新型Ⅰ型普魯蘭酶基因的克隆表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)*

王青艷，申乃坤，朱　婧，秦　艷，朱綺霞，謝能中，李　億，黃日波

(廣西科學(xué)院,國(guó)家非糧生物質(zhì)能源工程技術(shù)研究中心，非糧生物質(zhì)酶解國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西生物煉制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧　530007)

新型Ⅰ型普魯蘭酶基因的克隆表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)*

王青艷，申乃坤，朱婧，秦艷，朱綺霞，謝能中，李億，黃日波**

(廣西科學(xué)院,國(guó)家非糧生物質(zhì)能源工程技術(shù)研究中心，非糧生物質(zhì)酶解國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西生物煉制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530007)

摘要：【目的】篩選并克隆表達(dá)高酶活且具有一定熱穩(wěn)定性的新型普魯蘭酶?！痉椒ā靠寺umebacillus flagellatus GST4的普魯蘭酶基因pulB，構(gòu)建重組質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化宿主菌大腸桿菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，再運(yùn)用親和層析進(jìn)行純化并分析其酶學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)?！窘Y(jié)果】pulB在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)，發(fā)酵液上清酶活力達(dá)到78 U/mL，粗酶液經(jīng)純化后比活力為258 U/mg。重組酶PulB最適反應(yīng)溫度和pH值分別為55℃和5.0，在較窄的酸性范圍內(nèi)(pH值4.5～5.5)酶活力比較穩(wěn)定；對(duì)普魯蘭糖的Km=(16.28±0.03)mg/mL，Vmax=(22.05±0.02)μmol·min-1·mg-1。PulB的DNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)里的任何序列都沒(méi)有同源性，在蛋白質(zhì)序列上，由基因pulB編碼的氨基酸序列與T.aegyptius的環(huán)麥芽糖糊精酶相似性最高，BlastX比對(duì)的Identities為54%，Positives為69%，SMART結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，pulB具有淀粉酶的結(jié)構(gòu)域。底物特異性分析表明，它可水解普魯蘭糖和支鏈淀粉生成線性的低聚糖或麥芽三糖?！窘Y(jié)論】重組酶PulB是尚未報(bào)道的新型普魯蘭酶，它可水解普魯蘭糖和支鏈淀粉，屬Ⅰ型普魯蘭酶。

關(guān)鍵詞：Ⅰ型普魯蘭酶膨脹芽孢桿菌克隆表達(dá)酶學(xué)性質(zhì)

