鼠傷寒沙門菌分子分型及耐藥性特點*

程招敏，藍　鍇，柏彩英，鄧秋蓮，袁彩虹，周　強△，張　文

(1.廣東省中醫(yī)院檢驗科，廣州 510120；2.廣東省廣州中醫(yī)藥大學第二臨床學院　510120;3.廣東省婦幼保健院檢驗科，廣州 510010；4.廣東省廣州市婦女兒童中心檢驗科　510623)

·論著·

鼠傷寒沙門菌分子分型及耐藥性特點*

程招敏1,2，藍鍇1，柏彩英3，鄧秋蓮4，袁彩虹1，周強1△，張文1

(1.廣東省中醫(yī)院檢驗科，廣州 510120；2.廣東省廣州中醫(yī)藥大學第二臨床學院510120;3.廣東省婦幼保健院檢驗科，廣州 510010；4.廣東省廣州市婦女兒童中心檢驗科510623)

目的了解廣州市鼠傷寒沙門菌的分子分型以及耐藥性特點。方法利用脈沖場凝膠電泳(PFGE)分型技術對鼠傷寒沙門菌進行分子分型，采用紙片擴散(K-B)法進行藥敏試驗，且采用WHONET 5.6軟件對藥敏結果進行耐藥分析。結果PFGE結果聚類分析將44株鼠傷寒沙門菌分為15型，其中PFGE9型、PFGE8型、PFGE3型為廣州市的優(yōu)勢菌型，菌株比例為54.5%(24/44)。耐藥表型分型可將其分為21型，多重耐藥菌占61.4%(27/44)。結論廣州市鼠傷寒沙門菌分子分型呈多樣性，分離株的多重耐藥較為嚴重。

鼠傷寒沙門菌；脈沖場凝膠電泳；耐藥表型；多重耐藥

在廣州市引起食物中毒的病原菌中，沙門菌一直占前三位，鼠傷寒沙門菌是臨床較常見的沙門菌致病血清型[1]。目前該菌引起的食物中毒事件已由先前的點源性集中暴發(fā)轉變?yōu)榭绲貐^(qū)的散在暴發(fā)，而追蹤污染源及傳播途徑依賴于菌株分子分型手段[2]。脈沖場凝膠電泳(PFGE)是一種研究細菌分子分型同源性分析的有效方法，該技術是對整個細菌染色體進行分析，具有重復性好，結果穩(wěn)定可靠，區(qū)分能力強等優(yōu)點,現(xiàn)已被用于多種病原體暴發(fā)流行的檢測分析中，是國際公認的區(qū)分暴發(fā)菌株和溯源的金標準[3-4]。因此，本研究利用PFGE分型技術對廣州市44株鼠傷寒沙門菌進行分子分型，同時對其進行耐藥性分析，為指導臨床合理使用抗菌藥物和傳染病的防控提供科學依據(jù)。

1材料與方法

1.1菌株來源鼠傷寒沙門菌為2014～2015年廣東省中醫(yī)院、廣東省婦幼保健院、廣州市婦女兒童中心門診就診患者的大便標本分離株，共44株。標準菌株為大腸埃希菌ATCC25922，來自原衛(wèi)生部臨檢中心；沙門菌H9812，由中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所組織建立的全國病原細菌實驗室監(jiān)測網絡(PulseNet China)提供。

1.2儀器與試劑Vitek-2全自動細菌鑒定藥敏分析儀、Vitek-MS(法國梅里埃公司)、CHEF Mapper脈沖場凝膠電泳儀和GEL Doc EQ凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)、比濁儀(美國DADE BEHRING公司)。沙門菌屬診斷血清(寧波天潤生物藥業(yè)有限公司)、哥倫比亞血瓊脂平板和水解酪蛋白(M-H)瓊脂平板(法國梅里埃公司)、藥敏紙片(英國Oxoid公司)、限制性內切酶XbaⅠ(美國Promega公司)、瓊脂糖SeaKem Gold Agarose(美國Cambrex公司)、蛋白酶K(德國MERCK公司)。

1.3檢測方法

1.3.1菌株復蘇及鑒定將收集的44株菌株復蘇后，分別使用Vitek-2全自動細菌鑒定藥敏分析儀和Vitek-MS進行鑒定，再用沙門菌屬診斷血清進行血清學鑒定和分型。

1.3.2藥敏試驗采用紙片擴散(K-B)法對44株鼠傷寒沙門菌進行抗菌藥物敏感試驗，參照2015版美國臨床和實驗室標準化協(xié)會(CLSI)抗菌藥物敏感試驗執(zhí)行標準M100-S25[5]，檢測10種抗菌藥物包括：氨芐西林(AMP)、氨芐西林/舒巴坦(SAM)、環(huán)丙沙星(CIP)、慶大霉素(GEN)、阿米卡星(AMK)、頭孢曲松(CRO)、頭孢他啶(CAZ)、頭孢吡肟(FEP)、復方磺胺甲噁唑(SXT)、氯霉素(CHL)。使用WHONET5.6軟件對藥敏結果進行統(tǒng)計分析，獲得44株鼠傷寒沙門菌的耐藥相關信息。

