紅麻纖維蒸氣爆破預(yù)處理與酶解糖化條件的優(yōu)化

彭源德，朱作華，謝純良，李智敏，嚴(yán)　理，胡鎮(zhèn)修

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，湖南 長沙 410205)

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紅麻纖維蒸氣爆破預(yù)處理與酶解糖化條件的優(yōu)化

彭源德，朱作華，謝純良，李智敏，嚴(yán)理，胡鎮(zhèn)修

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，湖南 長沙 410205)

摘 要：為探尋適合紅麻纖維蒸氣爆破預(yù)處理與酶解糖化的技術(shù)參數(shù)，開展紅麻纖維氣爆壓力、保壓時間、填料量等蒸氣爆破預(yù)處理技術(shù)參數(shù)研究，并對蒸氣爆破預(yù)處理后的紅麻纖維進(jìn)行浴比、酶解時間、酶種類、酶配比、酶用量等酶解糖化單因子試驗(yàn)與正交試驗(yàn)。結(jié)果表明：紅麻纖維氣爆預(yù)處理以填料量100％、氣爆壓力2.5 MPa、保壓時間240～300 s的效果較好；紅麻纖維酶解糖化的較優(yōu)工藝參數(shù)為浴比(1∶5.00)～(1∶7.50)，纖維素酶和木聚糖酶的配比2∶3，采用混合酶(1.50％纖維素酶+2.250％木聚糖酶)，pH 5.0，糖化率可達(dá)70 ％以上。

關(guān) 鍵 詞：紅麻纖維；纖維質(zhì)；蒸氣爆破；酶降解

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紅麻是一年生草本韌皮纖維作物，其適應(yīng)性廣，生育期短，產(chǎn)量高，可以用于生產(chǎn)燃料乙醇。在利用紅麻等纖維質(zhì)生產(chǎn)燃料乙醇的過程中，需對原材料進(jìn)行預(yù)處理[1–3]。目前，常用的纖維質(zhì)原料預(yù)處理方法有物理法、化學(xué)法、物理化學(xué)法和生物法等[4–8]。稀 H2SO4法、燒堿法、亞硫酸鹽法等化學(xué)法預(yù)處理雖然效果較好，但存在成本較高、污染環(huán)境以及腐蝕設(shè)備等問題；因此，篩選成本低、得率高的物理法預(yù)處理技術(shù)，對降低纖維乙醇的成本意義重大。有研究[9]表明，蒸氣爆破預(yù)處理能有效地破壞木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)，降解部分半纖維素，提高纖維素的酶解發(fā)酵性能，且成本相對較低，是最接近工業(yè)化的預(yù)處理方法。目前，利用蒸氣爆破技術(shù)對紅麻纖維進(jìn)行預(yù)處理的技術(shù)仍不太成熟。筆者在苧麻[10–11]、蘆葦[12]等纖維質(zhì)酶降解生產(chǎn)燃料乙醇的工藝基礎(chǔ)上，采用蒸氣爆破預(yù)處理和酶降解糖化工藝，探索適合紅麻纖維蒸氣爆破預(yù)處理與酶降解糖化的技術(shù)參數(shù)，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試紅麻纖維由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所一年生麻類作物遺傳改良團(tuán)隊(duì)提供。紅麻韌皮經(jīng)天然水浸脫膠、清洗和自然風(fēng)干，備用。纖維素酶和木聚糖酶由湖南尤特爾生化有限公司提供，酶活力分別為2 000 U/mL和5 000 U/mL。硫酸、氫氧化鈉、葡萄糖、酒石酸鉀鈉、3，5–二硝基水楊酸(dinitrosalicylic acid，DNS)等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

主要供試儀器與設(shè)備：UX6200H電子天平(日本島津公司)；Mettler ToledoDelta 320型精密pH計(jì)(瑞士梅特勒–托利多公司)；756型紫外可見分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司)；RH–Q型恒溫?fù)u床(金壇榮華儀器制造有限公司)；移液器(德國EPPENDORF公司)；YXQ–LS–50SⅡ高壓滅菌鍋(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)；QB–200蒸氣爆破機(jī)(鶴壁市正道重機(jī)廠)。

1.3 蒸氣爆破預(yù)處理試驗(yàn)

1.3.1 氣爆壓力和保壓時間的篩選

稱取30 g紅麻纖維，分別在氣爆壓力為0.0 (對照)、1.5、2.0、2.5、3.0 MPa，保持壓力時間0(對照)、60、120、180、240、300、360 s的條件下進(jìn)行蒸氣爆破預(yù)處理。3次重復(fù)。稱取15 g氣爆后的紅麻纖維，按1∶15的浴比加入自來水，調(diào)pH值為5.0，加纖維素酶0.5 mL和木聚糖酶0.5 mL，在溫度49～51 ℃，轉(zhuǎn)速150 r/min條件下酶解20 h，測定還原糖質(zhì)量濃度。

