薺菜提取液對(duì)煙草青枯病菌的抑制作用

馮游滔，謝　燕，張　亞，廖曉蘭*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，湖南 長沙410128；2.植物病蟲害與防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410128)

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薺菜提取液對(duì)煙草青枯病菌的抑制作用

馮游滔1,2，謝燕1,2，張亞1,2，廖曉蘭1,2*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，湖南 長沙410128；2.植物病蟲害與防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410128)

摘 要：采用無菌水、乙酸乙酯、無水乙醇、石油醚、丙酮、甲醇浸提薺菜干粉，通過室內(nèi)毒力試驗(yàn)，分別考察薺菜提取液對(duì)煙草青枯病菌的抑制作用，結(jié)果僅有乙酸乙酯和無菌水薺菜提取液對(duì)煙草青枯病菌有抑菌活性，乙酸乙酯提取液抑菌率最高，為63.9％，無菌水提取液抑菌率為28.9％。通過透射電鏡、麥法蘭分度計(jì)比濁法、蒽酮比色法、考馬斯亮藍(lán)法分別考察薺菜無菌水和乙酸乙酯提取液對(duì)煙草青枯病菌形態(tài)、生長曲線、糖利用率及蛋白質(zhì)含量的影響。電鏡觀察表明，經(jīng)薺菜無菌水和乙酸乙酯提取液處理的煙草青枯病菌細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，菌體裂解。薺菜乙酸乙酯和水提取液能使煙草青枯病菌對(duì)數(shù)期滯后，糖利用能力降低，蛋白質(zhì)含量增高。

關(guān) 鍵 詞：薺菜提取液；煙草青枯病菌；抑制作用

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薺菜(Capsella bursa-pastoris)屬十字花科薺菜屬草本植物[1]。Tarle等[2]發(fā)現(xiàn)，薺菜中的蘆丁對(duì)葡萄球菌(Staphylococcus)、大腸桿菌(Escherichia coli )有較強(qiáng)的抑制作用；楊詠潔[3]證實(shí)，薺菜多糖對(duì)大腸桿菌、枯草桿菌(Bacillus subtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus Rosenbach)、沙門氏菌(salmonella)都有一 定 的抑制效果；Saman Soleimanpour等[4]研究發(fā)現(xiàn)，薺菜和甘草的甲醇提取物對(duì)口腔致病菌有抑菌活性；Woo Jin Choi等[5]的研究表明，薺菜中的胡蘿卜素能抗超級(jí)細(xì)菌。

煙草青枯病是由青枯勞爾氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的土傳細(xì)菌性病害[6]，對(duì)煙草品質(zhì)和效益影響極大[7]。防治煙草青枯病的方法主要包括輪作制、化學(xué)藥劑防治、利用抗病品種防治和生物防治等[8–9]。近年來，植物源提取物防治煙草青枯病菌的報(bào)道較多，張漢千等[10]發(fā)現(xiàn)，大蒜乙醇和水提取物對(duì)煙草青枯病菌有抑制作用。賴榮泉等[11]利用大蒜的乙醇提取物進(jìn)行大田試驗(yàn)，對(duì)煙草青枯病的防效最高可達(dá) 71.30％。許靈杰等[12]通過室內(nèi)抑菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，竹醋液復(fù)合洋蔥、魚腥草提取物對(duì)煙草青枯病菌的抑制率均達(dá)到99％以上。姜雯婷等[13]發(fā)現(xiàn)，酒餅簕、許樹和光葉巴豆的乙醇提取物對(duì)煙草青枯病菌的抑制效果較強(qiáng)。

