABA、NaCl、PEG和低溫脅迫條件下,小麥幼苗TaWRKY35的表達(dá)量均顯著上升,表明TaWRKY35參與對(duì)4種逆境脅迫的應(yīng)答,但在不同脅迫條件下表達(dá)模式差異顯著,其中對(duì)鹽脅迫最敏感。亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn),TaWRKY35特異定位在細(xì)胞核上,是典型的核定位蛋白。在高鹽脅迫條件下,TaWRKY35過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥子葉白化率顯著低于對(duì)照,TaWRKY35過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥的細(xì)胞膜穩(wěn)定性和幼苗存活率均顯著高于野生型對(duì)照,表明TaWRKY35能增強(qiáng)植物的耐鹽性。【結(jié)論】TaWRKY35編碼蛋白含有WRKY和C2HC結(jié)構(gòu)域,為WRKY家族第Ⅲ亞家族成員。TaWRKY35在小麥發(fā)育的不同時(shí)期、不同組織中均有表達(dá),且受ABA、PEG、NaCl及低溫等逆境脅迫誘導(dǎo)。過(guò)表達(dá)TaWRKY35能顯著提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性。

    關(guān)鍵詞:小麥;WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因;非生物脅迫;耐鹽性

    聯(lián)系方式:劉自成,E-mail:liuyao8916@163.com。通信作者楊德龍,Tel:0931-7631875;E-mail:yangdl@gsau.edu.cn。通信作者毛新國(guó),Tel:010-82105829;E-mail:maoxinguo@caas.cn

    0 引言

    【研究意義】小麥?zhǔn)鞘澜缟现匾募Z食作物之一,干旱、高鹽、極端溫度等非生物逆境是制約小麥生產(chǎn)的主要因素。克隆抗逆基因,揭示其功能是利用現(xiàn)代生物技術(shù)改良小麥抗逆性的前提和基礎(chǔ)?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】遭受逆境脅迫時(shí),植物在分子、細(xì)胞和生理水平產(chǎn)生一系列變化以適應(yīng)不利環(huán)境[1-2]。植物體內(nèi)參與逆境脅迫應(yīng)答的基因很多,根據(jù)基因產(chǎn)物的功能分為兩大類:功能蛋白和調(diào)節(jié)蛋白,其中,功能蛋白主要包括水通道蛋白、LEA蛋白、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成的酶類以及各種抗氧化酶等;調(diào)節(jié)蛋白則包括蛋白激酶、蛋白磷酸酶和轉(zhuǎn)錄因子等。WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子,因其 N端含有高度保守的WRKYGQK基序而得名。WRKY轉(zhuǎn)錄因子最早發(fā)現(xiàn)于甘薯中[3],隨后在野燕麥、荷蘭芹、擬南芥、馬鈴薯、白英、煙草和水稻中相繼被發(fā)現(xiàn)[4]。WRKY家族成員均含1—2個(gè)與DNA結(jié)合的WRKY結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域由 60個(gè)左右高度保守的氨基酸組成,其中WRKYGQK是核心序列,該序列氨基酸突變將導(dǎo)致DNA結(jié)合活性的減弱,甚至喪失[5];WRKY成員的C端包含一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域,即 C2H2或者 C2HC。根據(jù)WRKY結(jié)構(gòu)域的數(shù)量和鋅指結(jié)構(gòu)域的類型將WRKY家族分成3個(gè)亞家族(Group)[4]:亞家族Ⅰ(GroupⅠ)有2個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和1個(gè)C2H2(CX4-5CX22-23HX1H)型鋅指結(jié)構(gòu)域;亞家族Ⅱ(GroupⅡ)成員只含有 1 個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和1個(gè)C2H2結(jié)構(gòu)域;亞家族Ⅲ(GroupⅢ)成員含1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和1個(gè)C2HC型(即CX7CX23HX1C)鋅指結(jié)構(gòu)域[6]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)WRKY結(jié)構(gòu)域特異識(shí)別目標(biāo)基因啟動(dòng)子區(qū)域的(T)(T)TGAC(C/T)序列(W-box)進(jìn)而調(diào)控目標(biāo)基因的表達(dá)[4,7]。研究發(fā)現(xiàn),WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起重要作用,并參與抗病應(yīng)答[8]。近期越來(lái)越多的證據(jù)表明,WRKY轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)ABA依賴或者非ABA依賴的逆境信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與對(duì)非生物逆境脅迫的應(yīng)答[9-11]。過(guò)表達(dá)WRKY轉(zhuǎn)錄因子可以增強(qiáng)植物的抗逆性,例如過(guò)表達(dá) AtWRKY25、AtWRKY33能顯著增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)高溫和高鹽的耐受性[12-14];過(guò)表達(dá)BdWRKY36能顯著增強(qiáng)煙草對(duì)干旱的耐受性[15];過(guò)表達(dá)GmWRKY13、GmWRKY21和GmWRKY54能增強(qiáng)植物對(duì)多種非生物逆境脅迫的耐受性[16];過(guò)表達(dá)OsWRKY11能夠提高水稻對(duì)高溫、干旱等脅迫的耐受性[17],過(guò)表達(dá)OsWRKY47能提高水稻的抗旱性[18]。研究推測(cè),普通小麥基因組中至少含有200個(gè)WRKY基因[19],但目前僅有少數(shù)成員的功能被鑒定,其中 TaWRKY10(GroupⅡ)、TaWRKY44(GroupⅠ)參與對(duì)多種非生物逆境脅迫的應(yīng)答,過(guò)量表達(dá)能增強(qiáng)植物的抗旱性和耐鹽性[20-21];2012年,NIU等[22]在小麥cDNA文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)了43個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子,其中TaWRKY2(GroupⅠ)受干旱、鹽和ABA誘導(dǎo)表達(dá),過(guò)量表達(dá)TaWRKY2能提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱、耐鹽性。TaWRKY19(GroupⅠ)除受上述3種逆境脅迫誘導(dǎo)外,還參與對(duì)冷脅迫的應(yīng)答,過(guò)量表達(dá)該基因能提高擬南芥的抗旱、耐鹽及耐凍性[22]。2015年,QIN等[23]研究發(fā)現(xiàn)TaWRKY93參與對(duì)鹽脅迫和 ABA處理的應(yīng)答,過(guò)量表達(dá) TaWRKY93 (GroupⅡ)能提高擬南芥對(duì)多種非生物逆境的耐受性?!颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】已有研究證明,小麥 WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與對(duì)非生物脅迫的應(yīng)答,然而迄今為止,僅對(duì)GroupⅠ、GroupⅡ的個(gè)別基因進(jìn)行了功能分析,而關(guān)于 Group Ⅲ成員的功能研究尚未見報(bào)道。TaWRKY35屬于WRKY Group Ⅲ,它是否參與非生物脅迫的應(yīng)答,以及其在逆境脅迫應(yīng)答反應(yīng)的功能目前均不明確。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究克隆了一個(gè)新的小麥 WRKY基因,屬于 Group Ⅲ,命名為TaWRKY35。對(duì)其在不同發(fā)育時(shí)期、不同組織的特異性表達(dá)水平,在ABA、PEG、NaCl、低溫逆境脅迫處理的表達(dá)模式,以及在細(xì)胞中的作用部位進(jìn)行分析,并通過(guò)轉(zhuǎn)化擬南芥鑒定其功能,旨在為利用 WRKY轉(zhuǎn)錄因子提高小麥抗逆性提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 植物材料及其培養(yǎng)

