HGF-cMet拮抗劑NK4增強(qiáng)肝癌細(xì)胞Li-7對(duì)5-FU的敏感性

姜蓬壘 張 棟 李美寧 常冰梅（山西醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，山西 太原 030001）

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HGF-cMet拮抗劑NK4增強(qiáng)肝癌細(xì)胞Li-7對(duì)5-FU的敏感性

姜蓬壘 張 棟 李美寧 常冰梅*
（山西醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，山西 太原 030001）

【摘要】目的 探索肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Hepatocyte growth factor，HGF）對(duì)肝癌細(xì)胞Li-7增殖及對(duì)化療藥物5-FU耐受的影響；研究利用HGF拮抗劑-NK4增強(qiáng)Li-7細(xì)胞在HGF存在的情況下對(duì)5-FU的敏感性的影響。方法 將前期構(gòu)建的真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-NK4、pcDNA3.1分別轉(zhuǎn)染至Li-7細(xì)胞中。MTT法檢測(cè)不同濃度（0、0.2、2、20 ng/mL）HGF對(duì)Li-7細(xì)胞增殖的影響；確證HGF是否會(huì)誘導(dǎo)Li-7對(duì)5-FU產(chǎn)生耐受；檢測(cè)在HGF、5-FU的干預(yù)下，未轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染pcDNA3.1組、轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-NK4組的Li-7細(xì)胞生存率的差異。結(jié)果 在HGF的刺激下，Li-7的存活率沒(méi)有明顯變化（P＞0.05）。但HGF（20 ng/mL）、5-FU（50 μg/mL）共同處理與5-FU單獨(dú)處理相比，細(xì)胞存活率明顯提升（P＜0.01）。在HGF（20 ng/mL）與不同濃度的5-FU（0、5、50、500 μg/mL）的干預(yù)下，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-NK4組與轉(zhuǎn)染pcDNA3.1組的Li-7細(xì)胞相比細(xì)胞生存率都明顯降低（P＜0.05）。結(jié)論 HGF可以誘導(dǎo)Li-7產(chǎn)生耐藥性，而NK4能夠減弱HGF 對(duì)Li-7細(xì)胞的刺激，增強(qiáng)5-FU對(duì)Li-7的增殖抑制作用。

【關(guān)鍵詞】肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子；NK4；5-FU；藥物耐受

HGF參與了多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移［1］。c-MET作為HGF的細(xì)胞膜表面受體，在HGF的作用下磷酸化激活，而后活化的c-MET再激活其下游多條關(guān)鍵的信號(hào)通路，產(chǎn)生促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移及抗凋亡的生物學(xué)效應(yīng)［1-2］。NK4是包含了HGF N-末端的發(fā)卡結(jié)構(gòu)域和后面的4個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)域的HGF片段，它可以競(jìng)爭(zhēng)性的抑制HGF對(duì)細(xì)胞的刺激［3］。HGF的過(guò)表達(dá)常導(dǎo)致腫瘤產(chǎn)生藥物耐受［1］，因此將NK4和化療藥物聯(lián)合起來(lái)抑制腫瘤生長(zhǎng)似乎成為了一個(gè)較為理想的手段。本文首先探索HGF對(duì)Li-7增殖、耐藥的影響，然后再嘗試?yán)肗K4增強(qiáng)Li-7細(xì)胞在HGF存在的情況下對(duì)5-FU的敏感性。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株以及細(xì)胞株：pcDNA3.1-NK4質(zhì)粒、pcDNA3.1質(zhì)粒、大腸桿菌DH5α、肝癌細(xì)胞株Li-7由本室構(gòu)建或保存。

1.2 主要試劑：HGF購(gòu)自PeproTech公司；5-FU；胰蛋白胨、瓊脂、酵母粉購(gòu)自O(shè)XOID公司；NaCl購(gòu)自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；PBS購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Endo Free Plasmid Mini KitⅠ購(gòu)自O(shè)MEGA公司；1640培養(yǎng)液購(gòu)自Hyclone公司；氨芐青霉素、青霉素鏈霉素混合液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程有限公司；胰蛋白酶購(gòu)自AMERSCO公司；DMSO、MTT購(gòu)自AMERSCO公司；Lip2000、Annexin V-FITC/PI雙染流式檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司。

1.3 質(zhì)粒提取：將攜帶有pCDNA3.1/NK4和pCDNA3.1質(zhì)粒的DH5α菌種接種于LB/氨芐青霉素液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)12～16 h。按照質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書提取質(zhì)粒。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Li-7細(xì)胞接種在6孔板中，待匯合度達(dá)到50%～60%時(shí)棄去培養(yǎng)液，PBS清洗兩遍，加入預(yù)熱至37 ℃無(wú)血清、抗生素的1640完全培養(yǎng)液。按照Lip2000說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，6 h后更換為含10%FBS的1640完全培養(yǎng)液。24 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率：選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期或者轉(zhuǎn)染后的Li-7細(xì)胞，消化后制成單細(xì)胞懸液，按照1×104個(gè)/孔接種至96孔板中。24 h后更換為含有藥物、10%的胎牛血清的1640完全培養(yǎng)液，在37 ℃、5%CO2，飽和濕度的條件下培養(yǎng)48 h。每孔加入MTT溶液20 μL，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育3 h。小心吸取培養(yǎng)基，每孔加入150 μL的DMSO，在搖床上震蕩約20 min。選擇490 nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上檢測(cè)各孔吸光值。每組5個(gè)平行孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。根據(jù)下面的公式計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組的存活率：存活率=（實(shí)驗(yàn)組OD-空白組OD）/（對(duì)照組OD-空白組OD）1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以表示，統(tǒng)計(jì)分析采用one way ANOVA。用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HGF對(duì)Li-7增殖的影響：見(jiàn)圖1。以不同濃度（0、0.2、2、20 ng/mL）的HGF刺激Li-7細(xì)胞48 h后，用MTT法檢測(cè)HGF對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響。如圖1所示，各濃度的HGF對(duì)Li-7細(xì)胞的增殖能力影響不大，當(dāng)HGF濃度為20 ng/mL時(shí)，細(xì)胞的存活率也只有104.9%±3.2%，與對(duì)照相比差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 HGF對(duì)Li-7增殖能力的影響