1.3.2 原料填充量的篩選

在填充量分別為 62.5％、75％、87.5％、100％時進(jìn)行氣爆處理，氣爆壓力 2.5 MPa，保壓時間240～300 s。3次重復(fù)。按1.3.1中的方法對氣爆后的紅麻纖維進(jìn)行還原糖質(zhì)量濃度測定。

1.4 紅麻纖維酶降解糖化單因子試驗(yàn)

稱取10 g紅麻纖維，置于300 mL錐形瓶中，加水約150 mL(浴比1∶15)，調(diào)pH值為5.0～6.0，纖維素酶UTA和木聚糖酶HF各加0.5 mL，在溫度49～51 ℃，轉(zhuǎn)速150 r/min條件下酶解20 h。3次重復(fù)。單因子試驗(yàn)考察浴比、酶解時間、酶配比和酶用量等對紅麻纖維酶解糖化的效果。

1) 不同浴比對紅麻纖維糖化效果的影響。分別設(shè)置紅麻纖維(W)與懸浮液(V)的比率為 1∶3.75、1∶5.00、1∶6.25、1∶7.50、1∶8.75、1∶10.00、1∶12.50和 1∶15.00。酶解完成后測定液體中還原糖質(zhì)量濃度。

2) 不同酶解時間對紅麻纖維糖化的影響。分別在紅麻纖維酶解糖化8、12、16、20、24 h后，取糖化液測定還原糖質(zhì)量濃度。

3) 不同酶配比對紅麻纖維糖化的影響。分別設(shè)纖維素酶UTA和木聚糖酶HF配比為100％∶0、80％∶20％、60％∶40％、40％∶60％、20％∶80％、0∶100％，酶總用量占原料的比率為1％。酶解完成后測定液體中還原糖質(zhì)量濃度。

4) 不同酶用量對紅麻纖維糖化的影響。分別設(shè)置單一的纖維素酶和木聚糖酶的用量(占原料的質(zhì)量百分比)為0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％ 及2.0％纖維素酶+0.5％木聚糖酶等處理，酶解完成時測定液體中還原糖質(zhì)量濃度。在纖維素酶和木聚糖酶的配比為 2∶3條件下，分別設(shè)置混合酶用量(占原料的比率)為 0.50％纖維素酶+0.750 ％木聚糖酶、1.00％纖維素酶+1.500％木聚糖酶、1.50％纖維素酶+2.250 ％木聚糖酶、2.00％纖維素酶+3.000％木聚糖酶和2.50 ％纖維素酶+ 3.750％木聚糖酶等處理。酶解完成后測定液體中還原糖質(zhì)量濃度。

1.5 酶降解糖化多因子（正交）試驗(yàn)

在浴比1∶6.25、酶解溫度50 ℃和酶解時間20 h條件下，對蒸氣爆破預(yù)處理后的紅麻進(jìn)行酶種類、酶配比、酶濃度、pH值四因素三水平正交試驗(yàn)(表1)。

表1　紅麻纖維酶降解正交試驗(yàn)的因素及水平Table 1 Factors and levels of the enzymatic degradation orthogonal tests

1.6 測定方法

還原糖采用DNS比色定糖法(540 nm) 測定；pH值用PHS–3C型酸度計(jì)測定；酸性纖維素酶活性采用CMC法測定；木聚糖酶酶活采用DNS法測定，底物為Sigma公司生產(chǎn)的木聚糖。

S=M·V/W。式中：S為酶解糖化率(％)；M為酶解液還原糖質(zhì)量濃度(mg/mL)；V為酶解液體積(mL)；W為紅麻纖維質(zhì)量(mg)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒸氣爆破預(yù)處理參數(shù)的優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 蒸氣爆破壓力和保壓時間的確定

蒸氣爆破處理后原料的形態(tài)(圖 1)發(fā)生了較大變化。在爆破壓力1.5 MPa、保壓時間180 s處理后，紅麻纖維開始有明顯的斷裂；經(jīng)爆破壓力3.0 MPa、保壓時間180 s處理后，紅麻纖維斷裂成小段和碎末。從圖2可以看出，隨著爆破壓力的升高，紅麻纖維的糖化率增加，而未經(jīng)蒸氣爆破處理的紅麻纖維的酶解糖化效果較差，糖化率僅為2.56％。從表2可以看出，保壓時間的延遲有助于還原糖質(zhì)量濃度的增加。當(dāng)蒸氣爆破壓力為2.5 MPa和保壓時間為240～300 s時，液體中還原糖質(zhì)量濃度最高，超過30 mg/mL，糖化率超過80％。