0引言

【研究意義】普魯蘭酶(Pullulanase,EC 3.2.1.41)是α-淀粉酶家族GH13中的一種脫支酶，它能夠?qū)Ｒ恍缘乃馄蒸斕m、淀粉和糖原中的α-1,6-糖苷鍵[1]。自然界中的淀粉大多為支鏈淀粉[2]，其中α-1,6-糖苷鍵占4%～5%。普魯蘭酶能分解支鏈的特性決定了它在淀粉加工業(yè)中的廣泛應(yīng)用，比如：在淀粉水解過(guò)程中專一性切開(kāi)支鏈淀粉分支點(diǎn)中的α-1,6-糖苷鍵，從而剪下整個(gè)側(cè)枝形成直鏈淀粉，后者具有很好的抗水性和成膜性，有望用于生產(chǎn)可食性包裝膜，解決“白色污染”問(wèn)題；Ⅰ型普魯蘭酶能夠與α-淀粉酶、β-淀粉酶等協(xié)同作用生產(chǎn)高葡萄糖漿、超高麥芽糖漿、提高啤酒中的發(fā)酵度；普魯蘭酶和α-淀粉酶以及糖化酶協(xié)同作用，可在以非糧木薯為原料生產(chǎn)酒精的液化和糖化過(guò)程發(fā)揮作用，普魯蘭酶要求的底物分子結(jié)構(gòu)最小，它可以將最小單位的支鏈分解，最大限度地利用淀粉原料，加速糖化過(guò)程，從而有效的提高淀粉利用率和水解效率[3]。除此之外，采用普魯蘭酶將各類(lèi)淀粉脫支后再糊化老化處理可增加抗消化淀粉的含量，后者對(duì)人體血糖水平、肥胖、癌癥、脂質(zhì)代謝和能量等方面有重要生理功能[4]。而目前工業(yè)應(yīng)用上的挑戰(zhàn)是能否找到滿足低成本高產(chǎn)、且酶學(xué)性質(zhì)(如耐酸、耐熱)符合工業(yè)應(yīng)用要求的普魯蘭酶。因此，通過(guò)篩選高產(chǎn)菌株、克隆異源表達(dá)以及突變普魯蘭酶基因等方式，獲得所需的普魯蘭酶，具有重要的應(yīng)用研究意義。【前人研究進(jìn)展】普魯蘭酶最初是由Bender和Wallenefls于1966年通過(guò)產(chǎn)氣桿菌(Aeorbaetere aerogenes)發(fā)酵獲得[5]。此后，各國(guó)的科研人員經(jīng)過(guò)廣泛深入研究，從不同的地區(qū)微生物中獲得該酶。1975年日本的Yoshiyuki Takaskai[6]發(fā)現(xiàn)蠟狀芽抱桿菌覃狀變種(Bacillus cereus Var.mycodes)能產(chǎn)普魯蘭酶，該酶的最佳作用條件為pH值6.0～6.5，溫度50℃。20世紀(jì)80年代初，丹麥Novo公司以嗜酸性分解普魯蘭多糖芽孢桿菌(Bacillus acidopullulyticus)[7]研發(fā)出耐熱(60℃)耐酸(pH值4.5)的商品普魯蘭酶Pormozyme，是目前應(yīng)用最廣且產(chǎn)量最大的普魯蘭酶。20世紀(jì)90年代，Deweer等[8]發(fā)現(xiàn)普魯蘭酶產(chǎn)生菌Bacillus naganoensis；Tomimura等[9]篩選出Bacillus deramificans，這兩株菌與B.acidopullulyticus所產(chǎn)普魯蘭酶的酶學(xué)性質(zhì)相似，其發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步拓寬了普魯蘭酶的應(yīng)用。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，利用其構(gòu)建基因工程菌，以提高目的蛋白的產(chǎn)量并減少下游工藝的成本，這在世界范圍內(nèi)越來(lái)越廣泛地得到重視并加以應(yīng)用。1984年，日本科學(xué)家在大腸桿菌中成功表達(dá)Klebsiella aerogenes普魯蘭酶基因，但酶活力水平不高且在非選擇性培養(yǎng)基中表現(xiàn)型極不穩(wěn)定。1985年，Takiazwa把普魯蘭酶基因(包括結(jié)構(gòu)基因和操縱基因)克隆入多拷貝載體pBR322，得到比野生菌株酶活力水平高20～40倍的工程菌，此工程菌能保持高酶活力水平兩周。上述這些酶大部分都是不能分泌到胞外的胞內(nèi)酶。1999年，Tomimura從Bacillus naganoensis (ATCC53909)中分離出普魯蘭酶基因，并在原核生物表達(dá)系統(tǒng)枯草芽抱桿菌中成功表達(dá)，所產(chǎn)生的重組普魯蘭酶具有很好的應(yīng)用特性[10]。該酶在60℃時(shí)測(cè)得最適反應(yīng)pH值為5.0，在pH值為4.5條件下測(cè)得最適反應(yīng)溫度為60℃；在pH值4.5，60℃保溫55 h仍有50%的殘余酶活力，具有較好的熱穩(wěn)定性。此后，特別是進(jìn)入20世紀(jì)90年代后，相繼有許多耐熱普魯蘭酶基因被克隆、測(cè)序并在大腸桿菌和枯草桿菌中表達(dá)，有的還申請(qǐng)專利保護(hù)[10-11]。目前已有數(shù)十個(gè)普魯蘭酶基因在以大腸桿菌為主的表達(dá)系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)。通過(guò)基因工程手段表達(dá)并提高普魯蘭酶產(chǎn)量是普魯蘭酶基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究的主要發(fā)展方向。另外，淀粉加工時(shí)通常采取55～60℃的反應(yīng)溫度，這就對(duì)普魯蘭酶在該溫度下的物理化學(xué)穩(wěn)定性提出較高的要求?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】雖然基因工程技術(shù)使得普魯蘭酶的異源表達(dá)研究取得了一些成績(jī)，但總體來(lái)說(shuō)表達(dá)水平不高。我國(guó)從20世紀(jì)70年代開(kāi)始便研究開(kāi)發(fā)普魯蘭酶，但是到目前仍然僅限于實(shí)驗(yàn)室研究并且酶活力較低[12-13]，一般為2～5 U/mL，這些酶的產(chǎn)生菌株大多為病原菌，其發(fā)酵液不能直接用于工業(yè)添加，特別是食品工業(yè)，因此普魯蘭酶基因的重組表達(dá)至關(guān)重要?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究采用Novagen公司的pET表達(dá)系統(tǒng)異源表達(dá)T.flagellates GST4普魯蘭酶基因，并進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析。通過(guò)異源可溶性表達(dá)提高酶的產(chǎn)量，獲得新的Ⅰ型普魯蘭酶并初步探討其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。

1材料與方法

1.1菌株和質(zhì)粒

菌株T.flagellates GST4為本實(shí)驗(yàn)室從位于南寧的木薯淀粉廢水中篩選所得[14]，大腸桿菌E.coli DH5α(本實(shí)驗(yàn)室保存)用于常規(guī)的克隆和質(zhì)粒繁殖宿主，大腸桿菌E.coli BL21(DE3)(Stratagene)為表達(dá)宿主。pET-22b(+)(Novagen)是具有氨芐抗性、N端信號(hào)肽pelB和C端6-His 標(biāo)簽的表達(dá)載體，pMD-18T(TaKaRa)為T(mén)-載體。

1.2試劑

Prime START聚合酶、rTaq DNA聚合酶、各種限制性內(nèi)切酶、dNTPs、T4 DNA連接酶、小牛腸性磷酸酶(CIP)、DNA連接試劑盒、DNA Maker DL2000、λ/HindⅢ DNA Marker和蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記均購(gòu)自TaKaRa公司，蛋白酶K、RNA酶A和DMSO 購(gòu)自Fermentas公司，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒小量提試劑盒和凝膠回收試劑購(gòu)自北京天根公司，鎳填充料Chelating Sepharose購(gòu)自Amersham Biosciences公司，Sephadex G200購(gòu)自Pharmacia公司，Bradford蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Generay，蛋白質(zhì)電泳預(yù)制膠購(gòu)自Bio-rad，咪唑購(gòu)自上海生工生物工程有限公司，普魯蘭糖、可溶性淀粉和支鏈淀粉等購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，引物合成和測(cè)序均由上海生物工程公司完成。

1.3培養(yǎng)條件

挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，37℃，220 r/min搖床振蕩培養(yǎng)過(guò)夜活化，用接種環(huán)在固體平板劃線，固體平板倒置于37℃恒溫箱培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單菌落于新鮮的LB液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)約12 h后，按1%(V/V)的接種量接種于新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，220 r/min培養(yǎng)約3～4 h后，加入IPTG使其終濃度為0.5 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)12～16 h，收集菌液。