    試驗(yàn)于 2014—2015年在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所進(jìn)行。利用農(nóng)業(yè)部農(nóng)作物種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室保存的強(qiáng)抗旱小麥品種旱選 10號(hào)進(jìn)行基因克隆、基因表達(dá)模式分析和目標(biāo)蛋白的亞細(xì)胞定位。挑選大小均勻一致的旱選10號(hào)種子放在玻璃培養(yǎng)皿中,在光照培養(yǎng)箱(23℃、光周期12 h·d-1)中水培,待幼苗成長(zhǎng)至一葉一心(10 d苗齡)時(shí),分別用50 mmol·L-1ABA、16.1% PEG-6000(-0.5 MP)、250 mmol·L-1NaCl和低溫(4℃)進(jìn)行脅迫處理,在處理0、0.5、1、1.5、2、3、6、12、24、48和72 h取幼苗葉片,-80℃保存,用于分析目標(biāo)基因逆境脅迫條件下的表達(dá)模式。在培養(yǎng)皿上水培旱選10號(hào),芽期取根部、根基部、胚芽;田間種植旱選10號(hào),苗期取幼苗的根、根基和葉片,孕穗期取莖節(jié),孕穗后期取根、葉和幼穗,-80℃保存,用于分析目標(biāo)基因的組織特異表達(dá)。挑選籽粒飽滿的小麥種子在培養(yǎng)皿中,用去離子水室溫避光培養(yǎng),培養(yǎng)至一葉一心時(shí),取黃化幼苗葉片的中段制備原生質(zhì)體,進(jìn)行目標(biāo)蛋白的亞細(xì)胞定位。

    基因染色體定位材料包括普通小麥二倍體供體種材料:烏拉爾圖小麥(UR200、UR204、UR205)、擬斯卑爾托山羊草(Y2017、Y2033、Y2035和Y2178)、粗山羊草(Ae38、Ae46和Y57);四倍體材料(DS1、DM49和DM50)和異源六倍體普通小麥材料旱選10號(hào)?;蚨鄳B(tài)性分析材料為農(nóng)業(yè)部農(nóng)作物種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室前期利用 SSR標(biāo)記篩選的32份高多態(tài)性材料(表1)。室溫條件下水培,取幼苗葉片提取DNA。

    1.2 目的基因克隆

    利用WRKY保守結(jié)構(gòu)域搜索小麥全長(zhǎng)cDNA數(shù)據(jù)庫(kù),得到目標(biāo)基因的cDNA序列。根據(jù)cDNA序列信息設(shè)計(jì)引物WRKY35-C-F和WRKY35-C-R(表2),以旱選10號(hào)小麥cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因。以目標(biāo)基因的cDNA序列為源序列,搜索小麥A基因組數(shù)據(jù)庫(kù)和D基因組數(shù)據(jù)庫(kù),通過(guò)A基因組數(shù)據(jù)庫(kù)得到的基因組序列與cDNA序列一致性最高,以該基因組序列為模板,利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增全長(zhǎng)序列的引物TaWRKY35-F和TaWRKY35-R(表2)。

    用植物總RNA提取試劑盒(TIANGEN,北京)提取小麥不同脅迫處理的葉片和不同組織的總RNA。以總RNA為模板,用M-MLV Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen,美國(guó))反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。以cDNA為模板,利用高保真聚合酶TransStart Fast Pfu(Transgen,北京)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系包含模板DNA(50 ng·μL-1)2 μL、5×TransStart Fast Pfu buffer 4 μL、2.5 μmol·L-1dNTP 1.6 μL、DNA Polymerase 0.4 μL、正、反向引物(10 μmol·L-1)各0.8 μL,用ddH2O補(bǔ)足20 μL。反應(yīng)條件為95℃ 5 min;95℃ 45 s,60℃ 45 s,72℃ 60 s,38個(gè)循環(huán);72℃ 10 min。用1.5%瓊脂糖凝膠分離PCR產(chǎn)物,將目的片段用 PCR產(chǎn)物純化試劑盒(生工,上海)回收后,與pEASY-Blunt載體(Transgen,北京)連接,用BigDye Terminator Kit(ABI,美國(guó))測(cè)序。

    1.3 基因結(jié)構(gòu)和序列分析

    用DNAStar軟件包中Seqman和MegAlign進(jìn)行基因序列分析、拼接和比對(duì),用DNAman進(jìn)行蛋白序列比對(duì)分析,用MEGA(Version 6.06)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

    表1 供試小麥材料Table 1 Wheat accessions used in this study

    表2 試驗(yàn)中使用的引物Table 2 Primers used in the experiments

    1.4 載體構(gòu)建和亞細(xì)胞定位

    利用生物信息學(xué)網(wǎng)站(http://cello.life.nctu.edu.tw)預(yù)測(cè) TaWRKY35在細(xì)胞中的定位。為進(jìn)一步驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果,設(shè)計(jì)亞細(xì)胞定位引物(分別在引物5′和3′端引入了HindⅢ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)),將TaWRKY35全長(zhǎng)CDS(coding sequence)序列(不含終止密碼子)克隆到 pJIT163-GFP載體融合表達(dá),構(gòu)建 pJIT163-35S::TaWRKY35::GFP載體。用PEG法轉(zhuǎn)化小麥原生質(zhì)體,室溫避光培育15 h,在Zeiss LSM700激光共聚焦顯微鏡下觀察TaWRKY35-GFP在小麥原生質(zhì)體中的定位。

    1.5 目標(biāo)基因的實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)

    根據(jù)TaWRKY35全長(zhǎng)CDS序列設(shè)計(jì)qRT-PCR引物WRKY35-RT-F和WRKY35-RT-R,以小麥Actin (JQ269668.1)的引物 Actin F1和 Actin R1為qRT-PCR內(nèi)參引物(表2)。根據(jù)SYBR Premix Ex Taq (Perfect Real Time)試劑盒(TaKaRa,日本)說(shuō)明書操作,反應(yīng)體系為1/10 cDNA first-strand 1.0 μL、2× SYBR Premix Ex Taq 10.0 μL、50×ROX Reference Dye 0.4 μL、正、反向引物(5 μmol·L-1)各0.4 μL,用ddH2O補(bǔ)至20 μL。用ABI 7900實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)條件為95℃ 30 s;95℃ 5 s,退火30 s,40個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)采用2-△△CT法計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量[24]。

    1.6 擬南芥轉(zhuǎn)化及其耐鹽性鑒定

    利用KpnⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)將TaWRKY35全長(zhǎng)CDS序列克隆到pCHF3載體上。將構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101菌株,采用浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥。經(jīng)卡那霉素抗性篩選和PCR檢測(cè)后獲得T3純合轉(zhuǎn)基因株系,選取目標(biāo)基因表達(dá)量相對(duì)較高的3個(gè)株系用于耐鹽性分析。

    將野生型(WT)、轉(zhuǎn)基因株系種子用 10%次氯酸鈉溶液消毒處理后,點(diǎn)播于MS培養(yǎng)基上,將培養(yǎng)皿置于人工氣候室中垂直培養(yǎng)。將培養(yǎng)7 d的幼苗分成兩部分,一部分在MS培養(yǎng)基上進(jìn)行抗逆表型鑒定,具體操作如下:將長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗10株,分別移至含有 60 μmol·L-1ABA、250 mmol·L-1NaCl和 200 mmol·L-1甘露醇的MS固體培養(yǎng)基上,處理7 d,觀察表型,設(shè)3次重復(fù)。另一部分移到底部有孔的長(zhǎng)方形篩盤中(營(yíng)養(yǎng)土∶蛭石=1∶1),每個(gè)株系一行,每行10株幼苗。正常生長(zhǎng)3周,然后用200 mmol·L-1NaCl溶液處理(將篩盤放在鹽溶液中,直至土壤鹽溶液飽和),跟蹤觀察轉(zhuǎn)基因植株在鹽脅迫下的表型,計(jì)算植株存活率,重復(fù)3次。