為探討薺菜防治煙草青枯病菌的潛力，筆者運(yùn)用多種溶劑對(duì)薺菜干粉進(jìn)行了提取，通過室內(nèi)毒力試驗(yàn)，考察提取液對(duì)煙草青枯病菌的抑菌作用，運(yùn)用透射電鏡觀察煙草青枯病菌菌體結(jié)構(gòu)變化，并通過麥法蘭分度計(jì)比濁法、蒽酮比色法、考馬斯亮藍(lán)法分別考察了薺菜無菌水和乙酸乙酯提取液對(duì)煙草青枯病菌形態(tài)、生長曲線、糖利用率及蛋白質(zhì)含量的影響，以期為開發(fā)新型薺菜活性生防制劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試薺菜購自蔬菜市場。整株洗凈曬干，高速粉碎機(jī)粉碎備用。供試煙草青枯病菌(Ralstonia solanacearum)由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物安全檢測中心提供。供試煙草湘煙3號(hào)由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)中南煙草試驗(yàn)站提供。培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(NA)[14]，pH7.0～7.2。

1.2 方法

1.2.1 薺菜活性物質(zhì)的提取

參照夏日照等[15]的提取方法，用無菌水提取薺菜干粉，得膏狀物，用無菌水溶解并定容至20 mL，獲得薺菜水提液，4 ℃保存，備用。

同水提取法，分別用乙酸乙酯、無水乙醇、丙酮、石油醚和甲醇提取薺菜干粉，得膏狀物，用無水乙醇溶解并定容至20 mL，分別獲得薺菜乙酸乙酯、無水乙醇、丙酮、石油醚、甲醇提取液，4 ℃保存，備用。

1.2.2 煙草青枯病菌菌懸液制備及抑菌活性測定

將保存的煙草青枯病菌在NA培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，備用；接種當(dāng)天，用接種環(huán)挑取適量菌體于無菌水中，用麥?zhǔn)媳葷峁芘渲瞥?×108cfu/mL的菌懸液。

采用抑菌圈法[16]，注入薺菜不同溶劑提取液，測定對(duì)煙草青枯病菌的抑菌活性。

1.2.3 薺菜活性提取液對(duì)病原菌細(xì)胞形態(tài)影響的觀察

在NA培養(yǎng)基中分別加入1 mL煙草青枯病菌懸液和2個(gè)經(jīng)過滅菌的5 mm方形塑料小片，140 r/min，28 ℃振蕩培養(yǎng)，24 h后加入400 μL薺菜水提液和乙酸乙酯提取液，繼續(xù)振蕩培養(yǎng) 8 h，取出塑料小片放入裝有固定液的離心管中，經(jīng)脫水、漂洗干燥等，進(jìn)行掃描電鏡觀察。

1.2.4 薺菜提取液對(duì)煙草青枯病菌生長曲線、糖利用率、蛋白質(zhì)含量的影響的測定

用麥法蘭分度計(jì)比濁法[17]、蒽酮比色法[18]、考馬斯亮藍(lán)法[19]繪制細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)生長曲線、葡萄糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線和蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別加入200 μL薺菜無菌水和乙酸乙酯提取液，以加無菌水和乙醇溶液的菌液為對(duì)照，繪制煙草青枯病菌的生長圖、含糖量的變化圖和蛋白質(zhì)含量的變化圖。

1.3 數(shù)據(jù)處理

將數(shù)據(jù)導(dǎo)入DPS軟件中分析顯著性差異，使用Excel 2010繪圖并分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 薺菜不同溶劑提取液的抑菌效果

采用抑菌圈法，觀察薺菜乙酸乙酯、無菌水、無水乙醇、丙酮、石油醚和甲醇提取液對(duì)煙草青枯病菌的抑菌效果，結(jié)果僅有乙酸乙酯和無菌水提取液對(duì)煙草青枯病菌有抑制作用(圖1)，其余溶劑的提取液沒有抑菌效果，說明溶劑會(huì)影響薺菜提取物的抑菌能力。薺菜乙酸乙酯提取液抑菌圈直徑達(dá)40 mm，抑菌率達(dá)60％以上，薺菜無菌水提取液抑菌圈直徑達(dá)18 mm，抑菌率為 28.9％，說明薺菜中具有抑菌活性的物質(zhì)可能是脂溶性和水溶性的混合物，且脂溶性的抑菌物質(zhì)能較充分地溶解在乙酸乙酯中。采用不同溶劑提取的有效抑菌成分可能不同。

