外源核苷酸對大菱鲆幼魚生長和溶菌酶活力的影響*

劉　瑩，劉　名，于超勇，宋靜靜，官曙光，徐　濤，于道德 **

(1.山東省海洋生物研究院，山東青島　266104；2.山東省海水養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，山東青島　266104；3.山東省漁業(yè)技術(shù)推廣站，山東濟南　250013)

外源核苷酸對大菱鲆幼魚生長和溶菌酶活力的影響*

劉瑩1,2，劉名1,2，于超勇1,2，宋靜靜1,2，官曙光1,2，徐濤3，于道德1,2**

(1.山東省海洋生物研究院，山東青島266104；2.山東省海水養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，山東青島266104；3.山東省漁業(yè)技術(shù)推廣站，山東濟南250013)

摘要：【目的】研究外源核苷酸對大菱鲆(Scophthalmus maximus)幼魚生長和免疫力的影響，為核苷酸營養(yǎng)在大菱鲆養(yǎng)殖上的推廣應用提供依據(jù)。【方法】以魚粉為主要蛋白源，在基礎(chǔ)飼料中分別添加不同含量的核苷酸，添加量(W/W)分別為0.00%，0.01%，0.03%，0.10%，0.30%，0.50%。在人工養(yǎng)殖的情況下(自然光照，水溫11.0～16.3℃)，對初始體質(zhì)量為12.07～12.29 g的大菱鲆幼魚進行核苷酸營養(yǎng)的外源添加實驗，分別在4周和8周對不同組別的生長和生態(tài)轉(zhuǎn)化效率進行定期測定。然后在8周實驗結(jié)束時，對大菱鲆血清中溶菌酶活力進行測定?！窘Y(jié)果】隨著在基礎(chǔ)飼料中核苷酸添加量的增加，大菱鲆的特定生長率逐漸減小，且大菱鲆生態(tài)轉(zhuǎn)化效率實驗組小于對照組，而血清中溶菌酶活性實驗組高于對照組?！窘Y(jié)論】核苷酸對大菱鲆幼魚的生長無明顯的促進或抑制作用，對血清中的溶菌酶活性具有促進作用。

關(guān)鍵詞：核苷酸大菱鲆幼魚生長溶菌酶

0引言

【研究意義】大菱鲆(Scophthalmus maxim-us)作為我國北方地區(qū)海水養(yǎng)殖的主要魚種，在掀起第4次海水養(yǎng)殖浪潮的同時，也充分暴露出我國海水養(yǎng)殖的弊端：養(yǎng)殖環(huán)境不斷惡化，病害日趨嚴重，傳統(tǒng)的抗生素和化學藥物的使用引起耐藥性菌株增加等等，這些已成為制約養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的瓶頸[1-4]。面對世界魚粉蛋白緊缺的現(xiàn)狀，水產(chǎn)業(yè)界開始反思我國大菱鲆養(yǎng)殖業(yè)的出路，必須開展種質(zhì)優(yōu)化、加強良種選育，改善傳統(tǒng)養(yǎng)殖模式，優(yōu)化餌料配比，才能夠維持我國大菱鲆養(yǎng)殖業(yè)甚至整個水產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，完善我國海水魚類養(yǎng)殖大產(chǎn)業(yè)架構(gòu)[5-6]。核酸是一切生物遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，是合成蛋白質(zhì)、組成細胞的重要生理活性物質(zhì)。核酸及其相關(guān)物質(zhì)具有抗氧化作用，可作為內(nèi)源性自由基清除劑和抗氧化劑，具有抗衰老、增強免疫功能等作用[7]。由于動物能在自己體內(nèi)合成核苷酸，缺乏時通常無特異性缺乏癥，并且飼料中的核苷酸含量很低，因此長期以來人們一直視其為非必需營養(yǎng)素?！厩叭搜芯窟M展】隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，人們在對鮭魚、海鱸、虹鱒、河豚、鯉魚等魚類及龍蝦的養(yǎng)殖過程中發(fā)現(xiàn)，添加核苷酸可促進幼魚早期組織發(fā)育，影響魚類攝食行為和非必需氨基酸的合成，增強魚類機體抗病力，同時還能通過增強親魚餌料的營養(yǎng)來強化幼魚的體質(zhì)[7-8]。Burrells等[9-10]的研究確定核苷酸作為魚類營養(yǎng)的概念，并在全球水產(chǎn)營養(yǎng)領(lǐng)域引起轟動。隨著對核苷酸飼料添加劑研究的不斷深入，大多數(shù)研究已經(jīng)確定核苷酸的外源添加能促進水產(chǎn)動物的生長發(fā)育，提高水產(chǎn)動物的免疫力[11]。目前核苷酸作為一種半必需營養(yǎng)物質(zhì)，已廣泛應用于食品、醫(yī)藥和飼料等多個領(lǐng)域。【本研究切入點】為促進大菱鲆養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，優(yōu)化餌料配比，在人工養(yǎng)殖的情況下(自然光照，水溫11～16.3℃)，對大菱鲆幼魚進行核苷酸營養(yǎng)的外源添加實驗?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過對大菱鲆的生長性能和血清中溶菌酶活力的統(tǒng)計分析，探討其對魚類生長及其免疫機能的影響，以期為核苷酸營養(yǎng)在大菱鲆養(yǎng)殖上的推廣應用提供科學依據(jù)，為研制開發(fā)鲆鰈類無公害環(huán)保配合飼料提供技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗飼料