1.4總DNA和質(zhì)粒的提取

新鮮平板上挑取單菌落接入液體培養(yǎng)基,過(guò)夜培養(yǎng)，收集菌體細(xì)胞用于總DNA和質(zhì)粒DNA提取，提取方法參照文獻(xiàn)[15]。

1.5表達(dá)載體的構(gòu)建

1.5.1pulB的克隆和基因序列分析

根據(jù)已經(jīng)測(cè)序T.flagellatus GST4基因組的注釋為假設(shè)普魯蘭酶的基因序列設(shè)計(jì)引物，所用的上下游引物(下劃線分別為引入的酶切位點(diǎn)BamHⅠ和HindⅢ)序列為

pulB-F：5′-CGCGGATCCCAATCAGGAAG-CTATTTTTCA-3′；

pulB-R:5′-ACCAAGCTTCACCGTTCCGCCGCTCA-3′。

以T.flagellatus GST4的總DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為50 μL反應(yīng)液中含有5×PS PCR緩沖液10 μL，dNTPs 200 μmol/L，總DNA模板10 ng，引物各3.2 pmol，PrimeSTAR DNA聚合酶5 U。擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性2 min；98℃ 10 s，53.6℃ 15 s，72℃ 2 min，共30個(gè)循環(huán)延伸；72℃，10 min。

擴(kuò)增成功后用OMEGA公司Extraction Kit 純化普魯蘭酶基因，pulB回收的片段一部分經(jīng)TA克隆之后與T載體pMD18-T連接，獲得pMD-pulB用于測(cè)序；另一部分作下一步的雙酶切。

基因pulB的序列用megablast (highly similar sequences) 軟件檢索GenBank核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)[16]；用BlastX軟件檢索GenBank氨基酸數(shù)據(jù)庫(kù)；用在線SMART(Simple Modular Architecture Research Tool，http://smart.embl.heidelberg.de)工具分析預(yù)測(cè)該基因編碼蛋白質(zhì)序列的組件結(jié)構(gòu)和功能域[17]。

1.5.2pulB與載體的酶切、連接和轉(zhuǎn)化

DNA片段與載體的酶切、連接和轉(zhuǎn)化參照文獻(xiàn)[15]，將PCR擴(kuò)增得到的pulB目的片段用BamHⅠ/HindⅢ雙酶切，與經(jīng)同樣雙酶切的質(zhì)粒載體pET-22b(+)的大片段混合，用連接酶于16℃連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化宿主大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α，冰上放置30 min，42℃水浴熱擊90 s，加入600 μL經(jīng)42℃預(yù)熱的SOC培養(yǎng)基，于37℃，200 r/min預(yù)培養(yǎng)30 min，取適量涂布于含氨芐抗性的LB平板，37℃恒溫箱倒置培養(yǎng)過(guò)夜。轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒后用BamHⅠ/HindⅢ進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，同時(shí)以轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒為模板，用原擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證。

1.6重組質(zhì)粒pET-pulB的誘導(dǎo)表達(dá)和純化

1.6.1誘導(dǎo)表達(dá)

將重組質(zhì)粒pET-pulB轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑取轉(zhuǎn)化子用含合適氨芐的LB液體培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)12 h，按1%(V/V)的接種量轉(zhuǎn)接到50 mL的LB(含100 μg/mL氨芐)培養(yǎng)基中，37℃，220 r/min搖床振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6時(shí)加入IPTG(終濃度為0.5 mmol/L)，在25℃，220 r/min繼續(xù)培養(yǎng)14 h，離心收集上清，上清裝入透析袋，外敷PEG6000置于4℃冰箱中進(jìn)行透析濃縮，至透析袋中的液體量剩余約為10 mL時(shí)轉(zhuǎn)入干凈的50 mL離心管，4℃，8 500 r/min離心10 min，所得上清液即為粗酶液。

1.6.2重組酶的純化

通過(guò)重組酶C端的6-His標(biāo)簽與鎳離子的螯合進(jìn)行純化[18]，純化過(guò)程盡量在較低溫(4～10℃)下進(jìn)行。金屬鰲合物的親和層析-鎳(IMAC)柱含5 mL 柱床體積的螯合瓊脂糖凝膠(FF)介質(zhì)，介質(zhì)經(jīng)NiCl2裝載平衡后用超純水洗滌，用25 mL平衡緩沖液(300 mmol/L NaCl，5～10 mmol/L咪唑，50 mmol/L pH值為7.4磷酸緩沖液)平衡柱子，粗酶液調(diào)節(jié)至與平衡緩沖液相同的pH值后上柱，再依次用25 mL咪唑濃度分別為20 mmol/L和60 mmol/L的平衡緩沖液洗滌雜蛋白，目的蛋白用25 mL 咪唑濃度為250 mmol/L 的平衡緩沖液洗脫，收集含目的蛋白質(zhì)的洗脫液，用截留分子量為30 000 Da的Millipore超濾離心管進(jìn)行緩沖液置換，所得的純酶溶解在pH值為5.0的50～100 mmol/L磷酸鈉-檸檬酸緩沖液中，并加入終濃度為10%(V/V)的甘油做保護(hù)劑，用于進(jìn)行SDS-PAGE分析、酶活力測(cè)定和酶學(xué)性質(zhì)分析。

1.7蛋白質(zhì)含量檢測(cè)

蛋白質(zhì)含量測(cè)定參照Bradford法[19]進(jìn)行，采用BRADFORD蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定樣品蛋白濃度，以牛血清蛋白(BSA)為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定OD595處的吸光值。具體方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.8SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳

取20 μL菌液/酶液于2 mL EP管，加入等體積的上樣緩沖液，100℃水浴10 min，12 000 r/min離心5 min，取上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳，蛋白質(zhì)電泳采用金斯瑞ExpressPlusTM預(yù)制膠(分離膠濃度10%(V/V)，濃縮膠5%(V/V)，電泳儀/槽使用Bio-Rad-PROTEAN(II/3/Tetra System)Hoefer Mighty Small(SE250/SE)，電泳條件：電壓120 V，起始電流75～100 mA，結(jié)束電流30～50 mA,時(shí)間1.0 h，電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)染色，洗脫后觀察。

1.9重組酶活力測(cè)定和酶學(xué)性質(zhì)分析

1.9.1酶活力測(cè)定

采用3,5-二硝基水楊酸法(DNS法)，反應(yīng)體系及方法：取適當(dāng)稀釋的酶液100 μL，添加至400 μL醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH值為4.8，含質(zhì)量體積比為1%的普魯蘭糖)中，55℃條件下反應(yīng)10 min，加入500 μL DNS終止反應(yīng)后于沸水浴煮沸5 min，冷卻，用酶標(biāo)儀在540 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)反應(yīng)液的吸光度值。

酶活單位定義：在相應(yīng)條件，每分鐘分解普魯蘭糖所釋放的還原碳水化合物，其還原力即相當(dāng)于1 μmol葡萄糖所需的酶量，用1 U表示。

酶活力計(jì)算公式：酶活力(U/mL)=

N(OD540+0.108)/(6.619×180×10-3)。其中N表示酶液稀釋倍數(shù)；180表示葡萄糖分子量。

普魯蘭酶比活力計(jì)算公式：普魯蘭酶的比活力(U/mg)=普魯蘭酶活力/普魯蘭酶蛋白含量。

1.9.2最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性的測(cè)定

以1%(W/V)普魯蘭糖作為底物，在pH值為6.0條件下，于不同的溫度(35～70℃，梯度為5℃)條件下測(cè)定溫度對(duì)重組酶活力影響，并以最高酶活力計(jì)算各個(gè)溫度下的相對(duì)酶活力，相對(duì)酶活力最高的溫度就是該酶的最適作用溫度。

在pH值為6.0條件下，將酶分別于37℃，42℃，47℃，58℃，62℃，68℃保溫1 h后測(cè)定酶活力，與未經(jīng)處理的酶活力的比值繪制溫度穩(wěn)定性曲線。

1.9.3最適反應(yīng)pH值和pH穩(wěn)定性的測(cè)定

以1%(W/V)普魯蘭糖作為底物，在最適反應(yīng)溫度、pH值為3.6～6.0(每隔0.2個(gè)單位)的磷酸鈉-檸檬緩沖液(50 mmol/L)中測(cè)定重組酶的活力，并以最高酶活力計(jì)算各pH值下的相對(duì)酶活力，相對(duì)酶活力最高的pH值即為該酶的最適作用pH值。

將酶在pH值為3.5～7.0(每隔0.5個(gè)單位)的緩沖液里置37℃水浴條件保溫24 h后測(cè)定重組酶的酶活力，與未經(jīng)處理的酶活力的比值繪制pH穩(wěn)定性曲線。

1.9.4Km和Vmax的測(cè)定

以不同濃度的普魯蘭糖為底物，在最適的反應(yīng)溫度和pH值條件下，測(cè)定普魯蘭酶PulB的酶活力，參考Malle等[20]的方法，利用Lineweaver-Burk作圖法繪制1/V與1/[S]的雙曲線圖，并通過(guò)非線性回歸方程計(jì)算得出重組酶的Km和Vmax的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

1.9.5金屬離子對(duì)酶活力的影響

在最適pH值和最適溫度條件下，PulB在含有1 mmol/L的不同金屬離子(Ba2+、Ca2+、Co2+、Cu2+、Mg2+、Zn2+、Pb2+、Mn2+、Fe2+)的1%(W/V)的普魯蘭糖溶液中作用30 min后，采用DNS法測(cè)定PulB酶活力，以不加金屬離子的酶液作為對(duì)照，從而確定各種金屬離子對(duì)普魯蘭酶活力的影響。

1.9.6底物特異性分析

用50 mmol/L，pH值為5.0的檸檬酸-磷酸鈉緩沖液配制1%(W/V)的普魯蘭糖、支鏈淀粉、α-環(huán)糊精、直鏈淀粉和可溶性淀粉作為底物溶液，在最適反應(yīng)條件下反應(yīng)24 h，然后將反應(yīng)產(chǎn)物100℃水浴10 min滅酶活，進(jìn)行酶活力和HPLC酶水解產(chǎn)物分析。HPLC測(cè)試條件：戴安Utimat3000，自動(dòng)進(jìn)樣器，色譜柱為AminexHPX-87H 300 mm×7.8 mm(有機(jī)酸柱)，流動(dòng)相：5 mmol/L H2SO4，pH值為2.5，柱溫45℃，進(jìn)樣量10 μL，流速0.6 mL/min，示差檢測(cè)器(Shodex)，檢測(cè)器溫度為45℃。

2結(jié)果與分析

2.1普魯蘭酶基因pulB的克隆

以T.flagellatus GST4的總DNA為模板，用pulB-F和pulB-R引物特異地?cái)U(kuò)增出一條大約為1.7 kb的DNA條帶，大小與預(yù)期的pulB基因的編碼區(qū)相符(圖1)。

2.2pulB基因序列分析和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

重組質(zhì)粒pMD-pulB的普魯蘭酶基因測(cè)序結(jié)果表明，其開(kāi)放讀碼框由1 728個(gè)核苷酸組成(附件1)，G+C百分含量為56.4%，可編碼由575個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)的預(yù)計(jì)分子量為66 672 Da，等電點(diǎn)pI為5.25。該基因序列經(jīng)megablast(highly similar sequences) 軟件檢索GenBank核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何同源序列，說(shuō)明pulB基因是一個(gè)尚未報(bào)道過(guò)的基因。

