牛病細菌分離鑒定及藥物敏感性試驗

胡東方 程子龍 劉 朋 肖一紅 屈亞錦 劉思當（山東農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院 山東 泰安 271000）

?

試驗研究

牛病細菌分離鑒定及藥物敏感性試驗

胡東方 程子龍 劉 朋 肖一紅 屈亞錦 劉思當*
（山東農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院 山東 泰安 271000）

摘要本文就接診的牛細菌性呼吸道病例采集的117份奶樣進行了實驗室分離鑒定和藥敏試驗，結(jié)果表明，牛病常見致病菌的多重耐藥現(xiàn)象較為普遍，僅有少數(shù)幾種藥物，如頭孢類及喹諾酮類藥物能夠發(fā)揮有效抗菌作用。

關鍵詞牛病 細菌分離 鑒定 藥敏試驗

近年來，隨著經(jīng)濟的發(fā)展及居民生活水平的提高，民眾對肉、奶的消費水平也越來越高，這在很大程度上促進了養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展。但是頻繁的犢牛貿(mào)易、流動以及越來越大的規(guī)?；龀霈F(xiàn)使得牛細菌性疾病呈現(xiàn)出一些新的流行特點，細菌性疾病成為影響?zhàn)B牛業(yè)發(fā)展的主要因素，如何高效防控牛病成為養(yǎng)牛業(yè)的一大難題。據(jù)調(diào)查，當前除牛布氏桿菌病、結(jié)核病、副結(jié)核病等需要檢測凈化的疾病外，由巴氏桿菌、鏈球菌、葡萄球菌、大腸桿菌及沙門氏菌等引起的運輸熱、乳房炎、腹瀉等也成為影響?zhàn)B牛業(yè)發(fā)展的重要疾?。?，2］。在當前細菌耐藥性普遍及食品安全問題頻出的背景下，要想準確、高效地對牛常發(fā)細菌病進行診斷和防控，必須依賴實驗室進行細菌分離鑒定和藥物敏感試驗。本文就接診的牛細菌病病例的實驗室診斷及藥敏試驗進行總結(jié)，希望能為牛場常見細菌性疾病的病原學研究及藥物防治提供理論依據(jù)和防控思路。

1 材料與方法

1.1 材料

2014年4月至2015年10月間接診山東各地70余個牛場的呼吸道病及犢牛腹瀉病例，并采集奶樣117份。

1.2 方法

對疑似細菌病病例進行實驗室綜合診斷和藥敏試驗，并針對性地提出了防控方案。

2 結(jié)果

2.1 牛巴氏桿菌病

牛巴氏桿菌病是由多殺性巴氏桿菌引起的一種敗血性傳染病，臨床上以高熱、肺炎或急性胃腸炎并發(fā)多器官廣泛性出血為主要特征［3］。巴氏桿菌為革蘭氏陰性菌，用堿性美蘭染色血涂片或組織觸片后可發(fā)現(xiàn)兩端深染的短桿菌。一般認為該菌為條件性致病菌，平時即大量寄生在牛的上呼吸道黏膜和消化道黏膜上，當機體受到各種應激因素刺激后而導致抵抗力下降時，該菌便可乘虛而入，經(jīng)血液循環(huán)遍布全身多個組織器官而發(fā)生內(nèi)源性感染和發(fā)病［4］。之前一般認為牛運輸熱的發(fā)生與多殺性巴氏桿菌的感染直接相關，但最近研究發(fā)現(xiàn)，牛運輸熱的發(fā)生是由多種病原微生物感染引起的以高熱、間質(zhì)性及大葉性肺炎為主的一種應激性綜合征，當然，巴氏桿菌在該病的發(fā)生中起到重要作用。

2.1.1 臨床癥狀和病理變化 病牛呈精神沉郁、目光呆滯、離群獨處、食欲廢絕、反芻減少或停止，體溫38.9～40.8℃，嚴重的患牛抽搐后死亡。剖檢可見病牛肺臟高度腫脹，呈暗紅色實變、質(zhì)度較硬（圖1），肺切面小葉間隔水腫、增寬；氣管環(huán)充血、氣管內(nèi)有泡沫樣液體（圖2）；肝臟暗紅色淤血腫脹、質(zhì)脆；腸黏膜、腸漿膜均見有彌散性出血斑點，腸黏膜脫落；胃黏膜有彌漫性出血。