基礎(chǔ)飼料的配比參照文獻[12](表1),其營養(yǎng)成分如表2所示。在此基礎(chǔ)上，分別添加質(zhì)量比為0.01%，0.03%，0.10%，0.30%，0.50%核苷酸作為實驗飼料，對照組為基礎(chǔ)飼料，各組飼料用全自動漁用餌料機加工成3.0 mm × 3.0 mm的顆粒，在50℃恒溫下干燥12 h，干燥顆粒置于-20℃冰箱備用。

表1基礎(chǔ)飼料配方(%)

Table 1Formulation of experimental diets(%)

原料Ingredient含量Contents魚粉Fishmeal54.00高筋面粉Breadflour15.00次粉Wheatmiddling19.40魚油Fishoil6.70大豆卵磷脂Soybeanlecithin1.00維生素預混料Vitaminpremix1.00礦物質(zhì)預混料Mineralpremix2.00VC磷酸酯C6H6O9P(35%)0.10氯化膽堿Cholinechloride(50%)0.30磷酸二氫鈣Ca(H2PO4)20.50

表2基礎(chǔ)飼料的營養(yǎng)成分

Table 2Nutritional amposition of experimental diets

營養(yǎng)成分Nutritioncomposition含量Contents粗蛋白Crudeprotein47.22%粗脂肪Crudelipid11.47%灰分Ash12.63%總能量Grossenergy20.66kJ/g

1.1.2樣品及試驗地

實驗所用大菱鲆為當年人工培育的同一批苗種，共400尾。試驗地點為山東省海洋生物研究院鰲山衛(wèi)魚類試驗基地。

1.1.3儀器

ME104E電子分析天平、photoLab 6600紫外可見分光光度計、因斯特pH計、Eppendorf移液槍、Eppendorf小型臺式離心機。

1.1.4藥品

(1)磷酸鈉緩沖液

準確稱取35.8 g Na2HPO4·12H2O于78.4 mL蒸餾水中，并用玻璃棒攪拌使之溶解；另外稱取15.6 g NaH2PO4·2H2O于96.4 mL蒸餾水中，使之溶解；最后用移液管分別移取17.8 mL磷酸氫二鈉溶液、82.2 mL磷酸二氫鈉溶液于燒杯中，用pH計測得pH值為6.15。

(2)溶壁微球菌懸液

稱取0.0202 g溶壁微球菌粉置于100 mL磷酸鈉緩沖液中，得到濃度為0.2 mg/mL的菌液，-20℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2核苷酸營養(yǎng)的外源添加

實驗前準備：將幼魚用飼料暫養(yǎng)2周以適應養(yǎng)殖環(huán)境。實驗開始前，大菱鲆饑餓24 h，選擇大小均勻、體格健壯的大菱鲆幼魚，核苷酸添加量為0.00%為對照組；另設(shè)5組實驗組，核苷酸添加量(W/W)分別為0.01%，0.03%，0.10%，0.30%，0.50%,記為實驗1,2,3,4,5組。每組分3個平行組，共18個實驗組。實驗所用養(yǎng)殖桶(總體積400 L，水體體積300 L)均為玻璃纖維桶。海水為自然海水經(jīng)沙濾以及紫外消毒處理，采用循環(huán)流水系統(tǒng)，每桶進水量(流水速度)1.0 L/min。每天投喂兩次，分別于9:00和16:00進行投喂至飽食。整個實驗過程水溫條件維持在13～15℃，溶氧5 mg/L以上，鹽度28‰～30‰。