2.2 HGF誘導(dǎo)Li-7對(duì)5-FU產(chǎn)生耐受：見(jiàn)圖2。當(dāng)HGF濃度為0.2 ng/mL或2 ng/mL時(shí)，HGF與5-FU（50 μg/mL）共同處理組的細(xì)胞存活率與單加5-FU組的細(xì)胞存活率相比，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；當(dāng)HGF濃度達(dá)到20 ng/mL時(shí)，共同處理組與單加5-FU組相比，細(xì)胞存活率提高了15.8%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。即此時(shí)Li-7表現(xiàn)出較高的藥物耐受。選擇20 ng/mL的HGF濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 HGF誘導(dǎo)Li-7對(duì)5-FU產(chǎn)生耐受

2.3 NK4逆轉(zhuǎn)HGF導(dǎo)致的化療耐受：見(jiàn)圖3。不同濃度的5-FU處理后，轉(zhuǎn)染有NK4基因的細(xì)胞與轉(zhuǎn)染有空載質(zhì)粒的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染有NK4基因的細(xì)胞的存活率均有不同程度的下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 NK4抑制HGF誘導(dǎo)的藥物耐受

3 討 論

HGF對(duì)于多數(shù)類型的腫瘤細(xì)胞來(lái)說(shuō)都具有促增殖、侵襲、遷移的作用，但是它對(duì)于很多肝癌細(xì)胞來(lái)說(shuō)，它又具有了雙重作用：一方面，HGF促進(jìn)了肝癌細(xì)胞HepG2、Huh7等細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性；另一方面，HGF又抑制了這些細(xì)胞的增殖［4］。本研究發(fā)現(xiàn)，HGF對(duì)Li-7細(xì)胞的增殖無(wú)明顯影響。這表明多功能的細(xì)胞因子HGF對(duì)于不同的肝癌細(xì)胞株表現(xiàn)出不同的生物學(xué)效應(yīng)。

HGF/c-MET信號(hào)通路具有促增殖、抗凋亡的作用，從而使細(xì)胞受到化療藥物的傷害減少，導(dǎo)致了耐藥性的產(chǎn)生［1］。已經(jīng)有大量的研究表明HGF能夠誘導(dǎo)多種類型的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，但是目前僅有關(guān)于HGF可以引起肝癌細(xì)胞HEP3B產(chǎn)生耐藥性的報(bào)道［5］。通過(guò)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)低濃度的HGF并沒(méi)有影響Li-7細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性，但是將HGF的濃度提高到20 ng/mL之后，細(xì)胞的存活率明顯提高，這說(shuō)明高濃度的HGF可以誘導(dǎo)Li-7耐藥性的產(chǎn)生。

在以前的研究中，NK4只是被用來(lái)抑制HGF誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞侵襲、遷移等［6］，因此在發(fā)現(xiàn)HGF可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞Li-7耐藥之后，我們也嘗試?yán)肗K4逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞耐藥。細(xì)胞增殖結(jié)果顯示，在HGF與5-FU的共同作用下，轉(zhuǎn)染有NK4基因的Li-7細(xì)胞存活率與轉(zhuǎn)染有空載質(zhì)粒的Li-7細(xì)胞存活率相比明顯降低。這說(shuō)明NK4有效的減弱了HGF對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用，增強(qiáng)了Li-7對(duì)5-FU的敏感性。

本研究發(fā)現(xiàn)HGF可以誘導(dǎo)Li-7細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)5-FU的耐藥性，而利用NK4可以減弱HGF對(duì)Li-7細(xì)胞促生存、抗凋亡的作用，逆轉(zhuǎn)耐藥性。這提示有望利用NK4基因針對(duì)肝癌患者進(jìn)行基因靶向治療，為肝癌治療提供新策略和新方法。

參考文獻(xiàn)

［1］ Jiang WG，Martin TA，Parr C，et al.Hepatocyte growth factor，its receptor，and their potential value in cancer therapies［J］.Crit Rev Oncol Hematol，2005，53（1）:35-69.

［2］ You H，Ding W，Dang H，et al.c-Met represents a potential therapeutic target for personalized treatment in hepatocellular carcinoma［J］.Hepatology，2011，54（3）:879-89.

［3］ Datea K，Shimurab H，Tanakab M，et al.HGF/NK4 is a specific antagonist for pleiotrophic actions of hepatocyte growth factor［J］. FEBS Lett，1997，420（1）:1-6.

［4］ Giordano S，Columbano A.Met as a therapeutic target in HCC: facts and hopes［J］.J Hepatol，2014，60（2）:442-52.

［5］ Yu G，Jing Y，Kou X，et al.Hepatic stellate cells secreted hepatocyte growth factor contributes to the chemoresistance of hepatocellular carcinoma［J］.PloS One，2013，8（9）:e73312.

［6］ Heideman DA，Overmeer RM，van Beusechem VW，et al.Inhibition of angiogenesis and HGF-cMET-elicited malignant processes in human hepatocellular carcinoma cells using adenoviral vector-mediated NK4 gene therapy［J］.Cancer Gene Ther，2005，12（12）:954-962.

中圖分類號(hào)：R735.7

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1671-8194（2016）10-0043-02

*通訊作者：E-mail：cbmcn@163.com