圖1 病牛肺臟暗紅色實變、肺小葉間隔增寬

圖2 病牛氣管環(huán)充血、管腔內(nèi)有大量泡沫性液體

2.1.2 實驗室診斷（1）細菌分離與純培養(yǎng)：無菌條件下從病牛肺臟、喉頭中分離病料劃線接種于綿羊血瓊脂平板，倒置放在37℃培養(yǎng)箱中24h后，可見在血平板上形成灰白色濕潤而黏稠菌落，無溶血現(xiàn)象。在45°折光下，呈現(xiàn)鮮明的藍綠色并帶金屬光澤，邊緣有狹窄的紅黃色帶。（2）菌落鑒定：挑取單個菌落、涂片，干燥后經(jīng)瑞氏染色，鏡下可見兩極著色的短桿菌（圖3）；經(jīng)革蘭氏染色可見呈革蘭氏陰性的短桿菌（圖4）。（3）細菌生化試驗：分離培養(yǎng)物在進行生化鑒定前需要先檢查培養(yǎng)物的純度。將菌株分別劃線接種血平板，37℃培養(yǎng)24h后觀察。如劃線平板上生長的菌落分布均勻，有可供觀察的一定數(shù)量的單個菌落，通過不同光角度觀察和比較菌落的一致性。如菌落形態(tài)特征一致，可作為鑒定用菌株；若菌落特征不一致，則需要繼續(xù)進行劃線培養(yǎng)，直至菌落形態(tài)一致或80%以上菌落一致即可。菌落形態(tài)特征一致的菌落，先進行涂片和革蘭氏染色，鏡檢特征為革蘭氏陰性短桿菌后方可進行生化鑒定。生化鑒定可進行如下項目的測定：葡萄糖、果糖、甘露醇、麥芽糖、乳糖、吲哚、VP等，按照說明進行試驗。巴氏桿菌能夠發(fā)酵葡萄糖、果糖及甘露醇；不發(fā)酵麥芽糖、乳糖；吲哚試驗陽性；VP試驗陰性。（4）巴氏桿菌PCR檢測：根據(jù)GenBank公布的序列設計特異性引物，上游：ATCCGCT ATTTACCCAGTGG；下游：GCTGTAAACGAACTCGC CAC，擴增片段長度457bp［5］。用接種環(huán)挑取單菌落，均勻混于含50μl無菌水的離心管中，置于100℃水浴中煮5～10min，然后迅速置于冰上冷卻5min，10000rpm離心2min，上清即為PCR模板。按照常規(guī)PCR體系和反應條件（退火溫度56℃）進行PCR擴增。（5）藥敏試驗：藥敏試驗可用紙片擴散法和梯度稀釋法進行，目前常用較為經(jīng)濟、簡便的紙片法（K-B法）。挑取已鑒定好的巴氏桿菌單菌落，接種于肉湯培養(yǎng)基中增菌培養(yǎng)（37℃，16～24h）。比濁法計數(shù)后，用培養(yǎng)基稀釋至3×109個/ml［4］。用滅菌棉拭子蘸取稀釋后的菌液均勻涂抹于血平板（或吸取30μl菌液至平板上，用滅菌L棒均勻涂滿平板），待菌液吸收后，按照圖5所示貼藥敏紙片（每兩個紙片的中心間距應不低于24mm）。將貼完藥敏紙片的平皿置于37℃溫箱中倒置培養(yǎng)16～24h后觀察結(jié)果。根據(jù)抑菌圈直徑判斷細菌對藥物的敏感性。

圖3 瑞氏染色可見巴氏桿菌為兩極深染的短桿菌

圖4 革蘭氏染色　為陰性短桿菌

圖5 直徑9cm平板貼藥敏片示意圖

經(jīng)分離培養(yǎng)及鑒定，共從28份疑似病料中分離得到16株巴氏桿菌，對這16株分離菌進行了以下藥物的藥敏試驗：強力霉素、四環(huán)素、慶大霉素、環(huán)丙沙星、卡那霉素、丁胺卡那霉素、氟苯尼考。藥敏試驗結(jié)果如表1所示。