1.3生長性能的測定

在喂養(yǎng)4周與8周后分別進行稱重，并計算餌料使用量，然后根據(jù)公式計算出特定生長率和生態(tài)轉(zhuǎn)換效率：特定生長率RSG,W=(lnWt-lnW0)/t×100%，式中Wt為大菱鲆實驗后的質(zhì)量，W0為實驗前的質(zhì)量，t為時間;生態(tài)轉(zhuǎn)換效率Eg=(Pt/It)×100%，式中Pt、It分別為一定時間內(nèi)體質(zhì)量增長量(g)和攝食量(g)。

1.4溶菌酶活力的測定

1.4.1樣品收集

喂養(yǎng)8周時，每組取5尾樣品，取血，室溫下靜置1 h，待其凝固后置4℃冰箱保持4 h，然后于4℃條件下以4 000 r/min離心15 min，收集血清，保存于4℃冰箱中，供血清溶菌酶活性測定用。

1.4.2溶菌酶活力的測定

參照王雷等[11]的方法，略作修改。以溶壁微球菌(Sigma公司產(chǎn)品)為底物，按下列步驟進行:取溶壁微球菌懸液1 950 μL放入比色皿中，加入50 μL血清混勻，25℃下反應，分別在0.5 min和4.5 min時測其在530 nm處的吸光值OD，然后根據(jù)酶活力的定義(每分鐘減少0.001吸光度的樣品量(mL))，測定溶菌酶活力。

1.5統(tǒng)計分析

實驗結(jié)果均以平均值±標準誤表示。所得數(shù)據(jù)使用統(tǒng)計軟件SPSS17.0在α= 0.05水平下進行單因素方差(ANOVA)分析。數(shù)據(jù)經(jīng)方差分析后進行Tukey組間多重比較分析檢驗,P>0.05認為結(jié)果差異不顯著，P<0.05認為結(jié)果差異顯著。

2結(jié)果與分析

2.1核苷酸對大菱鲆生長性能的影響

經(jīng)單因素方差分析：5個實驗組和對照組之間的特定生長率和生態(tài)轉(zhuǎn)化效率差異不顯著(P>0.05)。

由圖1可以看出：4周后，核苷酸添加量為0.01%的實驗組與對照組之間差異顯著(P<0.05)，其特定生長率明顯低于對照組；其余各實驗組與對照組之間差異不顯著(P>0.05)，且其余各實驗組的特定生長率也都低于對照組。另外，各實驗組之間差異不顯著(P>0.05)，說明飼料中核苷酸添加量的不同對于大菱鲆的特定生長率影響不顯著。由此可知，在此階段飼料中添加核苷酸對大菱鲆的生長并無促進作用，還可能存在一定的抑制作用。

4周后，核苷酸添加量為0.01%時，大菱鲆的特定生長率最低，說明在此濃度下，核苷酸對大菱鲆生長的抑制作用較強；當添加量≥0.03%時，大菱鲆的特定生長率呈逐漸下降趨勢，說明添加量越大，核苷酸的抑制作用越顯著。

8周后，各實驗組與對照組之間差異不顯著(P>0.05)，且各實驗組的特定生長率也都低于對照組(圖1)，說明在此階段，飼料中添加核苷酸對大菱鲆的生長無促進作用，且可能存在一定的抑制作用。核苷酸添加量為0.30%時(8周)，大菱鲆的特定生長率最小。

從圖2可以看出，不論4周還是8周，各實驗組與對照組之間差異都不顯著(P>0.05)，說明飼料中核苷酸添加量的不同對于大菱鲆的生態(tài)轉(zhuǎn)化效率影響都不顯著。當核苷酸添加量為0.10%時，不論哪一周，此實驗組的生態(tài)轉(zhuǎn)化效率均大于對照組，而添加其他濃度時，各組的生態(tài)轉(zhuǎn)化效率都小于對照組。說明對整體而言，此階段核苷酸的添加對大菱鲆的生長并無促進作用。

圖1核苷酸濃度對大菱鲆特定生長率的影響

Fig.1Effect of nucleotide concentration on the specific growth rate of Scophthalmus maximus

圖2核苷酸濃度對大菱鲆生態(tài)轉(zhuǎn)化效率的影響

Fig.2Effect of nucleotide concentration on the ecological conversion efficiency of Scophthalmus maximus