M：DL2000 DNA 分子量標(biāo)記；1～3：pulB擴(kuò)增產(chǎn)物；CK：不加模板的空白對(duì)照

M：DL2000 DNA Marker；1～3：pulB PCR product；CK：PCR without template

圖1pulB DNA片段的PCR產(chǎn)物電泳分析

Fig.1Electrophoresis analysis of pulB PCR product

在蛋白質(zhì)序列上，經(jīng)用BlastX軟件檢索GenBank氨基酸數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)該基因編碼的產(chǎn)物與Thermicanus aegyptius的環(huán)麥芽糖糊精酶的氨基酸序列相似性最高，但也僅有54%的相似性(Identities為54%，Positives為69%)。用SMART工具分析該基因編碼產(chǎn)物的組件結(jié)構(gòu)，自N端的第133～490位氨基酸為家族GH13糖苷鍵水解酶α-淀粉酶功能域(圖2)。

2.3重組質(zhì)粒的驗(yàn)證

如圖3所示，轉(zhuǎn)化子經(jīng)雙酶切后可切出一大一小兩個(gè)片段，小片段與預(yù)期的大小一致。PCR也可擴(kuò)增出同樣大小的目的片段，證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，命名為pET-pulB。

2.4重組酶PulB的表達(dá)和純化

如圖4所示，粗酶液的SDS-PAGE電泳分析顯示，在66 kDa位置處有較明顯蛋白質(zhì)特征條帶出現(xiàn)，該蛋白質(zhì)大小與基因序列推測(cè)所得的理論分子大小相符，初步認(rèn)定該蛋白質(zhì)即為異源表達(dá)的普魯蘭酶PulB。酶活力測(cè)試結(jié)果顯示該重組菌具有普魯蘭酶活力，總酶活力最高可達(dá)78 U/mL。由此可推斷異源表達(dá)成功。

上清經(jīng)Ni-NTA柱進(jìn)行蛋白質(zhì)純化，得到純度在90%以上的蛋白質(zhì)(圖4)。經(jīng)過(guò)酶活力測(cè)定，純化后的酶具有普魯蘭酶活力，比活力為258 U/mg。

圖2pulB的組件結(jié)構(gòu)(紅色代表α-amy的功能域)

Fig.2Modular architecture of pulB(The red mark represents α-amy domain)

M1：DL2000 分子量標(biāo)記；M2：λ/HindⅢ分子量標(biāo)記；CK：以空質(zhì)粒為模板的空白對(duì)照；1～3：重組質(zhì)粒pET-pulB；4～9：雙酶切驗(yàn)證；10～15：PCR驗(yàn)證

M1：DL2000 DNA Marker；M2：λ/HindⅢ DNA Marker;CK：PCR with pET-22b (+) as template;1～3：recombinant plasmid pET-pulB；4～9：pET-pulB digested withBamHⅠ和HindⅢ; 10～15：pulB PCR product

圖3pET-pulB重組質(zhì)粒驗(yàn)證

Fig.3Verification of recombinant plasmid pET-pulB

2.5重組酶PulB的酶學(xué)性質(zhì)

2.5.1最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性

由圖5a可知，55℃時(shí)PulB酶活力達(dá)到最高，以該值作100%的酶活力，則45℃時(shí)PulB相對(duì)酶活力為78%，65℃相對(duì)酶活力超過(guò)15%。PulB在55℃以下均十分穩(wěn)定，保溫4 h后基本保留80%以上的酶活力，但超過(guò)60℃酶失活速度加快，70℃保溫4 h后酶活力基本喪失(圖5b)。

2.5.2最適反應(yīng)pH值和pH穩(wěn)定性

由圖6a可知，重組酶PulB最適作用pH值為5.0，當(dāng)pH值分別為4.6，4.8 和5.4時(shí)，PulB的相對(duì)酶活力分別為最適pH值條件下的5%、25%和75%，即在較低pH值條件下，PulB酶活力下降比較大。由圖6b可知，PulB在pH值為4.5～5.5時(shí)均有很好的穩(wěn)定性，相對(duì)酶活力均保持在60%以上。

M：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記；1：IPTG誘導(dǎo)前的BL21/pET-pulB；2～3：IPTG誘導(dǎo)后的BL21/pET-pulB；4：BL21/pET-22b(+)；5～7：純化的PulB蛋白質(zhì)

M：Protein Marker；1:Before IPTG induction of BL21/pET-pulB;2～3：After IPTG induction of BL21/pET-pulB；4：BL21/pET-22b(+)；5～7：Purificated PulB

圖4PulB蛋白表達(dá)產(chǎn)物和純化蛋白質(zhì)的SDS-PAGE電泳分析

Fig.4SDS-PAGE analysis of PulB expression in BL21 and purificated PulB

圖5PulB的最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性

Fig.5The optimal temperature and thermostability of PulB

圖6PulB的最適反應(yīng)pH值和pH穩(wěn)定性

Fig.6The optimal pH and pH stability of PulB

2.5.3Km和Vmax的測(cè)定

不同來(lái)源的酶由于作用的底物不同，其Km值和Vmax也不一樣，Km大致范圍在10-6到10-1mol/L之間。陸雁[21]從地衣芽孢桿菌中克隆到低溫普魯蘭酶，經(jīng)表達(dá)獲得的重組酶的Km值為14.29 mmol/L，Vmax值為18.08 μmol·min-1·mg-1。秦艷[22]將長(zhǎng)野芽孢桿菌普魯蘭酶基因在大腸桿菌中表達(dá)，獲得的重組酶的Km值為3.84 mg/mL，Vmax值為31.25 μmol·min-1·min-1。本文研究的來(lái)自膨脹芽孢桿菌的重組酶對(duì)普魯蘭糖的Km=(16.28±0.03)mg/mL，Vmax=(22.05±0.02)μmol·min-1·mg-1(圖7)，屬于中等水平，這可能與此野生菌的生存環(huán)境條件溫和，無(wú)極端環(huán)境條件等因素有關(guān)。