圖1　薺菜不同溶劑提取液的抑菌效果Fig .1 Inhibitory effects of different solvent extracts from Capsella bursa-pastoris on Ralstonia solanacearum

2.2 薺菜無菌水和乙酸乙酯提取液對(duì)煙草青枯病菌細(xì)胞形態(tài)的影響

圖 2–A顯示，對(duì)照組中煙草青枯病菌呈短桿狀，兩端鈍圓，并且表面圓潤、清晰、飽滿，形狀規(guī)則；菌體經(jīng)乙醇溶液作用后，形態(tài)與正常菌體無明顯差異(圖2–B)。

圖 2–C是經(jīng)薺菜水提液處理后的煙草青枯病菌，與正常菌體相比，菌體形狀不規(guī)則，表面粗糙，兩端變形，菌體逐漸被溶解、破裂至死亡。圖2–D是經(jīng)薺菜乙酸乙酯提取液處理后的煙草青枯病菌，與正常菌體對(duì)比，菌體形狀不規(guī)則，表面粗糙，破損嚴(yán)重，菌體從中間凹陷，發(fā)生裂解且即將斷裂。

掃描電鏡觀察結(jié)果顯示，薺菜無菌水和乙酸乙酯提取液處理，破壞了煙草青枯病菌的菌體結(jié)構(gòu)，青枯菌菌體發(fā)生裂解。

A 正常生長的煙草青枯病菌；B 薺菜無菌水提液處理后的煙草青枯病菌；C 無水乙醇溶液作用下的煙草青枯病菌；D 薺菜乙酸乙酯提取液處理后的煙草青枯病菌。圖2　煙草青枯病菌的掃描電鏡觀察結(jié)果Fig.2 SEM observation of Ralstonia solannacearum

2.3 薺菜提取液對(duì)煙草青枯病菌生長曲線、糖利用率和蛋白質(zhì)含量的影響

圖3顯示，加入無水乙醇溶液的煙草青枯病菌菌液CK1和加入無菌水的菌液CK2的生長曲線基本一致，說明溶劑本身對(duì)菌液的生長曲線沒有影響。

從變化趨勢看，CK1、CK2和加入水提物、乙酸乙酯提取物處理的煙草青枯病菌的生長都呈上升趨勢，但隨著時(shí)間的變化，加入水提取物和乙酸乙酯提取物的菌液的生長曲線與CK1、CK2相比更為平緩，細(xì)菌生長對(duì)數(shù)期到達(dá)時(shí)期明顯滯后于CK1、CK2。

綜上所述，CK1、CK2的生長速率明顯快于加入水提取物和乙酸乙酯提取物的菌液，說明薺菜水提取物和乙酸乙酯提取物對(duì)煙草青枯病菌的生長有較強(qiáng)的抑制作用，能抑制細(xì)菌的生長和分裂。

圖3　薺菜乙酸乙酯和水提液處理的煙草青枯病菌生長曲線Fig.3 The growth curves of Ralstonia solannacearum treated by ethyl acetate extract and water extract from Capsella bursa-pastoris

圖4顯示，4組不同處理的菌液的含糖量均呈下降趨勢，隨著時(shí)間的變化，在細(xì)菌生長的各個(gè)時(shí)期，CK1和 CK2的菌液含糖量明顯高于加入薺菜水提液、乙酸乙酯提取液處理的煙草青枯病菌菌液。

圖4　薺菜乙酸乙酯和水提液處理的煙草青枯病菌的含糖量Fig.4 The sugar contents of Ralstonia solannacearum treated by ethyl acetate extract and water extract from Capsella bursa-pastoris