2.2核苷酸對大菱鲆溶菌酶活力的影響

經(jīng)單因素方差分析，5個實驗組和對照組之間的大菱鲆溶菌酶活力差異顯著(P<0.05)。由圖3可知：當核苷酸添加量為0.10%和0.50%時，其組中的大菱鲆血清中溶菌酶活力與對照組之間差異顯著(P>0.05)，而其他實驗組和對照組之間差異不顯著。實驗3組與實驗1，5組之間差異顯著(P>0.05)；實驗5組與實驗2，3，4組之間差異顯著(P>0.05)，說明在飼料中添加核苷酸對大菱鲆血清中的溶菌酶活力影響很大。當核苷酸添加量為0.10%時，大菱鲆血清中溶菌酶的活力最小，且小于對照組；當添加量為其他濃度時，各實驗組的溶菌酶活力總體高于或等于對照組，由此表明在此階段添加核苷酸能提高大菱鲆的溶菌酶活力，對大菱鲆的天然免疫功能具有一定促進作用。

圖3核苷酸濃度對大菱鲆血清中溶菌酶活力的影響

Fig.3Effect of nucleotide concentration on the lysozyme activity of Scophthalmus maximus

3討論

3.1飼料中添加核苷酸對大菱鲆生長性能的影響

一般認為在正常條件下，動物自身的核苷酸合成途徑就足夠滿足其生長。Borda等[13]發(fā)現(xiàn)外源性核苷酸能在魚和甲殼類等水產(chǎn)動物的早期生長階段促進其生長，滿足其早期發(fā)育時所需要的快速細胞復制。早在1983年，Person-Le Ruyet進行的大菱鲆幼魚(大約100 mg/尾)試驗就證實投喂含次黃嘌呤的日糧能顯著促進大菱鲆的生長，并提高其存活率[14]。隨后的研究表明，對大約230 mg的大菱鲆幼魚，投喂次黃嘌呤(10 d 或20 d)同樣能顯著增加其體重。有學者認為，次黃嘌呤促生長作用是由于其能改善飼料適口性，具有誘食作用，能提高攝食率，并減少營養(yǎng)物質(zhì)的流失，或者是在新陳代謝過程中起作用[15]。除次黃嘌呤，核苷酸代謝物對羅非魚幼魚[16]和虹鱒魚[17]也表現(xiàn)出促生長作用。因此，核苷酸對魚類早期發(fā)育階段的促生長作用是毋庸置疑的[7]。

雖然Li等[18]提出核苷酸在魚類的幼魚階段或養(yǎng)成期的生長作用不明顯，但是卻沒有關(guān)于核苷酸的負面報道，而本實驗研究結(jié)果卻表明：隨著核苷酸添加量的增加，大菱鲆的特定生長率總體上逐漸降低，生態(tài)轉(zhuǎn)化效率總體上是實驗組小于對照組，說明在該階段添加核苷酸對生長無促進作用，無論是分開的兩個4周，還是8周的生長都是以對照組最佳。雖然核苷酸添加量為0.10%時，大菱鲆的生態(tài)轉(zhuǎn)化效率較高，但是其特定生長率并不十分突出，其可能的原因如下：

(1)實驗用魚為大菱鲆幼魚，此階段的魚體主要處于生長階段，與早期發(fā)育所需要的快速細胞復制[13]不同，因此該階段的核苷酸促生長作用不明顯；

(2)過多的核苷酸可能造成肝臟在脫嘌呤過程的負擔，因而降低生長率；

(3)本實驗配方中魚粉的含量過高可能會掩蓋核苷酸的作用，因為大部分核苷酸試驗都是基于低含量魚粉的前提下進行的[7]；

(4)雖然在魚粉替代實驗中，核苷酸可能起到很好的替代作用，但是不可忽視核苷酸的毒副作用，需根據(jù)魚的種類對核苷酸的用量進行調(diào)整。

3.2飼料中添加核苷酸對大菱鲆溶菌酶活性的影響

溶菌酶是廣泛存在于魚類體液、血清和巨噬細胞中的一種水解酶，是生物機體在免疫反應過程中分泌的具有溶解細菌作用的非特異性免疫因子，在魚類的免疫防御中發(fā)揮重要作用[19]。

