響應面法優(yōu)化魷魚皮酶解工藝研究

鐘　機， 金　紅， 孫　鶴， 李惠芳， 陳麗嬌

(福建農(nóng)林大學食品科學學院，福建 福州 350002)

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響應面法優(yōu)化魷魚皮酶解工藝研究

鐘機， 金紅， 孫鶴， 李惠芳， 陳麗嬌

(福建農(nóng)林大學食品科學學院，福建 福州 350002)

摘要：為研究木瓜蛋白酶酶解魷魚皮的最佳酶解條件，通過單因素試驗研究了酶添加量、酶解時間和酶解溫度對魷魚皮水解度的影響。結(jié)果顯示，3個因素對魷魚皮水解度均有不同程度的影響。在單因素試驗的基礎上，以水解度為響應值，酶添加量、酶解時間和酶解溫度為自變量，采用Box-Benhnken響應面法設計3因素3水平優(yōu)化試驗，通過響應面分析，建立了二次多項數(shù)學模型對酶解條件進行優(yōu)化，獲得木瓜蛋白酶酶解魷魚皮的最佳條件：酶添加量4 560 U/g，酶解時間3.2 h和酶解溫度50 ℃。在該條件下木瓜蛋白酶酶解魷魚皮的水解度可達15.53%，與模型預測值基本一致。研究表明，通過響應面法獲得的數(shù)學預測模型能較好地預測木瓜蛋白酶酶解魷魚皮的效果，試驗結(jié)果為魷魚加工副產(chǎn)物高值化利用提供了參考。

關鍵詞：魷魚皮；水解度；酶解；響應面

魷魚(squid)是柔魚、槍烏賊的俗稱，屬于軟體動物門(Mollusca)、頭足綱(Cephalopo-da)[1]。隨著遠洋捕撈技術的發(fā)展，近年來魷魚產(chǎn)量取得了巨大的增長。魷魚在加工過程中會產(chǎn)生大約35%的廢棄物，包括頭、內(nèi)臟、皮、鰭、墨汁等，其中魷魚皮占了約8%～13%[2]。魷魚皮雖然作為加工廢棄物，但卻有極大的營養(yǎng)價值。據(jù)報道，魷魚皮中含有豐富的氨基酸、脂肪酸和礦物元素等，其中必需氨基酸占總氨基酸的30.97%，二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)占全部脂肪酸的50.44%[3]；魷魚皮魚油中DHA占35.93%，EPA占14.93%，具有較高的營養(yǎng)價值[4]。

酶工程技術的發(fā)展和應用，為魷魚皮等廢棄物的綜合利用提供了新的加工途徑。目前在水解動物蛋白研究中常用的商業(yè)蛋白酶有胃蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶等。相關研究成果包括：采用醋酸和胃蛋白酶相結(jié)合的方式提取秘魯魷魚皮中的膠原蛋白[5]；采用胃蛋白酶制備魷魚皮明膠[6]；采用中性蛋白酶和復合蛋白酶對魷魚皮酶解[7]；采用堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶分步水解魷魚皮制備膠原蛋白肽[8]；魷魚皮明膠水解物對血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)的抑制活性及其降血壓作用[9]；選擇堿性蛋白酶作為水解用酶制備魷魚皮明膠肽[10]?？梢婔滛~皮蛋白酶解產(chǎn)物中具有特定的生理功能特性，具有廣闊的應用前景。

在酶解過程中，蛋白酶的選擇對酶解液的質(zhì)量起著至關重要的作用。木瓜蛋白酶因具有原料豐富、價格低廉、熱穩(wěn)定性好等特點而具有較高的性價比，更加適合用于規(guī)模化工業(yè)生產(chǎn)。因此，為了研究木瓜蛋白酶酶解魷魚皮的最佳條件，本文以水解度為指標，通過響應面法對酶解條件進行優(yōu)化試驗，進而獲得最佳酶解條件，為水產(chǎn)品加工企業(yè)提高資源的綜合利用率提供理論參考。