    細(xì)胞膜穩(wěn)定性測(cè)定:利用電導(dǎo)儀分別測(cè)定煮沸前與煮沸后幼苗的相對(duì)電導(dǎo)率,評(píng)價(jià)細(xì)胞膜穩(wěn)定性(cell membrane stability,CMS)。從垂直培養(yǎng)的幼苗中取長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗10株,移至含有250 mmol·L-1NaCl 的MS固體培養(yǎng)基上,處理7 d。測(cè)定幼苗電導(dǎo)率,10株為一次重復(fù),設(shè)3次重復(fù)。CMS(%)=(1-煮前電導(dǎo)率/煮后電導(dǎo)率)×100%。CMS值越大,表明細(xì)胞膜穩(wěn)定性越高,植物受損傷程度越低。

    2 結(jié)果

    2.1 目標(biāo)基因克隆

    以普通小麥旱選10號(hào)cDNA為模板,利用引物對(duì)WRKY35-C-F和WRKY35-C-R擴(kuò)增目標(biāo)基因。測(cè)序表明,該基因開放閱讀框全長(zhǎng)1 134 bp,編碼377個(gè)氨基酸。NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)發(fā)現(xiàn)該蛋白的N端有一個(gè)典型的WRKY結(jié)構(gòu)域,C端有一個(gè)C2HC型鋅指結(jié)構(gòu)域。

    2.2 TaWRKY35氨基酸序列同源性分析

    將TaWRKY35編碼的氨基酸序列提交到NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行蛋白質(zhì)序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)其與大麥HvWRKY35 (ABL_11228.1)、短柄草BdWRKY2(XP_014757278.1)、水稻 OsWRKY35(NP_001056863.1)、擬南芥AtWRKY35(XP_008660715.1)具有較高的相似性,序列一致性分別為79%、60%、50%和45%,因此將其命名為 TaWRKY35。盡管在序列一致性方面有差異,但TaWRKY35與上述WRKY成員的序列結(jié)構(gòu)相同,均含有一個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和C端鋅指結(jié)構(gòu)(圖1-A)。小麥TaWRKY35含有一個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和一個(gè)C2HC類型的鋅指結(jié)構(gòu)域,屬于WRKY轉(zhuǎn)錄因子GroupⅢ(圖1-B)。

    2.3 TaWRKY35結(jié)構(gòu)及序列多態(tài)性分析

    以小麥二倍體供體種(烏拉爾圖小麥、擬斯卑爾托山羊草、粗山羊草)、四倍體和六倍體小麥基因組 DNA為模板,利用引物 TaWRKY35-F和TaWRKY35-R擴(kuò)增目標(biāo)基因,發(fā)現(xiàn)只能在含有A基因組的材料中擴(kuò)增出 TaWRKY35,說(shuō)明其可能來(lái)自小麥A基因組。測(cè)序表明該基因編碼區(qū)全長(zhǎng)2.55 kb,含有3個(gè)外顯子,2個(gè)內(nèi)含子。用上述引物在32份高多態(tài)性的六倍體小麥中擴(kuò)增 TaWRKY35,測(cè)序結(jié)果未發(fā)現(xiàn)DNA多態(tài)性,說(shuō)明TaWRKY35編碼區(qū)序列非常保守,預(yù)示在小麥生長(zhǎng)發(fā)育中可能具有極其重要的作用。

    2.4 TaWRKY35組織特異性表達(dá)

    TaWRKY35組織特異性表達(dá)模式的分析表明,該基因在小麥發(fā)育的不同時(shí)期、多種組織器官中均有表達(dá)。其中在幼苗根基中表達(dá)量最高,約為葉片中表達(dá)量的26倍;其次為幼芽根基,約為苗期葉片中表達(dá)量的21倍;接下來(lái)依次為孕穗期莖節(jié)、孕穗期穗、芽期根、孕穗期根、苗期根、胚芽、孕穗期葉片、苗期葉片(圖2)。

    2.5 逆境脅迫誘導(dǎo)下TaWRKY35的表達(dá)模式

    在ABA、NaCl、PEG和低溫脅迫條件下,小麥幼苗TaWRKY35的表達(dá)量均顯著上升,表明TaWRKY35參與對(duì)4種逆境脅迫的應(yīng)答。在外源ABA誘導(dǎo)下,TaWRKY35表達(dá)模式呈波浪形,在1.5 h達(dá)到一個(gè)初級(jí)峰值,約為對(duì)照的8倍,而后逐漸降低,12 h時(shí)表達(dá)量降至最低,隨后又逐步回升,48 h達(dá)到最大值(約為對(duì)照的13倍),表明TaWRKY35可能在ABA信號(hào)通路中起作用(圖3-A)。TaWRKY35對(duì)低溫脅迫比較敏感,低溫處理1 h即達(dá)到最大值,隨后急劇下降(圖3-B)。NaCl脅迫下,TaWRKY35的表達(dá)在24 h時(shí)達(dá)到高峰,約為對(duì)照的31倍,隨后迅速下降(圖3-C)。在PEG處理6 h時(shí),TaWRKY35表達(dá)量達(dá)到第一個(gè)高峰,約為對(duì)照的4倍,隨后下降,在72 h表達(dá)量最高,約為對(duì)照的5倍(圖3-D),說(shuō)明TaWRKY35受滲透脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。

    Ta:小麥;Hv:大麥;Bd:短柄草;Os:水稻;At:擬南芥;WRKY:WRKY轉(zhuǎn)錄因子。* 代表WRKY結(jié)構(gòu)域中核心序列WRKYGQK所在位置;? 代表鋅指結(jié)構(gòu)中半胱氨酸所在位置;◇ 代表鋅指結(jié)構(gòu)中組氨酸所在位置Ta: Triticum aestivum; Hv: Hordeum vulgare; Bd: Brachypodium distachyon; Os: Oryza sativa; At: Arabidopsis thaliana; WRKY: WRKY-type transcription factor. * indicates the WRKYGQK of WRKY domain; ? indicates the cysteine of zinc finger; ◇ indicates the histidine of zinc finger圖1 幾種植物WRKY序列比對(duì)(A)與系統(tǒng)進(jìn)化分析(B)Fig. 1 Alignment (A) and phylogenetic tree (B) of WRKYs from different plant species

    GR:芽期根;GRB:幼芽根基;GP:胚芽;SR:苗期根;SRB:幼苗根基;SL:苗期葉片;BR:孕穗期根;BN:孕穗期莖節(jié);BL:孕穗期葉片;BE:孕穗期穗。以苗期葉片中的TaWRKY35表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)。數(shù)據(jù)為3次獨(dú)立試驗(yàn)的平均值 ± SEGR: Germination stage root; GRB: Germination stage root base; GP: Germ; SR: Seeding stage root; SRB: Seeding stage root base; SL: Seeding stage leaf blade;BR: Booting stage root; BN: Booting stage node; BL: Booting stage leaf; BE: Booting stage ear. The expression level of TaWRKY35 in seedling leaf (SL) is assigned a value of 1. Values are the mean ± SE of three biological replicates圖2 TaWRKY35在小麥不同發(fā)育時(shí)期的組織特異性表達(dá)Fig. 2 Dynamic expression of TaWRKY35 in multi-tissue at different stages of wheat