圖左為未經(jīng)蒸氣爆破處理的紅麻纖維；圖右為經(jīng)過蒸氣爆破處理的紅麻纖維。圖1　紅麻蒸氣爆破預(yù)處理效果Fig.1 Effectiveness of kenaf lignocellulose under steam explosion pretreatment

圖2　不同氣爆壓力下紅麻纖維的酶解糖化率Fig.2 The effect of different pressure to enzymatic degradation of kenaf lignocellulose

表2　不同保壓時間下紅麻纖維的糖化率和還原糖質(zhì)量濃度Table 2 Saccharification yield and reducing sugar concentration of kenaf lignocellulose enzymolysis at different holding time

2.1.2 原料填充量的確定

從原料填充量對蒸氣爆破預(yù)處理紅麻糖化的影響看出，填充量對紅麻氣爆預(yù)處理影響不顯著，填料量 100％時糖化率最高，氣爆后原料糖化率為68.80％(表3)。

表3　不同填充量下紅麻纖維酶解的糖化率和還原糖質(zhì)量濃度Table 3 Saccharification yield and reducing sugar concentration of kenaf lignocellulose enzymolysis at different filling volume

2.2 紅麻纖維酶降解糖化單因子試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 浴比的確定

不同浴比對紅麻纖維酶解糖化的影響結(jié)果(表4)表明，隨著浴比的增大，還原糖質(zhì)量濃度逐漸降低，而糖化率逐漸增大，至浴比為1∶7.50時，糖化率基本保持穩(wěn)定。浴比定在(1∶5.00)～(1∶7.50)較為合適。

表4　不同浴比下紅麻纖維酶解的糖化率和還原糖質(zhì)量濃度Table 4 Saccharification yield and reducing sugar concentration of kenaf fiber enzymolysis at different liquor ratio

2.2.2 酶解時間的確定

從酶解時間對紅麻纖維糖化的影響結(jié)果(表 5)可以看出，隨著酶解時間的延長，還原糖質(zhì)量濃度和糖化率都逐漸增加。酶解時間達(dá)到或超過 20 h后，還原糖質(zhì)量濃度和糖化率都基本穩(wěn)定，糖化率達(dá)到70％左右。為了加快酶解周期，降低生產(chǎn)成本，確定適宜的酶解時間為20 h。

表 5 不同酶解時間下紅麻纖維的酶解糖化率和還原糖質(zhì)量濃度Table 5 Saccharification yield and reducing sugar concentration of kenaf fiber enzymolysis at different enzyme digestion time

2.2.3 酶配比的確定

酶配比對紅麻纖維糖化的影響結(jié)果(表6)表明，在酶總用量為 1％時，混合酶的處理效果優(yōu)于單種酶的酶解效果，纖維素酶與木聚糖酶配比以40％∶60％(2∶3)和20％∶80％(1∶4)的效果較好。

表6　不同酶配比下紅麻纖維的還原糖質(zhì)量濃度Table 6 Reducing sugar concentration kenaf fiber at different enzyme proportion

2.2.4 酶用量的確定

從單一酶用量對紅麻糖化的影響效果(圖 3和圖4)可以看出，纖維素酶和木聚糖酶的用量直接影響紅麻的降解速度及糖化率。隨著纖維素酶和木聚糖酶用量的增加，糖化液中還原糖濃度均呈增加趨勢；單種纖維素酶或木聚糖酶酶解糖化效果均不如復(fù)合酶的降解效果好。

圖3　不同纖維素酶用量下紅麻纖維的酶解糖化率和還原糖質(zhì)量濃度Fig.3 Saccharification yield and reducing sugar concentration of kenaf fiber enzymolysis at different cellulase dosage

圖4　不同木聚糖酶用量下紅麻纖維的酶解糖化率和還原糖質(zhì)量濃度Fig.4 Saccharification yield and reducing sugar concentration of kenaf fiber at different xylanase dosage

隨著混合酶用量的增加，糖化液中還原糖質(zhì)量濃度呈增加的趨勢(表7)，混合酶用量增加至1.50％纖維素酶和2.250％木聚糖酶后，還原糖質(zhì)量濃度增加緩慢。從減少酶成本及酶制劑本身還原糖濃度的影響考慮，混合酶用量以分別添加2.00％纖維素酶和3.00％木聚糖酶較為合適。

表7　不同混合酶用量下紅麻纖維酶解的還原糖質(zhì)量濃度Table 7 Reducing sugar concentration kenaf fiber at different mixed enzymatic dosage