1材料與方法

1.1材料、試劑與儀器設備

魷魚皮(近海魷魚，捕撈于福建閩東漁場)由福建坤興海洋生物有限公司提供；木瓜蛋白酶購于Solarbio公司；甲醛、鹽酸、氫氧化鈉、硫酸等試劑均為分析純。

儀器設備：K9840自動凱氏定氮儀(濟南海能儀器股份有限公司)；Anke GL-20G-Ⅱ離心機(上海安亭科學儀器廠)；DK-S24電熱恒溫水浴鍋(上海精宏試驗設備有限公司)；BS 224S型電子分析天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)；PB-10型pH計(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)；SZF-06G 粗脂肪測定儀(上海新家儀器有限公司)。

1.2試驗方法

1.2.1魷魚皮基本成分測定

將魷魚皮清洗去雜后剪碎(約1×1 cm)，再采用組織搗碎機處理2 min。魷魚皮中粗蛋白、粗脂肪、水分和灰分均采用常規(guī)方法測定[11]。

1.2.2魷魚皮酶解單因素試驗

以水解度為指標，在其他因素固定不變的前提下，分別考察酶添加量(3 000、3 500、4 000、4 500、5 000 U/g)、酶解時間(1.5、2、2.5、3、3.5 h)和酶解溫度(35、40、45、50、55 ℃)對魷魚皮水解度的影響。酶解結(jié)束后于95 ℃水浴鍋中滅酶10 min，冷卻至室溫后離心(5 000 r/min)20 min，取上清液測水解度。進行3次平行試驗，結(jié)果取其平均值。

1.2.3響應面法優(yōu)化魷魚皮酶解工藝條件

為得到木瓜蛋白酶酶解魷魚皮的最佳酶解條件，根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以水解度為響應值，以酶添加量、酶解時間和酶解溫度為自變量，采用Design-Expert 8.0軟件對酶解條件進行優(yōu)化試驗設計及結(jié)果分析。試驗因素水平編碼如表1所示。

表1　響應面試驗因素水平表

1.2.4水解度測定

水解度(DH)測定公式：

式中：C1—未水解時原料中的氨基態(tài)氮含量，g/100 mL；C2—酶解上清液氨基態(tài)氮含量，g/100 mL；C3—魷魚皮中總氮含量，g/100 g。氨氮含量參考文獻[12]的測定方法，總氮含量采用凱氏定氮法測定。

2結(jié)果與分析

2.1魷魚皮基本組成

通過對魷魚皮基本組成成分的測定可知，粗蛋白含量為13.58%±0.03%，粗脂肪含量僅為1.56%±0.11%。林燕等[13]測得阿根廷魷魚皮的粗蛋白含量為14.54%±0.02%，粗脂肪含量為2.90%±0.17%；管嬌雪等[3]測得秘魯魷魚皮的粗蛋白含量為11.52%±0.35%，粗脂肪含量為0.73%±0.03%。魷魚品種及捕撈海域的不同是造成魷魚皮基本營養(yǎng)成分差異的主要原因。從整體上可以看出，魷魚皮是一種高蛋白低脂肪的加工副產(chǎn)物，具有極廣的利用前景。

2.2單因素試驗

2.2.1酶添加量對水解度的影響

在料液比為1∶3、酶解溫度45 ℃、酶解時間3 h和自然pH條件下，考察酶添加量對水解度的影響，結(jié)果如圖1所示。酶添加量對水解度的影響極顯著(P<0.01)。當酶添加量為4 500 U/g時，水解度基本達到最大值，繼續(xù)增加酶量對水解度的影響不顯著(P>0.05)。這可能是當酶量添加到一定程度時，一方面底物已經(jīng)基本被酶解完畢，另一方面酶濃度過高會使蛋白酶產(chǎn)生相互抑制作用，從而使酶解效率下降[14-15]。相關研究表明，當水解度達到一定程度時，并不會因為酶添加量的繼續(xù)增加而出現(xiàn)顯著變化[16]。對復合蛋白酶酶解魷魚皮條件優(yōu)化表明，在一定條件下，當酶添加量為14 000 U/g時,水解度達20.7%，雖水解度較高，但其酶用量較多，不利于成本控制[13]。根據(jù)試驗結(jié)果，選擇4 500 U/g為最適酶添加量。