    2.6 TaWRKY35亞細(xì)胞定位

    生物信息學(xué)預(yù)測(cè)TaWRKY35定位在細(xì)胞核上。用激光共聚焦顯微鏡觀察小麥原生質(zhì)體,發(fā)現(xiàn)TaWRKY35::GFP只在細(xì)胞核上有熒光信號(hào),而細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中無(wú)GFP信號(hào)(圖4),表明TaWRKY35特異定位在細(xì)胞核上。

    圖3 脅迫條件下小麥幼苗TaWRKY35的表達(dá)模式Fig. 3 Expression patterns of TaWRKY35 in wheat seedlings under different treatments

    圖4 TaWRKY35特異定位在小麥細(xì)胞核中Fig. 4 TaWRKY35 specifically locates in the nucleus in wheat

    2.7 過(guò)表達(dá)TaWRKY35能提高擬南芥的耐鹽性

    根據(jù)轉(zhuǎn)基因株系中TaWRKY35表達(dá)水平,選取表達(dá)量相對(duì)較高的3個(gè)株系L-2、L-4和L-5分析基因功能(圖5)。將在MS固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)7 d的轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥幼苗移至含有250 mmol·L-1NaCl的MS固體培養(yǎng)基上,培養(yǎng)7 d,部分幼苗子葉開始變白(圖6-A)。

    以轉(zhuǎn)基因擬南芥株系L-1的表達(dá)量作為內(nèi)參;數(shù)據(jù)為3次獨(dú)立試驗(yàn)的平均值 ± SEThe lowest expression of TaWRKY35 in transgenic Arabidopsis line L-1 was regarded as standard. Data represent means ± SE of three replicates圖5 TaWRKY35在5個(gè)轉(zhuǎn)基因擬南芥株系中的表達(dá)水平Fig. 5 Expression levels of TaWRKY35 in five transgenic Arabidopsis lines

    將種在篩盤中的擬南芥幼苗用200 mmol·L-1NaCl溶液處理7 d,野生型植株葉片明顯黃化,而轉(zhuǎn)基因株系的葉片僅略微黃化;鹽處理21 d,近55%的野生型植株死亡,而轉(zhuǎn)基因株系的存活率為70%—75%。為進(jìn)一步驗(yàn)證 TaWRKY35過(guò)表達(dá)能增強(qiáng)擬南芥的耐鹽性,在土壤中進(jìn)行了耐鹽性鑒定試驗(yàn),結(jié)果和培養(yǎng)皿上的存活率統(tǒng)計(jì)結(jié)果基本吻合,如圖6-B所示??紤]到土壤中的鑒定更接近自然條件下鹽脅迫的實(shí)際情況,故此處使用了土壤中存活率統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

    細(xì)胞膜穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果表明,TaWRKY35過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系細(xì)胞膜穩(wěn)定性顯著高于野生型對(duì)照(圖6-C)。

    A:NaCl處理7 d的擬南芥表型;B:NaCl處理的擬南芥存活率比較;C:NaCl處理的細(xì)胞膜穩(wěn)定性(CMS)比較,數(shù)據(jù)為3次獨(dú)立試驗(yàn)的平均值 ±SE;* 表示轉(zhuǎn)基因株系與野生型在0.05概率水平有顯著差異(t-檢驗(yàn))。WT:擬南芥野生型;L-2、L-4和L-5:3個(gè)TaWRKY35過(guò)表達(dá)擬南芥株系A(chǔ): Arabidopsis seedlings treated with NaCl for 7 days; B: Plant survival rates in soil saturated with NaCl solution; C: Comparison of seedling cell membrane stability (CMS) of Arabidopsis seedlings treated with NaCl for 7 days. Values are the mean ± SE of three biological replicates. * indicates significant difference between the transgenic lines and WT at 0.05 probability level (t-test). Values are the mean ± SE of three biological replicates. WT: Wild type; L-2, L-4 and L-5:Three individual TaWRKY35 transgenic lines圖6 TaWRKY35過(guò)量表達(dá)能提高擬南芥的耐鹽性Fig. 6 Overexpression of TaWRKY35 confers enhanced tolerance to salt stress in Arabidopsis

    3 討論

    植物基因的時(shí)空表達(dá)是其參與不同生命過(guò)程的直接反映。在不同逆境脅迫條件下,基因的功能不同,其表達(dá)模式也千差萬(wàn)別,調(diào)節(jié)基因通常在逆境脅迫的早期表達(dá),而功能基因的表達(dá)則相對(duì)滯后[25]。本研究發(fā)現(xiàn)TaWRKY35受ABA、PEG、NaCl和低溫等多種逆境脅迫誘導(dǎo)表達(dá),同時(shí)不同逆境脅迫條件下基因的表達(dá)模式差異顯著,說(shuō)明該基因參與對(duì)多種逆境脅迫的應(yīng)答,暗示TaWRKY35在不同逆境應(yīng)答途徑中參與的調(diào)節(jié)機(jī)制可能不同。

    蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的定位一定程度上反映了其行使功能的部位。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果表明 TaWRKY35可能定位在細(xì)胞核中,亞細(xì)胞定位結(jié)果進(jìn)一步證明TaWRKY35-GFP融合蛋白僅出現(xiàn)在細(xì)胞核中,該結(jié)果與已發(fā)表的一些 WRKY轉(zhuǎn)錄因子的亞細(xì)胞定位結(jié)果一致[26],同時(shí)也與TaWRKY35作為轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控基因的表達(dá)相吻合。

    在正常生長(zhǎng)條件下,TaWRKY35過(guò)表達(dá)擬南芥和野生型對(duì)照在表型上沒(méi)有差異,但在鹽脅迫條件下,轉(zhuǎn)基因擬南芥子葉白化率顯著低于對(duì)照(圖 6-A),同時(shí)幼苗存活率顯著高于野生型(圖 6-C)。細(xì)胞膜穩(wěn)定性是衡量植物抗逆性強(qiáng)弱的重要指標(biāo),在高鹽條件下植物細(xì)胞膜透性通常會(huì)增加,但耐鹽植物質(zhì)膜透性變化較小,因此,細(xì)胞膜穩(wěn)定性較高,而鹽敏感植物則正好相反。本研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的細(xì)胞膜穩(wěn)定性顯著高于野生型對(duì)照(圖 6-B),進(jìn)一步證明TaWRKY35提高了擬南芥的耐鹽性。在增強(qiáng)植物的耐鹽性方面,TaWRKY35與之前報(bào)道的 BcWRKY46、TaWRKY2、TaWRKY19、TaWRKY44和 HvWRKY38的功能相似[20,22,27-29]。

    實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明,在ABA、PEG脅迫條件下TaWRKY35表達(dá)量顯著升高。在表型分析時(shí),在MS培養(yǎng)基上對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型分別進(jìn)行了ABA(60 μmol·L-1)和甘露醇(200 mmol·L-1)脅迫處理,發(fā)現(xiàn)野生型和轉(zhuǎn)基因株系的表型差異不明顯,這可能與TaWRKY35在信號(hào)調(diào)節(jié)通路中的作用有關(guān),這一現(xiàn)象與GmWRKY21、GmWRKY54轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)的表型類似[16]。比較TaWRKY35在不同逆境脅迫下的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)其在鹽脅迫下表達(dá)量最高,該結(jié)果與其過(guò)表達(dá)提高植物的耐鹽性吻合。

    近期人們對(duì) WRKY轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)、功能以及在其調(diào)控脅迫應(yīng)答反應(yīng)、信號(hào)分子傳遞、植物衰老以及器官發(fā)育等一系列生理活動(dòng)過(guò)程進(jìn)行了大量的研究,然而對(duì)WRKY轉(zhuǎn)錄因子所介導(dǎo)的植物應(yīng)答反應(yīng)及基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究較少,未來(lái)應(yīng)將更多的精力聚焦于解析WRKY在抗逆調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的作用。

    4 結(jié)論

    從小麥品種旱選10號(hào)中克隆到WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因TaWRKY35。TaWRKY35的N端含有典型的WRKY結(jié)構(gòu)域,C端含有 C2HC型鋅指結(jié)構(gòu),屬于WRKY家族的亞家族Ⅲ,定位于細(xì)胞核中。TaWRKY35在小麥幼苗根基部位表達(dá)量最高,其次為幼芽根基部,同時(shí)TaWRKY35受ABA、低溫、高鹽和PEG-6000誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá);過(guò)表達(dá)TaWRKY35能顯著提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性。

    References

    [1] SUZUKI N, RIVERO R M, SHULAEV V, BLUMWALD E,MITTLER R. Abiotic and biotic stress combinations. New Phytologist,2014, 203: 32-43.