1.3.3PFGE分型根據(jù)美國PulseNet網絡實驗室推薦的沙門菌PFGE標準操作方法[6]，通過制膠、酶切、電泳實驗步驟，獲得44株鼠傷寒沙門菌的PFGE圖譜。運用BioNumerics(Version5.1)軟件處理PFGE圖像，并使用非加權配對算術平均法進行聚類分析。

2結果

2.1藥敏結果

2.1.1菌株鑒定結果44株鼠傷寒沙門菌經Vitek-2全自動細菌鑒定藥敏分析儀和Vitek-MS鑒定均為沙門菌屬，血清學鑒定和分型均符合鼠傷寒沙門菌抗原式。

2.1.2藥敏試驗結果44株鼠傷寒沙門菌對10種抗菌藥物的耐藥性結果見表1，其中對三代頭孢敏感性在86.0%以上，對氟喹諾酮類代表性藥物CIP的敏感性為70.5%，對AMP、SAM、CHL的敏感性均較低，其中對AMP的耐藥率高達86.4%。

表1　44株鼠傷寒沙門菌對10種抗菌藥物

2.1.3耐藥表型分型由于鼠傷寒沙門菌對CRO和CAZ的耐藥性類似，故合并統(tǒng)計，用CEPH3表示。所得耐藥表型分型采用NY“A”～“B”進行分類命名，其中A代表耐藥種類數(shù)，B表示耐藥種類亞型 (如NY2-3表示對兩種抗菌藥物耐藥的第3種亞型)，得到沙門菌耐藥表型分型表，見表2。44株鼠傷寒沙門菌通過耐藥表型分型最終可分為21型，多重耐藥菌27株(61.4%)，其中對3種抗菌藥物耐藥6株(13.6%),對4種抗菌藥物耐藥8株(18.2%),對5種抗菌藥物耐藥4株(9.1%),對6種抗菌藥物耐藥8株(18.2%)，對7種抗菌藥物耐藥1株(2.3%)。

2.2PFGE分型結果44株鼠傷寒沙門菌經Xba Ⅰ酶切，進行PFGE分型，結果顯示菌株間的相似度為66.0%～100.0%。按照聚類相似度在90.0%～100.0%為同一亞型的分型方法，將44株鼠傷寒沙門菌分為15個亞型。結果顯示，PFGE9型14株、PFGE8型5株、PFGE3型5株，這三型為廣州市的優(yōu)勢菌型，其中以PFGE9型最多，占所有菌株的31.8%。PFGE3型中的26、27、31號菌株，12、19號菌株，PFGE6型中的所有菌株，PFGE9型中的23、24號菌株，1、3、4、5、11、13號菌株聚類相似度為100.0%，這些彼此間相似度為100.0%的菌株可能來自同一克隆。見圖1(見《國際檢驗醫(yī)學雜志》網站主頁“論文附件”)。

表2　44株鼠傷寒沙門菌耐藥表型分型

注：-表示無數(shù)據(jù)。

2.3耐藥表型分型和PFGE分型的比較大多數(shù)PFGE型內各菌株的耐藥表型非常類似。最主要的優(yōu)勢菌型PFGE9型有14株菌，若按照聚類相似度93%為界限，可將這14株鼠傷寒沙門菌分為兩個亞型，其中15、22、23、24、38、41號菌株為同一亞型，1、3、4、5、8、9、11、13號菌株為另一亞型，前者只對1～2種抗菌藥物耐藥或者全敏感，后者均為多重耐藥菌，耐藥譜類似且耐藥表型多為NY6-1型，同一PFGE型的菌株的耐藥表型并不完全一致。對聚類相似度為100.0%的菌株分析發(fā)現(xiàn)，26、27、31號菌株耐藥表型完全相同，12、19號菌株耐藥表型也完全相同，35、37、44號菌株耐藥表型不同但耐藥譜類似，表明同一克隆的鼠傷寒沙門菌耐藥表型可能有差異。二者比較的具體結果見圖1(見《國際檢驗醫(yī)學雜志》網站主頁“論文附件”)。