2.2.2酶解時間對水解度的影響

在料液比為1∶3，酶解溫度45 ℃，酶添加量為4 500 U/g，自然pH條件下，研究酶解時間對水解度的影響，結(jié)果如圖2所示。酶解時間對水解度的影響極顯著(P<0.01)，酶解至3 h時水解度達最大的13.8%。出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因可能是在酶解3 h后，蛋白酶作用已經(jīng)基本完全發(fā)揮，并且在酶解過程中產(chǎn)生的多肽也會作為底物參與酶解反應[17-18]，進而降低酶解效率。劉振峰等[8]在一定條件下先用0.3%堿性蛋白酶酶解4 h，接著再用0.2%木瓜蛋白酶酶解2 h，最終使得魷魚皮膠原蛋白肽水解度達24.32%。不同的蛋白酶切位點不同，將多種蛋白酶配合使用，能起到較好的酶解效果，但該方法酶解時間較長，分步酶解也增加了實際操作過程中的不穩(wěn)定性。根據(jù)試驗結(jié)果，選擇3 h為最適酶解時間。

圖1　酶添加量對水解度的影響Fig.1　Effect of enzyme additive amount ondegree of hydrolysis

圖2　酶解時間對水解度的影響Fig.2　Effect of hydrolysis time on degree of hydrolysis

2.2.3酶解溫度對水解度的影響

在料液比為1∶3、酶添加量為4 500 U/g、酶解時間3 h和自然pH條件下，研究酶解溫度對水解度的影響，結(jié)果如圖3所示。酶解溫度對水解度的影響極顯著(P<0.01)，呈先上升后下降的趨勢。當酶解溫度為50 ℃時水解度達14.5%，繼續(xù)升高溫度，水解度呈下降趨勢。原因可能是隨著溫度的升高，酶的活性逐漸升高，從而水解度升高；當溫度過高時，蛋白酶結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而使酶解效率下降[19-20]。因此，根據(jù)試驗結(jié)果，選擇50 ℃為最適酶解溫度。

圖3　酶解溫度對水解度的影響Fig.3　Effect of hydrolysis temperature ondegree of hydrolysis

2.3響應面優(yōu)化試驗

2.3.1響應面試驗設計及結(jié)果分析

響應面試驗設計及結(jié)果見表2。利用Design-Expert8.0軟件對試驗結(jié)果進行分析，得到以水解度為響應值的回歸方程：

Y=15.50+0.95A+0.84B+0.21C-0.22AB-0.53AC-0.15BC-3.35A2-1.37B2-1.38C2

經(jīng)分析，由該回歸方程得到木瓜蛋白酶酶魷魚皮的最佳酶解條件為：酶添加量4 564.37 U/g，酶解時間3.15 h，酶解溫度50.18 ℃，水解度預測值為15.687 5%。

表2　響應面試驗設計及結(jié)果

回歸模型方差分析結(jié)果見表3。由表3可知，該回歸模型極顯著(P< 0.000 1)；失擬項P=0.065 3>0.05，相關系數(shù)R2=0.993 8，說明該模型相關性較好，對實驗的擬合度較高，表明可用該模型對水解度進行預測和分析。

由顯著性分析可知，酶添加量和酶解時間對水解度的影響極顯著，酶解溫度對水解度的影響不顯著；通過各因素間的交互作用可知，酶添加量和酶解溫度的交互作用對水解度的影響極顯著，其余交互作用不顯著；各因素的二次項對水解度的影響均為極顯著。再由表中F值可以看出，各因素對水解度影響的主次順序為A>B>C，即酶添加量>酶解時間>酶解溫度。