    [2] MICKELBART M V, HASEGAWA P M, BAILEY-SERRES J. Genetic mechanisms of abiotic stress tolerance that translate to crop yield stability. Nature Reviews Genetics, 2015, 16: 237-251.

    [3] ISHIGURO S, NAKAMURA K. Characterization of a cDNA encoding a novel DNA-binding protein, SPF1, that recognizes SP8 sequences in the 5' upstream regions of genes coding for sporamin and beta-amylase from sweet potato. Molecular and General Genetics,1994, 244: 563-571.

    [4] EULGEM T, RUSHTON P J, ROBATZEK S, SOMSSICH I E. The WRKY superfamily of plant transcription factors. Trends in Plant Science, 2000, 5: 199-206.

    [5] MAEO K, HAYASHI S, KOJIMA-SUZUKI H, MORIKAMI A,NAKAMURA K. Role of conserved residues of the WRKY domain in the DNA-binding of tobacco WRKY family proteins. Bioscience,Biotechnology, and Biochemistry, 2001, 65: 2428-2436.

    [6] WU K L, GUO Z J, WANG H H, LI J. The WRKY family of transcription factors in rice and Arabidopsis and their origins. DNA Research, 2005, 12: 9-26.

    [7] CIOLKOWSKI I, WANKE D, BIRKENBIHL R P, SOMSSICH I E. Studies on DNA-binding selectivity of WRKY transcription factors lend structural clues into WRKY-domain function. Plant Molecular Biology, 2008, 68: 81-92.

    [8] RUSHTON P J, SOMSSICH I E, RINGLER P, SHEN Q J. WRKYtranscription factors. Trends in Plant Science, 2010, 15: 247-258.

    [9] RUSHTON D L, TRIPATHI P, RABARA R C, LIN J, RINGLER P,BOKEN A K, LANGUM T J, SMIDT L, BOOMSMA D D, EMME N J, CHEN X, FINER J J, SHEN Q J, RUSHTON P J. WRKY transcription factors: Key components in abscisic acid signalling. Plant Biotechnology Journal, 2012, 10: 2-11.

    [10] LI C, Lü J, ZHAO X, AI X, ZHU X, WANG M, ZHAO S, XIA G. TaCHP: A wheat zinc finger protein gene down-regulated by abscisic acid and salinity stress plays a positive role in stress tolerance. Plant Physiology, 2010, 154: 211-221.

    [11] LI H, XU Y, XIAO Y, ZHU Z, XIE X, ZHAO H, WANG Y. Expression and functional analysis of two genes encoding transcription factors, VpWRKY1 and VpWRKY2, isolated from Chinese wild Vitis pseudoreticulata. Planta, 2010, 232: 1325-1337.

    [12] JIANG Y, DEYHOLOS M K. Functional characterization of Arabidopsis NaCl-inducible WRKY25 and WRKY33 transcription factors in abiotic stresses. Plant Molecular Biology, 2009, 69: 91-105.

    [13] LI S, FU Q, CHEN L, HUANG W, YU D. Arabidopsis thaliana WRKY25, WRKY26, and WRKY33 coordinate induction of plant thermotolerance. Planta, 2011, 233: 1237-1252.

    [14] LI S, FU Q, HUANG W, YU D. Functional analysis of an Arabidopsis transcription factor WRKY25 in heat stress. Plant Cell Reports, 2009,28: 683-693.

    [15] SUN J, HU W, ZHOU R, WANG L, WANG X, WANG Q, FENG Z,LI Y, QIU D, HE G, YANG G. The Brachypodium distachyon BdWRKY36 gene confers tolerance to drought stress in transgenic tobacco plants. Plant Cell Reports, 2015, 34: 23-35.

    [16] ZHOU Q Y, TIAN A G, ZOU H F, XIE Z M, LEI G, HUANG J,WANG C M, WANG H W, ZHANG J S, CHEN S Y. Soybean WRKY-type transcription factor genes, GmWRKY13, GmWRKY21,and GmWRKY54, confer differential tolerance to abiotic stresses in transgenic Arabidopsis plants. Plant Biotechnology Journal, 2008, 6:486-503.

    [17] WU X, SHIROTO Y, KISHITANI S, ITO Y, TORIYAMA K. Enhanced heat and drought tolerance in transgenic rice seedlings overexpressing OsWRKY11 under the control of HSP101 promoter. Plant Cell Reports, 2009, 28: 21-30.

    [18] RAINERI J, WANG S, PELEG Z, BLUMWALD E, CHAN R L. The rice transcription factor OsWRKY47 is a positive regulator of the response to water deficit stress. Plant Molecular Biology, 2015, 88:401-413.

    [19] OKAY S, DERELLI E, UNVER T. Transcriptome-wide identification of bread wheat WRKY transcription factors in response to drought stress. Molecular Genetics and Genomics, 2014, 289: 765-781.

    [20] WANG X, ZENG J, LI Y, RONG X, SUN J, SUN T, LI M, WANG L,F(xiàn)ENG Y, CHAI R, CHEN M, CHANG J, LI K, YANG G, HE G. Expression of TaWRKY44, a wheat WRKY gene, in transgenic tobacco confers multiple abiotic stress tolerances. Frontiers in Plant Science,2015, 6: 615.

    [21] WANG C, DENG P, CHEN L, WANG X, MA H, HU W, YAO N,F(xiàn)ENG Y, CHAI R, YANG G, HE G. A wheat WRKY transcription factor TaWRKY10 confers tolerance to multiple abiotic stresses in transgenic tobacco. PLoS One, 2013, 8: e65120.

    [22] NIU C F, WEI W, ZHOU Q Y, TIAN A G, HAO Y J, ZHANG W K,MA B, LIN Q, ZHANG Z B, ZHANG J S, CHEN S Y. Wheat WRKY genes TaWRKY2 and TaWRKY19 regulate abiotic stress tolerance in transgenic Arabidopsis plants. Plant Cell and Environment, 2012, 35:1156-1170.

    [23] QIN Y, TIAN Y, LIU X. A wheat salinity-induced WRKY transcription factor TaWRKY93 confers multiple abiotic stress tolerance in Arabidopsis thaliana. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2015, 464: 428-433.

    [24] LIVAK K J, SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T))Method. Methods, 2001, 25: 402-408.

    [25] PANDEY S P, SOMSSICH I E. The role of WRKY transcription factors in plant immunity. Plant Physiology, 2009, 150: 1648-1655.

    [26] ZOU C, JIANG W, YU D. Male gametophyte-specific WRKY34 transcription factor mediates cold sensitivity of mature pollen in Arabidopsis. Journal of Experimental Botany, 2010, 61: 3901-3914.