2.6金屬離子對(duì)重組酶PulB水解活性的影響

如圖8所示，所有金屬離子對(duì)PulB都沒(méi)有明顯的促進(jìn)作用，Zn2+、Pb2+、Co2+、Cu2+對(duì)酶活力有明顯的抑制作用，其中Cu2+的抑制作用可使酶基本失活，Ba2+對(duì)酶活力的抑制作用則相對(duì)比較小，而Ca2+、Mg2+、K+、Fe2+、Mn2+則對(duì)酶活力幾乎不產(chǎn)生影響。

圖7　PulB的米氏常數(shù)分析

圖8不同金屬離子對(duì)PulB的影響

Fig.8The effect of different metal ions on PulB

2.7重組酶PulB的底物特異性分析

如圖9所示，PulB水解普魯蘭糖產(chǎn)生的三糖產(chǎn)物的色譜峰與麥芽三糖標(biāo)準(zhǔn)品的峰的保留時(shí)間一致，約為8.003 min，表明PulB通過(guò)內(nèi)切方式水解普魯蘭糖，得到的終產(chǎn)物為三糖。由表1可知，PulB能夠水解支鏈淀粉、可溶性淀粉和α-環(huán)糊精，它可水解這些底物中分支鏈中的α-1,6-糖苷鍵，也可以將最小單位的支鏈分解，但不能水解直鏈淀粉，說(shuō)明PulB能特異性水解α-1,6-糖苷鍵，不能作用α-1,4-糖苷鍵。因此，PulB的催化分類(lèi)屬于Ⅰ型普魯蘭酶。

表1重組普魯蘭酶PulB的底物特異性

Table 1Substrate specificity of recombinant pullulanase PulB

底物*Substrate相對(duì)酶活力Relativeactivity(%)比活力Specificactivity(U/mg)普魯蘭糖Pullulan100258.0±0.5可溶性淀粉Solublestarch48125.0±0.4支鏈淀粉Amylopetin57149.5±0.5α環(huán)糊精αcyclodextrins68176.0±0.5直鏈淀粉Amylose--

注：*，以普魯蘭糖為底物測(cè)得的酶活力為100%

Note:*，the activity for pullulan was defined as 100%

圖9PulB水解普魯蘭糖產(chǎn)物的HPLC分析

Fig.9HPLC analysis on the products of pullulan hydrolyzed with PulB

3討論

普魯蘭酶是重要的淀粉水解酶家族成員之一，近年國(guó)外對(duì)普魯蘭酶的研究比較深入，已從普魯蘭酶結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系、普魯蘭酶的定位和分泌機(jī)制、結(jié)構(gòu)指導(dǎo)的普魯蘭酶定點(diǎn)突變等方面進(jìn)行研究[23-24]。國(guó)內(nèi)研究者對(duì)酶分子水平上進(jìn)行改造以獲得酶學(xué)性質(zhì)更優(yōu)的突變酶的研究則比較少，主要是對(duì)產(chǎn)酶菌種的篩選及其基因的克隆和異源表達(dá)。各國(guó)科研人員從來(lái)源于不同地區(qū)和環(huán)境的微生物中獲得普魯蘭酶[25-26]，但許多酶的酶學(xué)性質(zhì)依然不能滿足實(shí)際應(yīng)用的要求，因此需要尋找更多酶學(xué)性質(zhì)更好的產(chǎn)生菌種。

雖然人們已獲得產(chǎn)普魯蘭酶的基因工程菌，但普魯蘭酶表達(dá)水平及其酶學(xué)性質(zhì)仍有不足，且有的重組質(zhì)粒在宿主菌中的穩(wěn)定性不夠理想。因此，今后的研究工作一方面可借助啟動(dòng)子改造、信號(hào)肽選擇、翻譯起始區(qū)優(yōu)化等手段構(gòu)建優(yōu)良重組質(zhì)粒，實(shí)現(xiàn)重組菌普魯蘭酶的高效表達(dá)；另一方面，可以采用定向進(jìn)化等手段對(duì)普魯蘭酶進(jìn)行分子改造，以進(jìn)一步改善其酶學(xué)特性，如提高酶對(duì)底物的親和力、酶的熱穩(wěn)定性和酸堿耐受性等[27-28]。若能通過(guò)上述手段獲得耐高溫耐酸的普魯蘭酶高產(chǎn)重組菌株，將會(huì)對(duì)淀粉加工業(yè)及相關(guān)領(lǐng)域產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。

在工業(yè)應(yīng)用上，酶的耐熱和耐酸性是重要指標(biāo)。本研究普魯蘭酶PulB的最適反應(yīng)溫度為55℃，最適反應(yīng)pH值為5.0，在較窄的酸性pH值范圍內(nèi)(4.5～5.5)較穩(wěn)定，與目前工業(yè)上應(yīng)用的諾維信公司的嗜酸芽孢桿菌普魯蘭酶的性質(zhì)比較接近，這些特點(diǎn)也接近目前淀粉加工的生產(chǎn)條件，但仍需進(jìn)一步改造使其耐酸和耐熱性提高才可滿足應(yīng)用的需要。