表3　回歸模型方差分析表

注：*表示差異極顯著(P<0.01)。

2.3.2響應面分析

圖4為各因素交互作用對水解度影響的響應曲面圖和等高線圖。圖中響應曲面越陡，說明該因素對響應值的影響越顯著；由等高線圖可知兩因素交互作用對響應值的影響程度[21]。對比圖4a～圖4c各曲面的陡峭程度可知，酶添加量對水解度的影響最大，其次是酶解時間，酶解溫度的影響最小。再由等高線圖可知，圖4b的等高線呈橢圓形，即酶添加量和酶解溫度的交互作用對水解度的影響顯著；圖4a和圖4c的等高線呈圓形，即交互作用對水解度的影響不顯著，這與方差分析的結(jié)果一致。

2.4驗證試驗

為驗證該模型回歸方程的可靠性，對該模型預測得到的最佳酶解條件進行驗證試驗?？紤]實際可操作性，對最優(yōu)酶解條件進行略微調(diào)整：酶添加量4 560 U/g，酶解時間3.2 h，酶解溫度50 ℃，進行3次平行試驗，結(jié)果取其平均值，最終測得水解度為15.53%，與模型預測水解度誤差為1.0%，與預測值基本一致，說明該模型能較好地預測水解度。

3結(jié)論

試驗以魷魚皮為研究對象，木瓜蛋白酶為試驗用酶，通過單因素試驗研究了酶添加量、酶解時間和酶解溫度對水解度的影響；在單因素試驗的基礎上，采用Box-Benhnken 響應面法優(yōu)化木瓜蛋白酶酶解魷魚皮的工藝參數(shù)，建立了關于水解度的預測模型。結(jié)果表明，各因素對水解度的影響依次為：酶添加量>酶解時間>酶解溫度；酶添加量和酶解溫度的交互作用對水解度有顯著影響；木瓜蛋白酶酶解魷魚皮的最佳酶解工藝為：酶添加量4 560 U/g，酶解時間3.2 h，酶解溫度50 ℃，在該條件下測得水解度為15.53%，與模型預測值基本一致。

a 酶添加量與酶解時間的交互作用

b 酶添加量與酶解溫度的交互作用

c 酶解時間與酶解溫度的交互作用圖4　各因素相互作用響應面與等高線圖Fig.4　Response surface and contour plots showing the interactive effects of various factors on DH

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Optimization of hydrolysis conditions of squid skin by response surface methodology

ZHONG Ji， JIN Hong， SUN He， LI Huifang， CHEN Lijiao

(CollegeofFoodScience,FujianAgricultureandForestryUniversity,FujianFuzhou350002,China)

Abstract：To optimize the hydrolysis conditions of squid skin by papain, the effects of the papain dosage, hydrolysis time and hydrolysis temperature on the degree of hydrolysis (DH) were studied by single factor experiment. The results showed that all the three factors exerted certain influences on the DH. Then the Box-Benhnken response surface methods were performed, taking the dosage of protease, contact time and hydrolysis temperature as independent variables to the DH for its optimal response value. Through the response surface analysis, a quadratic polynomial mathematical model was established to optimize the hydrolysis conditions, and the optimal hydrolysis conditions were obtained as follows：dosage of protease should be 4560 U/g, hydrolysis time 3.2 h and hydrolysis temperature 50 ℃. Under these optimal conditions, the DH could reach up to 15.53%, which was basically consist with the predicted value by the model. The research shows that, the mathematical model obtained through response surface method can rather precisely predict the hydrolysis effect of papain for squid skin, and the research results provide reference for improving the utilization rate of by-products from squid processing.

Key words：squid skin; degree of hydrolysis; hydrolysis; response surface method

DOI：10.3969/j.issn.1007-9580.2016.03.010

收稿日期：2016-03-24修回日期：2016-05-19

基金項目：福建省福建農(nóng)林大學高水平大學建設項目“海洋動物蛋白的深加工(61201404320)”

作者簡介：鐘機(1990—)，男，碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工技術。E-mail：zhongjilb@163.com 通信作者：陳麗嬌(1962—)，女，教授，碩士生導師，研究方向：水產(chǎn)品精深加工及綜合利用。E-mail：chenlijao@126.com

中圖分類號：TS254.4

文獻標志碼：A

文章編號：1007-9580(2016)03-049-06