    [27] WANG F, HOU X, TANG J, WANG Z, WANG S, JIANG F, LI Y. A novel cold-inducible gene from Pak-choi (Brassica campestris ssp. chinensis), BcWRKY46, enhances the cold, salt and dehydration stress tolerance in transgenic tobacco. Molecular Biology Reports, 2012, 39:4553-4564.

    [28] XIONG X, JAMES V A, ZHANG H, ALTPETER F. Constitutive expression of the barley HvWRKY38 transcription factor enhances drought tolerance in turf and forage grass (Paspalum notatum Flugge). Molecular Breeding, 2009, 25: 419-432.

    [29] XU Y, HU W, LIU J, ZHANG J, JIA C, MIAO H, XU B, JIN Z. A banana aquaporin gene, MaPIP1;1, is involved in tolerance to drought and salt stresses. BMC Plant Biology, 2014, 14: 59.

    (責(zé)任編輯 李莉)

    Cloning and Characterization of Transcription Factor TaWRKY35 in Wheat (Triticum aestivum)

    LIU Zi-cheng1, 2, MIAO Li-li2, WANG Jing-yi2, YANG De-long1, MAO Xin-guo1,2, JING Rui-lian2
    (1College of Life Science and Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070;2Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences/National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement/Key Laboratory of Crop Germplasm and Utilization, Ministry of Agriculture, Beijing 100081)

    Abstract:【Objective】Abiotic stresses are major limitations to wheat production worldwide. Transcription factors play crucialroles in abiotic stress signaling in plants. It is predicted that there are at least 200 WRKY genes in common wheat genomes, yet only a few of them have been functionally characterized. The aim of this study is to decipher the roles of WRKY transcription factors in abiotic stress signaling and facilitate the utilization of WRKY genes in the improvement of abiotic stress tolerance in wheat. 【Method】A wheat WRKY gene designated TaWRKY35 was cloned via the wheat full-length cDNA libraries. Quantitative real-time PCR was performed to identify the dynamic expression of target gene in different tissues at various developmental stages, and to characterize the transcriptional patterns responding to ABA, PEG, NaCl and low temperature treatments in wheat. To probe the subcellular location of TaWRKY35, the construct encoding TaWRYK35::GFP fusion protein was transferred into wheat protoplast by PEG mediated method. To characterize the function of TaWRYK35, target gene driven by the 35S promoter was delivered into Arabidopsis by Agrobacterium mediated method. 【Result】The cDNA of TaWRYK35 contains an 1 134 bp open reading frame,encoding a 377- amino acid protein. TaWRYK35 possesses a typical WRKY domain in the N-terminal and a C2HC type zinc finger domain in the C-terminal, belonging to group III of WRKY family. In 32 hexaploid wheat materials of highly polymorphic,TaWRKY35 coding region sequence is very conservative. The dynamic expression of TaWRKY35 was identified in different tissues at various developmental stages, and the highest expression occurred in the root base of seedling, while the lowest expression was observed in seedling leaf. Furthermore, its transcript was inducible by ABA, PEG, NaCl and low temperature treatments, yet the expression patterns to difference stress varied significantly. Subcellular localization indicated that TaWRKY35 specifically located in the nucleus. Overexpression of TaWRKY35 resulted in enhanced tolerance to high salinity, supported by improved cell membrane stability and survival rate relative to wild type Arabidopsis. 【Conclusion】TaWRKY35 transcription factor contains a WRKY and a C2HC type zinc finger domain, belonging to subgroup III of the WRKY family. The expression of TaWRKY35 occurs in different tissues at various developmental stages, and TaWRKY35 is an abiotic stress responsive gene. Overexpression of TaWRKY35 confers remarkably enhanced tolerance to high salinity.

    Key words:wheat; WRKY transcription factor gene; abiotic stress; salt tolerance

    收稿日期:2016-03-04;接受日期:2016-04-15

    基金項(xiàng)目:國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(“863”計(jì)劃)(2011AA100501)、北京市自然科學(xué)基金(BJNSF6132030)