基于哺乳類(主要是人類和嚙齒類)的研究發(fā)現(xiàn)，核苷酸能影響巨嗜細胞的吞噬作用[20-21]和自然殺傷細胞的活性[22]。對魚類的研究也證明外源核苷酸能影響其先天性免疫系統(tǒng)的激素分泌和細胞組分[7]。Sakai等[23]證明外源核苷酸能增加鯉魚體內(nèi)血清補體和溶菌酶的活性，增強巨嗜細胞的吞噬作用和腎臟超氧陰離子合成。Ramadan等[24]通過嗜水氣單胞菌的免疫接種方式，證實外源核苷酸能使羅非魚體液免疫和細胞免疫顯著增強。

本實驗結(jié)果顯示:實驗組的大菱鲆溶菌酶活力高于等于對照組(除0.03%、0.10%外)，當核苷酸添加量為0.50%時大菱鲆的溶菌酶活力最大，實驗組說明飼料中添加核苷酸對大菱鲆血清中溶菌酶活力具有一定促進作用，與以上相關(guān)報道相符，初步說明外源核苷酸可導致大菱鲆幼魚免疫作用增強，增強其免疫防御能力和抵抗疾病的能力。

但從圖3分析，在添加量為0.03%、0.10%時溶菌酶活力比對照組要小，造成上述情況的原因可能有以下幾點:一是大菱鲆血清中的溶菌酶活力與核苷酸添加劑量、投喂周期和方式有關(guān)；二是在實驗過程中存在一些非主觀性因素，比如在測溶菌酶活力時，反應溫度、試劑的pH值等都可能導致實驗的偏差。

4結(jié)論

高含量核苷酸對魚類生長無促進作用，且可能存在一定的抑制作用。在全球魚粉蛋白危機的今天，我們在尋找新型蛋白源以及替代產(chǎn)品需要慎重，核苷酸作為半必需營養(yǎng)素在魚類營養(yǎng)上的應用仍需進一步地研究。

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(責任編輯：米慧芝)

收稿日期：2016-03-29

作者簡介：劉瑩(1990-)，女，研究實習員，主要從事海洋生物學研究。 **通訊作者：于道德(1978-)，男，副研究員，主要從事海水養(yǎng)殖研究，E-mail:wensentte@163.com。

中圖分類號:S963

文獻標識碼：A

文章編號：1002-7378(2016)02-0116-06

Effect of a Nucleotide-enriched Diet on the Growth and Lysozyme Activity in Juvenile Turbot (Scophthalmus maximus)

LIU Ying1,2，LIU Ming1,2，YU Chaoyong1,2，SONG Jingjing1,2，GUAN Shuguang1,2，XU Tao3，YU Daode1,2

(1.Marine Biology Institute of Shandong Province，Qingdao，Shandong，266104，China；2.Mariculture Engineering Research Center of Shandong Province，Qingdao，Shandong，266104，China；3.Shandong Province Fisheries Technology Extension Station，Jinan，Shandong，250013,China)

Abstract：【Objective】The research of exogenous nucleotides (EN) effecting on growth and innate immunity of juvenile turbort (Scophthalmus maximus),which provides the evidence for the popularization and application of Scophthalmus cultivation.【Methods】With a basal diet formulated from fish meal containing 47% crude protein and 11% lipid by adding exogenous nucleotides of 0.00%,0.01%,0.03%,0.10%,0.30%,0.50%,respectively(W/W). Each diet was distributed by hand to triplicate groups of 15 fish and the growth trial lasted 8 weeks.【Results】At the end of 4 weeks and 8 weeks, the special growth rate and ecological conversion efficiencies were the same for all groups. Although a reverse relationship was found between the special growth rate and EN levels,also,a weaker relationship was found between the ecological conversion efficiencies and EN levels.The activity of lysosomal enzymes is promoting.【Conclusion】We conclude that,EN is not having positive or negative on growth rate of S.maximus,at least at the stage of juvenile.However,elevated activity of lysosomal enzymes in blood serum indicates its promotion of innate immunity.

Key words:nucleotide，juvenile turbot (Scophthalmus maximus)，growth，lysozyme

網(wǎng)絡優(yōu)先數(shù)字出版時間:2016-05-12

網(wǎng)絡優(yōu)先數(shù)字出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/45.1075.N.20160512.1517.018.html

修回日期：2016-05-09

*山東省農(nóng)業(yè)良種工程“優(yōu)質(zhì)抗病速生魚類良種選育——速生耐溫工廠化適養(yǎng)品種-大菱鲆選育”和山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)體系魚類創(chuàng)新團隊項目(SDAIT-14-011-04)資助。