2.3 紅麻纖維酶解糖化正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果如表8所示。酶種類、酶濃度、pH值和酶配比等4個因素對紅麻纖維酶解糖化的影響程度從高到低依次為酶種類、酶濃度、酶配比、pH值。方差分析顯示，在α＝0.1水平上，上述4個因素對紅麻纖維酶解的糖化效果都不顯著。根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，優(yōu)化的酶種類、酶配比、酶濃度和pH值等酶解工藝參數(shù)分別為：采用混合酶(纖維素酶+木聚糖酶)；纖維素酶與木聚糖酶的配比為2∶3；纖維素酶和木聚糖酶的用量分別為1.50 ％、2.250 ％；pH值 5.0。這與單因子試驗(yàn)的結(jié)果基本一致。

表8　酶降解糖化正交試驗(yàn)的結(jié)果Table 8 Orthogonal experiment results of enzymatic degradation of kenaf lignocellulose

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明：紅麻纖維蒸氣爆破預(yù)處理以填料量100％、氣爆壓力2.5 MPa、保壓240～300 s為宜；紅麻纖維酶解糖化工藝參數(shù)以浴比(1∶5.00)～ (1∶7.50)，纖維素酶和木聚糖酶的配比為2∶3，纖維素酶、木聚糖酶的用量分別為1.50％、2.250％；pH 5.0。試驗(yàn)的糖化率達(dá)70％以上。

郭芬芬等[13]研究表明，苧麻稈和紅麻稈在170 ℃下經(jīng)4％NaOH 和0.02％ 蒽醌–2–磺酸鈉鹽(AQSS)處理1 h，糖化率分別為77％ 和79％；紅麻稈在170 ℃下經(jīng)5.2％ NaHSO3和0.2％ H2SO4處理1 h，糖化率為72％。由此可以看出，本研究中的蒸氣爆破預(yù)處理效果與酸、堿預(yù)處理效果相當(dāng)。

蒸氣爆破處理過程中，高溫蒸氣滲入纖維內(nèi)部，使纖維發(fā)生一定的機(jī)械斷裂，同時高溫、高壓加劇了纖維素內(nèi)部氫鍵的破壞和有序結(jié)構(gòu)的變化，增加纖維素的吸附能力，促進(jìn)半纖維素的水解和木質(zhì)素的轉(zhuǎn)化。蒸氣爆破法的優(yōu)點(diǎn)是能耗低，可間歇操作，也可連續(xù)操作，主要適合于硬木原料和農(nóng)作物秸稈的預(yù)處理。利用該技術(shù)對甘蔗渣進(jìn)行預(yù)處理，酶解率提高4倍以上[14]；對玉米秸稈進(jìn)行預(yù)處理，酶解得率可達(dá)70.0％[15]。本試驗(yàn)中紅麻纖維酶解糖化率達(dá)70％以上，表明該技術(shù)用于紅麻纖維的預(yù)處理是可行的。

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責(zé)任編輯：蘇愛華

英文編輯：梁 和

Studies on the steam explosion pretreatment and enzymatic saccharification of kenaf fiber

Peng Yuande, Zhu Zuohua, Xie Chunliang, Li Zhimin, Yan Li, Hu Zhenxiu
(Institute of Bast Fiber Crops, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Changsha 410205, China)

Abstract:To study the steam explosion pretreatment and enzymatic saccharification technical parameters of kenaf fiber, the steam explosion pressure, pressuring time and filler amount of steam explosion were determined and the effects of bath ratio, enzymolysis time, enzyme type, enzyme dosage and enzyme ratio on enzymatic saccharification were analyzed by single factor and orthogonal experiments. The results showed that the optimum pretreatment parameters of steam explosion were as follow: packing volume 100％, steam explosion pressure 2.5 MPa, pressure holding time 240–300 s. The enzymatic saccharification parameters were as follow: bath ratio of (1∶5.00) – (1∶7.50), cellulose and xylanase ratio of 2∶3. With the mixed enzymes (1.50％ cellulose+2.250％ xylanase) and pH5.0, the saccharification rate was above 70％.

Keywords:kenaf fiber; lignocelluloses; steam explosion; enzymatic degradation

中圖分類號：S129；S216.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1007?1032(2016)03?0334?05

收稿日期：2015–07–16 修回日期：2016–03–20

基金項(xiàng)目：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(CARS–19–E26)；中央駐湘科研機(jī)構(gòu)技術(shù)創(chuàng)新發(fā)展專項(xiàng)(2013TF3005)；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目(CAAS–ASTIP)

作者簡介：彭源德(1965—)，男，湖南新邵人，研究員，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工微生物遺傳改良與應(yīng)用研究，ibfcpyd313@126.com