    猜你喜歡
    非生物脅迫耐鹽性小麥
    主產(chǎn)區(qū)小麥?zhǔn)召?gòu)進(jìn)度過(guò)七成
    孔令讓的“小麥育種夢(mèng)”
    金橋(2021年10期)2021-11-05 07:23:28
    葉面施肥實(shí)現(xiàn)小麥畝增產(chǎn)83.8千克
    哭娃小麥
    郁金香耐鹽性鑒定方法研究
    白木香轉(zhuǎn)錄因子AsMYB1和AsMYB2克隆及表達(dá)分析
    源于大麥小孢子突變體的苗期耐鹽性研究
    非生物脅迫對(duì)擬南芥IQM4基因表達(dá)的影響
    科技視界(2016年16期)2016-06-29 11:55:38
    三個(gè)大豆品種萌發(fā)期和苗期的耐鹽性比較
    水稻富亮氨酸類受體蛋白激酶參與外界脅迫應(yīng)答的研究進(jìn)展
    国产av国产精品国产| 国产亚洲精品久久久久5区| 亚洲成人免费av在线播放| 曰老女人黄片| 亚洲成人手机| 9色porny在线观看| 多毛熟女@视频| 国产成人av教育| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 这个男人来自地球电影免费观看| www.999成人在线观看| 久热这里只有精品99| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 亚洲伊人色综图| 国产爽快片一区二区三区| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 久久天堂一区二区三区四区| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 精品人妻1区二区| 另类精品久久| 美女国产高潮福利片在线看| 9191精品国产免费久久| 热99国产精品久久久久久7| 99九九在线精品视频| 国产高清videossex| 国产男女内射视频| 国产男女内射视频| 日韩av免费高清视频| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 亚洲欧洲国产日韩| 免费观看a级毛片全部| 国产有黄有色有爽视频| 大香蕉久久网| 国产免费现黄频在线看| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 日韩欧美一区视频在线观看| 韩国精品一区二区三区| 免费看av在线观看网站| 韩国高清视频一区二区三区| 日韩 亚洲 欧美在线| 人妻人人澡人人爽人人| 中文字幕av电影在线播放| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 亚洲一码二码三码区别大吗| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 国产三级黄色录像| 国产三级黄色录像| 国产熟女欧美一区二区| 欧美人与善性xxx| 国产三级黄色录像| 亚洲人成77777在线视频| 美女高潮到喷水免费观看| 国产在线视频一区二区| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 18禁国产床啪视频网站| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 久久鲁丝午夜福利片| 岛国毛片在线播放| 亚洲中文av在线| 老司机影院毛片| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 90打野战视频偷拍视频| 午夜福利在线免费观看网站| 满18在线观看网站| 成年美女黄网站色视频大全免费| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 亚洲九九香蕉| 久久精品国产亚洲av高清一级| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 成人免费观看视频高清| 久久精品人人爽人人爽视色| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 岛国毛片在线播放| 最近中文字幕2019免费版| 国产男女超爽视频在线观看| 黑丝袜美女国产一区| 国产高清不卡午夜福利| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 免费观看人在逋| 美女大奶头黄色视频| 一区二区三区精品91| 后天国语完整版免费观看| 国产精品一国产av| 国产精品一国产av| 1024视频免费在线观看| 这个男人来自地球电影免费观看| 母亲3免费完整高清在线观看| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 亚洲av电影在线进入| 日本黄色日本黄色录像| 99精国产麻豆久久婷婷| 99国产综合亚洲精品| 亚洲国产日韩一区二区| 国产又色又爽无遮挡免| 欧美激情 高清一区二区三区| 熟女av电影| 日本黄色日本黄色录像| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 国产不卡av网站在线观看| 尾随美女入室| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 美女中出高潮动态图| 人妻 亚洲 视频| 久久久精品免费免费高清| 久久亚洲精品不卡| 男女床上黄色一级片免费看| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产在线视频一区二区| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 久久久欧美国产精品| 宅男免费午夜| 欧美黄色片欧美黄色片| 91精品三级在线观看| 五月开心婷婷网| 精品久久久久久久毛片微露脸 | 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 十八禁人妻一区二区| 国产黄色免费在线视频| 中文欧美无线码| 成年人黄色毛片网站| 成年人黄色毛片网站| 国产成人91sexporn| 久久久久国产一级毛片高清牌| 国产一区亚洲一区在线观看| 成人三级做爰电影| 国产男女内射视频| 亚洲欧洲日产国产| 国产激情久久老熟女| 中文字幕人妻熟女乱码| 欧美日韩一级在线毛片| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 国产激情久久老熟女| 国产男女内射视频| 精品第一国产精品| 啦啦啦在线免费观看视频4| 咕卡用的链子| 日本欧美国产在线视频| 一二三四在线观看免费中文在| 一级黄片播放器| 国产精品久久久久久精品古装| 不卡av一区二区三区| 91九色精品人成在线观看| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 九色亚洲精品在线播放| 一二三四在线观看免费中文在| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 性色av乱码一区二区三区2| 母亲3免费完整高清在线观看| 亚洲天堂av无毛| 欧美黄色淫秽网站| 一边亲一边摸免费视频| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 中文字幕精品免费在线观看视频| 黄色视频在线播放观看不卡| 国产黄色视频一区二区在线观看| 久久人人爽人人片av| 免费在线观看影片大全网站 | 久久亚洲精品不卡| 亚洲第一青青草原| 最近中文字幕2019免费版| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 国产熟女午夜一区二区三区| 日本vs欧美在线观看视频| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 大码成人一级视频| 欧美久久黑人一区二区| 美女福利国产在线| 99热全是精品| 新久久久久国产一级毛片| 一二三四社区在线视频社区8| 国产精品av久久久久免费| 久久免费观看电影| 免费在线观看黄色视频的| 最新在线观看一区二区三区 | 久久久国产一区二区| 啦啦啦在线观看免费高清www| 国产高清国产精品国产三级| 久久精品国产综合久久久| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 亚洲精品国产一区二区精华液| 国产av国产精品国产| 曰老女人黄片| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 亚洲欧美色中文字幕在线| 久久av网站| 黑丝袜美女国产一区| 免费人妻精品一区二区三区视频| 国产一区二区在线观看av| 国产人伦9x9x在线观看| 亚洲国产最新在线播放| 亚洲精品第二区| 久久狼人影院| 成人亚洲精品一区在线观看| 母亲3免费完整高清在线观看| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 久久久国产一区二区| 国产av国产精品国产| 九色亚洲精品在线播放| 国产野战对白在线观看| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 99国产精品一区二区蜜桃av | 久久精品成人免费网站| 日韩伦理黄色片| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 99久久99久久久精品蜜桃| 在线观看www视频免费| 精品人妻一区二区三区麻豆| 国产一卡二卡三卡精品| 久久人妻福利社区极品人妻图片 | 久久国产精品影院| 丝袜喷水一区| 国产一区二区激情短视频 | 免费高清在线观看日韩| 免费人妻精品一区二区三区视频| 成人三级做爰电影| 欧美乱码精品一区二区三区| 国产精品国产三级国产专区5o| tube8黄色片| 老汉色av国产亚洲站长工具| 日韩av在线免费看完整版不卡| 免费不卡黄色视频| 黄色a级毛片大全视频| 丰满少妇做爰视频| 啦啦啦啦在线视频资源| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 午夜福利免费观看在线| 婷婷色麻豆天堂久久| 各种免费的搞黄视频| 国产av国产精品国产| 亚洲专区国产一区二区| 欧美av亚洲av综合av国产av| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | av又黄又爽大尺度在线免费看| 日日爽夜夜爽网站| 一级a爱视频在线免费观看| 91成人精品电影| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 日韩人妻精品一区2区三区| 亚洲国产av影院在线观看| 丰满迷人的少妇在线观看| 一本综合久久免费| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 男人操女人黄网站| 少妇人妻久久综合中文| 久久青草综合色| 高清欧美精品videossex| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 免费看av在线观看网站| 午夜免费男女啪啪视频观看| 国产免费福利视频在线观看| 十八禁人妻一区二区| 欧美少妇被猛烈插入视频| 校园人妻丝袜中文字幕| 超碰97精品在线观看| 赤兔流量卡办理| 国产精品一区二区在线观看99| 婷婷色麻豆天堂久久| 午夜激情久久久久久久| 亚洲国产欧美网| 999精品在线视频| 国产又色又爽无遮挡免| 日本a在线网址| 日本vs欧美在线观看视频| 久久国产亚洲av麻豆专区| 亚洲精品国产区一区二| 久久亚洲精品不卡| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 国产成人欧美在线观看 | 丁香六月欧美| 一区二区三区激情视频| 免费黄频网站在线观看国产| 亚洲成人国产一区在线观看 | 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 777米奇影视久久| 9191精品国产免费久久| 欧美亚洲日本最大视频资源| 宅男免费午夜| 