4結(jié)論

本研究采用pET系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了T.flagellatus GST4新型普魯蘭酶基因pulB在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)，發(fā)酵液上清酶活力達(dá)到78 U/mL，粗酶液經(jīng)純化后比活力為258 U/mg，比原始菌的酶活力高15倍。其最適反應(yīng)溫度和pH值分別為55℃和5.0，在低于55℃的溫度范圍和較窄的酸性范圍內(nèi)(4.5～5.5)具有良好的穩(wěn)定性，可專一性地水解淀粉和普魯蘭糖中的α-1,6-糖苷鍵，對(duì)普魯蘭糖有較強(qiáng)的底物特異性。酶學(xué)性質(zhì)分析表明，重組普魯蘭酶PulB可用于木薯淀粉生產(chǎn)酒精的水解糖化(作用溫度60℃、pH值為4.5～5.5)過(guò)程，具有一定的工業(yè)化應(yīng)用價(jià)值。

重組普魯蘭酶PulB的DNA序列和GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)里的任何序列都沒(méi)有同源性，是尚未報(bào)道的新型普魯蘭酶，具有較高的創(chuàng)新性和學(xué)術(shù)研究?jī)r(jià)值。通過(guò)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)和SMART分析發(fā)現(xiàn)，PulB具有淀粉酶的結(jié)構(gòu)域，它可水解普魯蘭糖、支鏈淀粉、可溶性淀粉和α-環(huán)糊精等，屬Ⅰ型普魯蘭酶。

參考文獻(xiàn)：

[1]HII S L,TAN J S,LING T C,et al.Pullulanase:Role in starch hydrolysis and potential industrial applications[J].Enzyme Res，2012，2012:921362.

[2]莫莉，韋廷宗，閉海，等. 支鏈淀粉水解酶水解支鏈淀粉的特異氨基酸分析[J].廣西科學(xué)，2015,22(1)：31-36,43.

MO L，WEI T Z，BI H，et al. Analysis of the key amino acid of amylopectin hydrolase on amylopectin hydrolysis[J].Guangxi Sciences，2015,22(1)：31-36,43.

[3]喬宇，丁宏標(biāo)，王海燕，等.普魯蘭酶的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)進(jìn)展，2011，1(3)：189-194.

QIAO Y,DING H B,WANG H Y,et al.Research advances in pullulanase[J].Current Biotechnology，2011，1(3)：189-194.

[4]董桂秀，楊平平，毛朝相，等.普魯蘭酶的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012,40(18)：9874-9877.

DONG G X,YANG P P,MAO C X,et al.Research progress on pullulanase[J].Journal of Anhui Agri Sci，2012,40(18)：9874-9877.

[5]WALLENEFLS K,BENDER H,RACHED J R.Pullulanase from Aerobacter aeorgenes:Production in a cell-bound state.Purification and properties of the enzyme[J].Biochem Biophys Res Commun，1966,22(3):254-261.

[6]YOSHIYUKI TAKASKAI.Purifications and enzymatic properties of α-amylase and pullulanase from Bacillus cereus var myeoides[J].Agr Biol Chem，1976,40(8):1515-1530.

[7]JENSEN B F,NORMAN B E. Bacillus acidopulluly-ticus pullullanase:Application and regulatory aspects for use in the food industry[J].Process Biochem，1984,19:351-369.

[8]DEWEER P,AMORY A.Pullulanase Producing Microgranisms：5817498[P].1998-10-06.

[9]TOMIMURA E,ZEMAN N W,FRANKIEWICZ J R,et al.Description of Bacillus naganoensis sp.nov.[J].Int J Syst Bacteriol，1990,40(2):123-125.

[10]TOMIMURA E.Thermoduric and Aciduric Pullulan-ase Enzyme and Method for its Production：5055403 [P].1991-10-08.

[11]HYUN H H，ZEIKUS J G.General biochemical characterization of thermostable pullulanase and glucoamylase from Clostridium thermohydrosulfuricum[J].Appl Environ Microbiol，1985，49(5)：1168-1173.

[12]韓鵬，周鵬，閆巧娟，等.嗜熱枯草芽孢桿菌普魯蘭酶基因的表達(dá)與重組酶的性質(zhì)[J].微生物學(xué)通報(bào)，2011，38(12)：1755-1761.

HAN P, ZHOU P,YAN Q J,et al.Expression of a pullulanase gene from the thermophilic Bacillus subtilis and characterization of therecombinant enzyme[J].Microbiology China,2011，38(12)：1755-1761.

[13]楊云娟.普魯蘭酶基因的克隆及其在畢赤酵母中的高效表達(dá)[D].昆明:云南師范大學(xué)，2005.

YANG Y J.Cloning and Overexpression of Gene Encoding the Pullulanase from Bacillus naganoensis in Pichia pastoris[D].Kunming:Yunnan Normal University,2005.

[14]WANG Q Y,XIE N Z,QIN Y,et al.Tumebacillus flagellatus sp.nov.,an a-amylase/pullulanase-producing bacterium isolated from cassava waste water[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2013,63：3138-3142.

[15]SAMBROOK J,RUSSELL D W.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].3版.北京:科學(xué)出版社，2002.

SAMBROOK J,RUSSELL D W.Molecular Cloning:A Laboratory Manual[M].3rd ed.Beijing:Science Press,2002.

[16]LETUNIC I,DOERKS T,BORK P.SMART 6:Recent updates and new developments[J].Nucleic Acids Res,2009,37:229-232.

[17]SCHULTZ J,MILPETZ F,BORK P,et al.SMART,a simple modular architecture research tool:Identification of signaling domains[J].Proc Natl Acad Sci,USA,1998,95(11):5857-5864.

[18]LILIUS G,PERSON M,BU L,et al.Metal affinity precipitation of proteins carrying genetically attached poly histidine tails[J].Eur J Biochem,1991,198(2):499-504.