3討論

鼠傷寒沙門菌廣泛存在于自然界中，人類往往是因為食入帶菌狀態(tài)的食品或者飲用污染的水導致感染。近年來，由于臨床不合理使用抗菌藥物及過度使用抗菌藥物的家禽大便隨意排放到環(huán)境中，導致沙門菌耐藥率逐年升高[7-8]，其中鼠傷寒沙門菌最為最嚴重[9]。本研究顯示，鼠傷寒沙門菌對AMP耐藥性高達86.4%，對SXT、SAM、CHL的敏感性也降低。研究結果發(fā)現(xiàn)，鼠傷寒沙門菌對氟喹諾酮類中CIP雖然沒有耐藥菌，但是29.5%呈現(xiàn)中度敏感，與其他研究者報道的氟喹諾酮類耐藥趨勢一致[10]，可能與我國畜牧業(yè)長期大量投放此類抗菌藥物進行養(yǎng)殖有一定的關系；也可能與鼠傷寒沙門菌產生變種有關[9]，具體有何關聯(lián)尚不清楚。從耐藥表型分型可看出，多重耐藥菌高達61.4%，說明廣州市鼠傷寒沙門菌多重耐藥形勢較為嚴峻。2010年廣東省監(jiān)測結果顯示，鼠傷寒沙門菌是耐藥率最高的血清型[9]，因此定期進行鼠傷寒沙門菌耐藥性監(jiān)測，掌握耐藥菌變遷趨勢，選擇敏感藥物指導臨床用藥是控制鼠傷寒沙門菌感染暴發(fā)流行的重要環(huán)節(jié)。

判斷耐藥譜相似的鼠傷寒沙門菌是否來自同一克隆株，以及這些菌株是否存在暴發(fā)感染，或者是否來自同種食物或者環(huán)境，需要相對準確的分子分型手段輔助[11]，這對傳染病的控制起著非常重要的作用。用限制性內切酶Xba Ⅰ將細菌染色體DNA切成不同大小的DNA片段進行PFGE，根據(jù)所得的圖譜進行聚類分析[12]，目前被認為是細菌分子流行病學研究的金標準。本研究結果顯示，44株鼠傷寒沙門菌可以分為15個PFGE型，帶型呈現(xiàn)多樣性，說明本地區(qū)人感染鼠傷寒沙門菌有較廣的來源，其中有14株(31.8%)為PFGE9型，為廣州市的優(yōu)勢菌型，提示在2014～2015年的某段時間內可能存在共同暴露源的鼠傷寒沙門菌的暴發(fā)流行，但需要結合流行病學調查進一步證實。如聚類分析圖所示，多數(shù)PFGE帶型聚類相似度在90%以上，遺傳距離較近，屬于同系克隆，說明變異中存在相對穩(wěn)定性[13]。正是因為同系克隆，所以PFGE帶型相同的菌株，其耐藥譜比較類似。對于PFGE帶型相同而耐藥譜不同的現(xiàn)象可能與耐藥基因發(fā)生突變有關,可能突變位點不在酶切位點上，導致耐藥情況不能完全從 PFGE分型上體現(xiàn)出來，但這需要進一步研究。

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Characteristics of molecular typing and drug-resistance for Salmonella typhimurium*

CHENGZhaomin1,2,LANKai1,BOCaiying3,DENGQiulian4,YUANCaihong1，ZHOUQiang1△，ZHANGWen1

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,GuangdongProvincialHospitalofT.C.M，Guangzhou,Guangdong510120,China;2.TheSecondClinicalCollege,GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou,Guangdong510120,China;3.DepartmentofClinicalLaboratory,GuangdongProvincialMaternalandChildHealthInstitute,Guangzhou,Guangdong510010,China;4.DepartmentofClinicalLaboratory,GuangzhouWomenandChildren′sMedicalCenter,Guangzhou,Guangdong510623,China)

ObjectiveTo realize the characteristics of molecular typing and drug-resistant for Salmonella typhimurium isolated from Guangzhou City.MethodsPulse-field gel electrophoresis(PFGE)was used to type Salmonella typhimurium,and Kirby-Bauer method was used for antimicrobial susceptibility test,then used WHONET5.6 software analyzed antimicrobial susceptibility test.ResultsA total of 44 Salmonella typhimurium typed into 15 PFGE patterns by PFGE,containing three dominating patterns,PFGE9,PFGE8 and PFGE3.Drug resistance phenol-typing could be divided into 21 types,multi-drug resistant bacteria accounted for 61.4%(27/44).ConclusionMolecular typing of Salmonella typhimurium isolated from Guangzhou City is diversity,which showed multi-drug resistant.

Salmonella typhimurium;pulse-field gel electrophoresis;drug-resistant phenol-typing;multi drug resistance

國家自然科學基金資助項目(81271909)。

程招敏，男，檢驗師，主要從事細菌耐藥機制研究?！?/p>

，E-mail:13631412228@163.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.12.004

A

1673-4130(2016)12-1601-03

2016-01-28修回日期：2016-03-22)