綜上所述，加入薺菜水提液和乙酸乙酯提取液處理的煙草青枯病菌在生長過程中，對(duì)糖的利用率降低，可能是由于薺菜提取液具有抑菌作用，抑制細(xì)菌的生長和分裂，導(dǎo)致了細(xì)菌生長過程中糖的利用率降低。

隨著處理時(shí)間的增加，CK1、CK2菌液的蛋白質(zhì)含量不斷降低，而加入薺菜水提液、乙酸乙酯提取液處理的菌液蛋白質(zhì)含量先后逐漸增加。這是由于隨著作用時(shí)間的不斷延長，薺菜水提液和乙酸乙酯提取液破壞了菌體，致使細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)泄入菌液中，使得處理菌液中蛋白質(zhì)含量增加的緣故。

圖5　薺菜乙酸乙酯和水提液處理的煙草青枯病菌的蛋白質(zhì)含量Fig.5 The protein contents of Ralstonia solannacearum treated by ethyl acetate extract and water extract from Capsella bursa-pastoris

3 討論

采用6種溶劑提取薺菜活性物質(zhì)，僅無菌水與乙酸乙酯提取液表現(xiàn)出了抑菌活性，表明溶劑的選擇與活性的表達(dá)相關(guān)，因此，需進(jìn)一步篩選最佳溶劑。無菌水與乙酸乙酯的提取液均表現(xiàn)出了抑菌活性，表明活性物質(zhì)既有水溶性的，也有脂溶性的，這為薺菜活性物質(zhì)進(jìn)一步分離純化提供了參考。薺菜無菌水和乙酸乙酯提取液處理的煙草青枯病菌細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，菌體裂解，生長對(duì)數(shù)期滯后，糖利用能力降低，蛋白質(zhì)含量增高，這些發(fā)現(xiàn)初步表明薺菜提取液具有抑菌功效，其抑菌機(jī)理還需進(jìn)一步研究。

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責(zé)任編輯：羅慧敏

英文編輯：羅 維

Inhibition activity of Capsella bursa-pastoris extracts against Ralstonia solanacearum

Feng Youtao1,2, Xie Yan1,2, Zhang Ya1,2, Liao Xiaolan1,2*
(1.College of Plant Protection, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2. Hunan Provincial Key Laboratory for Biology and Control of Plant Diseases and Insect Pests, Changsha 410128, China)

Abstract:Water, ethyl acetate, anhydrous ethanol and petroleum ether, acetone, methanol were used to extract Capsella bursa-pastoris powder, the inhibitory effects of 6 kinds of solvent extracts on Ralstonia solanacearum were investigated through indoor virulence test , the results showed that only ethyl acetate and water extracts from Capsella bursa-pastoris had antimicrobial activity on Ralstonia solanacearum , the of ethyl acetate extract reached 63.9％, and antibacterial rate of water extract was 28.9％. The influences of water and ethyl acetate extracts on morphology, growth curve,utilization rate of sugar and protein content of Ralstonia solanacearum were investigated by transmission electron microscopy (SEM), wheat flange dividing turbidimetry, anthrone colorimetry, coomassie brilliant blue method .Electron microscopy showed that the structures of cell membrane and cell wall were changed and the bacteria cracked in Ralstonia solanacearum treated with water extract and ethyl acetate extract from Capsella bursa-pastorisof . Ethyl acetate extract and water extract from Capsella bursa-pastoris can make Ralstonia solanacearum logarithmic phase lag, reduce sugar utilization, and increase protein content in Ralstonia solanacearum.

Keywords:Capsella bursa-pastoris extracts; Ralstonia solanacearum; inhibition

中圖分類號(hào)：S435.72

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1007?1032(2016)03?0312?05

收稿日期：2016–03–10 修回日期：2016–04–06

基金項(xiàng)目：公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303025)

作者簡介：馮游滔(1990—)，男，湖南汨羅人，碩士研究生，主要從事植物病害生物防治研究，971820275@qq.com；*通信作者，廖曉蘭，博士，教授，主要從事生防資源的挖掘與利用研究， liaoxl88@126.com