[19]汪家政.蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)[M].北京:科學(xué)出版社,2002.

WANG J Z.The Technical Manuals of Protein[M].Beijing:Science Press,2002.

[20]MALLE D,ITOH T,HASHIMOTO W,et al.Overexpression,purification and preliminary X-ray analysis of pullulanase from Bacillus subtilis strain 168[J].Acta Crystallogr,2006,62:381-384.

[21]陸雁.Bacillus licheniformis普魯蘭酶基因的克隆表達(dá)及分子改造[D].南寧：廣西大學(xué),2012.

LU Y.Cloning,Expression and Molecular Modification of Pullulanase Gene from Bacillus licheniformis[D].Nanning：Guangxi University,2012.

[22]秦艷.普魯蘭酶突變體及優(yōu)良釀酒酵母工程菌的構(gòu)建[D].南寧：廣西大學(xué),2014.

QIN Y.Construction of Pullulanase and Genetic Engineering of Saccharomyces cerevisiae Strain[D].Nanning：Guangxi University,2014.

[23]EAST A,MECHALY A E,HUYSMANS G H,et al.Structural basis of pullulanase membrane binding and secretion revealed by X-ray crystallography,molecular dynamics and biochemical analysis[J].Structure，2016,24(1):92-104.

[24]M?LLER M S,ABOU HACHEM M,SVENSSON B,et al.Structure of the starch-debranching enzyme barley limit dextrinase reveals homology of the N-terminal domain to CBM21[J].Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun，2012,68(9):1008-1012.

[25]ZHANG Y,LIU Y H,LI Y,et al.Extracellular expression of pullulanase from Bacillus naganoensis in Escherichia coli[J].Ann Microbiol,2013,63(1):289-294.

[26]喬宇.Ⅰ型普魯蘭酶產(chǎn)生菌的篩選及其基因克隆、分子改造和高密度發(fā)酵表達(dá)研究[D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2015.

QIAO Y.Study on Screening of TypeⅠPullulanase Producing Bacteria and its Gene Cloning,Molecular Modification,and Expression in the High Density Fermentation[D].Beijing：Chinese Academy of Agricultural Sciences,2015.

[27]SONG W,NIE Y,MU XQ,et al.Enhancement of extracellular expression of Bacillus naganoensis pullulanase from recombinant Bacillus subtilis:Effects of promoter and host[J].Protein Expr Purif，2016,4(16)：30055-30059.

[28]CHEN A,LI Y,NIE J,et al.Protein engineering of Bacillus acidopullulyticus pullulanase for enhanced thermostability using in silico data driven rational design methods[J].Enzyme Microb Technol,2015,78:74-83.

(責(zé)任編輯：陸雁)

附件1：pulB基因的核苷酸序列

Attachment 1：The nucleotide sequence of thepulB gene

收稿日期：2016-03-23

作者簡(jiǎn)介：王青艷(1972-)，女，博士，主要從事微生物酶與菌種選育研究。 **通訊作者：黃日波(1958-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事酶工程研究，E-mail:rbhuang@gxas.cn。

中圖分類(lèi)號(hào)：Q93

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1002-7378(2016)02-0136-10

Cloning,Expression and Enzymatic Characterization of a New TypeⅠ Pullulanase Gene

WANG Qingyan，SHEN Naikun，ZHU Jing，QIN Yan，ZHU Qixia，XIE Nengzhong，LI Yi，HUANG Ribo

(State Key Laboratory of Non-food Biomass and Enzyme Technology,National Engineering Research Center for Non-food Biorefinery,Guangxi Key Laboratory of Biorefinery,Guangxi Academy of Sciences,Nanning,Guangxi,530007,China)

Abstract:【Objective】Screening,cloning,heterologous expression of the pullulanase encoding gene from Tumebacillus flagellatus GST4 in order to obtain efficient expression of a new pullulanase and enhance its activity and thermosatbility.【Methods】Cloning,construction of recombinant and heterologous expression of pullulanase gene in Escherichia coli,purification by Ni-chelating affinity chromatography from cell free culture supernatant and characterization of pullulanase were carried out.【Results】The pullulanase gene pulB was cloned and expressed successfully in E.coli, and the activity of cultural supernatant can reach 78 U/mL.And PulB was purified to homogeneity and the specific activity was 258 U/mg.The optimal temperature of purified PulB is 50℃,its optimal pH value is 5.0 and activity remains stable within the acidic range of pH 4.5～5.5. PulB displayed typical Michaelis-Menten kinetics,where its Kmis(16.28±0.03)mg/mL and Vmaxis(22.05±0.02) μmol·min-1·mg-1,respectively,when used pullulan as substrate.GenBank blast results show that there is no homologous DNA sequences with pulB,and the encoding protein of PulB had the highest identity (54%) with cyclomaltodextrinase from Thermicanus aegyptius.We find that it has amylase structure domain by online SMART searching.The substrate specificity analysis shows that it typically hydrolyze pullulan and amylopectin to produce liner oligosaccharides or maltotriose.【Conclusion】PulB is a new starch/pullulan hydrolase,which has not yet been reported.It can hydrolyze pullulan or amylopectin and belong to type I pullulanase.

Key words:typeⅠpullulanase,Tumebacillus flagellatus,cloning and expression,enzymatic characterization

網(wǎng)絡(luò)優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間:2016-05-17

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*國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31160023，31400079)，廣西科學(xué)研究與技術(shù)開(kāi)發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(桂科合14123001-19，桂科合15104001-1)，廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2015GXNSFBA139044)，廣西“八桂學(xué)者”、南寧市特聘專家和留學(xué)人員科技活動(dòng)項(xiàng)目擇優(yōu)資助項(xiàng)目和廣西科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(15YJ22SW01)資助。