久久久亚洲精品成人影院| 亚洲精品乱久久久久久| 亚洲欧美一区二区三区久久| av线在线观看网站| 90打野战视频偷拍视频| 久久av网站| 日韩一本色道免费dvd| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 亚洲国产av影院在线观看| 校园人妻丝袜中文字幕| 亚洲专区国产一区二区| 国产日韩欧美在线精品| 免费观看av网站的网址| 少妇人妻 视频| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 国产精品一区二区精品视频观看| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 久久人妻福利社区极品人妻图片 | 久久久精品区二区三区| 亚洲精品一二三| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 啦啦啦在线观看免费高清www| av电影中文网址| 中文字幕制服av| 成年人免费黄色播放视频| 后天国语完整版免费观看| 久久国产精品人妻蜜桃| 亚洲熟女毛片儿| 国产午夜精品一二区理论片| cao死你这个sao货| 亚洲综合色网址| 亚洲 欧美一区二区三区| 日韩 亚洲 欧美在线| 久久亚洲精品不卡| 在线观看免费日韩欧美大片| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 日韩精品免费视频一区二区三区| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 飞空精品影院首页| 99re6热这里在线精品视频| 男人操女人黄网站| 欧美久久黑人一区二区| 亚洲欧美激情在线| 赤兔流量卡办理| 一级,二级,三级黄色视频| 国产成人啪精品午夜网站| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 久久久国产欧美日韩av| 国产免费现黄频在线看| 国产成人av教育| 美女福利国产在线| 亚洲精品中文字幕在线视频| 18禁国产床啪视频网站| 婷婷色麻豆天堂久久| 国产精品一区二区免费欧美 | 一级黄色大片毛片| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 国产成人精品无人区| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 亚洲av美国av| 美女大奶头黄色视频| 中国国产av一级| 亚洲专区中文字幕在线| 老汉色av国产亚洲站长工具| 中文欧美无线码| 高清不卡的av网站| 成人国产一区最新在线观看 | 中文字幕最新亚洲高清| 韩国高清视频一区二区三区| 国产伦理片在线播放av一区| 一区在线观看完整版| 精品高清国产在线一区| 男人舔女人的私密视频| 免费高清在线观看日韩| 国产97色在线日韩免费| e午夜精品久久久久久久| 黑人欧美特级aaaaaa片| 国产黄色视频一区二区在线观看| 在线观看免费视频网站a站| 日韩av在线免费看完整版不卡| av一本久久久久| 九色亚洲精品在线播放| 欧美黄色片欧美黄色片| 亚洲天堂av无毛| 国精品久久久久久国模美| 999久久久国产精品视频| 岛国毛片在线播放| bbb黄色大片| 久久综合国产亚洲精品| 欧美日韩亚洲高清精品| 成人亚洲精品一区在线观看| 首页视频小说图片口味搜索 | 欧美日本中文国产一区发布| 99热国产这里只有精品6| 啦啦啦在线免费观看视频4| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 女人久久www免费人成看片| 国产97色在线日韩免费| 丰满少妇做爰视频| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 亚洲黑人精品在线| 久久午夜综合久久蜜桃| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 一级黄片播放器| 欧美黑人欧美精品刺激| 国产熟女午夜一区二区三区| 精品少妇内射三级| av在线app专区| 交换朋友夫妻互换小说| 精品欧美一区二区三区在线| 国产亚洲av高清不卡| 亚洲av美国av| bbb黄色大片| 老司机亚洲免费影院| 久久久精品免费免费高清| 十八禁人妻一区二区| 色播在线永久视频| 91成人精品电影| 亚洲精品自拍成人| 中文字幕最新亚洲高清| 美女视频免费永久观看网站| 国产欧美日韩精品亚洲av| 久久这里只有精品19| av不卡在线播放| 国产又色又爽无遮挡免| 亚洲精品自拍成人| 黄色a级毛片大全视频| 99久久人妻综合| 人成视频在线观看免费观看| 亚洲精品国产一区二区精华液| 妹子高潮喷水视频| 欧美日本中文国产一区发布| 两人在一起打扑克的视频| 老司机影院成人| 亚洲男人天堂网一区| 精品国产一区二区久久| 手机成人av网站| avwww免费| 日本色播在线视频| 又黄又粗又硬又大视频| 久热这里只有精品99| 日本色播在线视频| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 成人午夜精彩视频在线观看| 中文欧美无线码| 2021少妇久久久久久久久久久| 宅男免费午夜| 人人妻人人澡人人看| 99九九在线精品视频| 美女午夜性视频免费| 亚洲av国产av综合av卡| 啦啦啦在线免费观看视频4| 亚洲第一av免费看| 视频在线观看一区二区三区| 亚洲色图综合在线观看| 亚洲欧洲国产日韩| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 午夜日韩欧美国产| 欧美黑人精品巨大| 在线观看免费午夜福利视频| 老司机亚洲免费影院| 宅男免费午夜| 久久久久国产一级毛片高清牌| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 麻豆av在线久日| 国产老妇伦熟女老妇高清| 国产午夜精品一二区理论片| 欧美黄色淫秽网站| 亚洲专区中文字幕在线| 伊人亚洲综合成人网| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产免费又黄又爽又色| 国产国语露脸激情在线看| a级毛片黄视频| 久久久久精品人妻al黑| 午夜激情久久久久久久| 亚洲精品中文字幕在线视频| 国产亚洲精品久久久久5区| 久久热在线av| av在线老鸭窝| 欧美精品一区二区免费开放| 不卡av一区二区三区| 免费在线观看完整版高清| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 在线观看www视频免费| 国产熟女欧美一区二区| 青青草视频在线视频观看| av在线老鸭窝| 婷婷色麻豆天堂久久| 婷婷色综合www| 亚洲av美国av| 亚洲综合色网址| 纯流量卡能插随身wifi吗| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 国产av国产精品国产| 欧美黑人精品巨大| 亚洲欧洲国产日韩| 久久久精品区二区三区| 精品国产乱码久久久久久男人| 国产片内射在线| 97在线人人人人妻| 久久性视频一级片| 中文字幕亚洲精品专区| 免费观看av网站的网址| 欧美乱码精品一区二区三区| 在线天堂中文资源库| 黄色怎么调成土黄色| 午夜福利视频在线观看免费| 亚洲国产av影院在线观看| 午夜视频精品福利| 波多野结衣一区麻豆| 欧美成人午夜精品| 一级,二级,三级黄色视频| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 深夜精品福利| 亚洲国产精品一区三区| 尾随美女入室| 精品第一国产精品| 亚洲,欧美,日韩| 亚洲情色 制服丝袜| 1024香蕉在线观看| 久久久久精品国产欧美久久久 | 美女中出高潮动态图| 麻豆国产av国片精品| 久久久久久免费高清国产稀缺| 国产色视频综合| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 久久久久久久久久久久大奶| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 美女扒开内裤让男人捅视频| 精品亚洲成a人片在线观看| 成人手机av| 亚洲欧美一区二区三区国产| 黄频高清免费视频| av国产精品久久久久影院| 亚洲视频免费观看视频| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 成年av动漫网址| 日本av免费视频播放| 国产在视频线精品| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 老司机影院成人| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 国产精品一区二区在线不卡| 丝袜喷水一区| 国产成人一区二区三区免费视频网站 | 一区二区三区四区激情视频| 亚洲视频免费观看视频| xxx大片免费视频| tube8黄色片| 亚洲欧洲国产日韩| 久久久久久人人人人人| 久久久久久久久久久久大奶| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 女性生殖器流出的白浆| 久久综合国产亚洲精品| 久久天堂一区二区三区四区| 色综合欧美亚洲国产小说| 亚洲少妇的诱惑av| 一区二区av电影网| 国产成人欧美| 伊人亚洲综合成人网| 老司机深夜福利视频在线观看 | 免费在线观看完整版高清| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 美女午夜性视频免费| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 99久久人妻综合| 国产成人一区二区三区免费视频网站 | 亚洲自偷自拍图片 自拍| 夫妻性生交免费视频一级片| 午夜免费鲁丝| 高清视频免费观看一区二区| www.熟女人妻精品国产| 久久久精品免费免费高清| 国产男人的电影天堂91| 极品少妇高潮喷水抽搐| bbb黄色大片| 男人舔女人的私密视频| av福利片在线| 亚洲专区中文字幕在线| 婷婷色综合大香蕉| 久久人人爽人人片av| 麻豆av在线久日| 亚洲精品第二区| 国产精品 国内视频| 手机成人av网站| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 欧美人与性动交α欧美软件| 99精国产麻豆久久婷婷| 日日夜夜操网爽| 国产一区二区三区综合在线观看| 国产精品一区二区在线不卡| 午夜免费男女啪啪视频观看| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 最黄视频免费看| 国产爽快片一区二区三区| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 老汉色∧v一级毛片| 久久精品亚洲av国产电影网| 亚洲五月色婷婷综合| 免费高清在线观看视频在线观看| 97精品久久久久久久久久精品| 亚洲精品自拍成人| 亚洲专区国产一区二区| 一级片免费观看大全| 九色亚洲精品在线播放| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 一级黄片播放器| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 秋霞在线观看毛片| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 亚洲成人免费电影在线观看 | 99国产精品一区二区三区| 51午夜福利影视在线观看| 国产成人免费无遮挡视频| 一二三四社区在线视频社区8| 看免费av毛片| www.av在线官网国产| 国产成人a∨麻豆精品| 国产一区二区激情短视频 | 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 欧美激情 高清一区二区三区| 中文字幕最新亚洲高清| 亚洲av美国av| 午夜免费鲁丝| 国产免费现黄频在线看| 9191精品国产免费久久| 丝袜美腿诱惑在线| 色婷婷久久久亚洲欧美| 国产精品 国内视频| 日韩一区二区三区影片| 汤姆久久久久久久影院中文字幕|