表1 巴氏桿菌藥物敏感情況 （%）

2.2 奶牛乳房炎

奶牛乳房炎是由物理、化學或微生物等因素刺激奶牛乳腺而引發(fā)的一種炎癥反應，其中多種病原微生物如葡萄球菌、鏈球菌及大腸桿菌等細菌的感染是引起該病的主要原因。該病已經(jīng)成為危害世界奶牛養(yǎng)殖業(yè)的主要疾病之一［6］。據(jù)世界奶牛協(xié)會統(tǒng)計，該病在多個國家和地區(qū)普遍發(fā)生，世界范圍內(nèi)的發(fā)病率高達50%，中國奶牛隱性乳房炎的陽性率介于46.4%～85.7%之間［7，8］。當前，主要采取抗生素療法對該病進行防治，由于臨床治療過程中存在盲目使用、大劑量或長時間使用抗生素等諸多問題，致使療效較差及耐藥菌株不斷增加，非但提高養(yǎng)殖成本、不利于奶牛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，還會通過殘留在乳中的抗菌藥物威脅人類健康［9］。因此，及時準確地掌握奶牛乳房炎相關病原的種類及藥物敏感性，將有助于指導臨床合理用藥及提高該病的防治效果，對乳房炎相關致病菌的耐藥性研究也大有裨益。

2.2.1 奶樣采集 從山東地區(qū)共采集奶樣117份，樣品為臨床型或亞臨床型乳房炎（根據(jù)SMT檢測結(jié)果而篩選的）患牛奶樣。人工擠奶，采樣前對奶牛乳房及擠奶工雙手進行消毒，手工擠去前3把奶，而后將奶擠至滅菌的10ml離心管中，標記后冰浴中運送至實驗室待檢。送檢的奶樣短時間保存于4℃冰箱中，并在12h內(nèi)開展細菌分離工作。

2.2.2 細菌分離與純培養(yǎng) 將無菌采集的奶樣搖勻后，分別取0.1ml接種于綿羊血瓊脂平板及伊紅美藍瓊脂平板中，用滅菌L棒涂布均勻。將涂布后的平板倒置放于37℃溫箱中培養(yǎng)24h后進行菌落形態(tài)觀察，并對可疑菌落進行涂片、革蘭氏染色及鏡檢。金黃色葡萄球菌在血平板上的菌落形態(tài)為黃色或白色大菌落，周圍有完全透明溶血圈（圖6）；挑取疑似菌落革蘭氏染色后，鏡檢可見革蘭氏陽性、排列成葡萄串樣或短鏈簇狀的球菌；將疑似金黃色葡萄球菌菌落接種于營養(yǎng)肉湯中，置于37℃搖床中進行純培養(yǎng)。鏈球菌在血平板上的菌落形態(tài)為有溶血環(huán)或無溶血環(huán)的圓形突起的細小菌落；挑取疑似鏈球菌菌落革蘭氏染色后，鏡檢可見革蘭氏陽性、排列成長鏈狀的球菌；將疑似鏈球菌菌落接種于營養(yǎng)肉湯中，置于37℃搖床中進行純培養(yǎng)。大腸桿菌在伊紅美藍瓊脂平板中的菌落形態(tài)為紫黑色并帶有綠色金屬光澤的菌落；挑取疑似菌落革蘭氏染色后，鏡檢可見革蘭氏陰性的棒狀桿菌；將疑似大腸桿菌菌落接種于營養(yǎng)肉湯中，置于37℃搖床中進行純培養(yǎng)。

圖6 葡萄球菌在血平板上形成黃色或白色大菌落，周圍有透明溶血環(huán)

2.2.3 細菌生化鑒定（1）疑似葡萄球菌用觸酶試驗、血漿凝固酶試驗及甘露醇發(fā)酵試驗等葡萄球菌屬細菌生化鑒定管進行鑒定。疑似鏈球菌的用CAMP試驗、6.5%NaCl肉湯生長試驗、七葉苷及馬尿酸鈉發(fā)酵試驗等進行鑒定。疑似大腸桿菌的用乳糖發(fā)酵試驗、三糖鐵、吲哚、甲基紅及VP試驗進行鑒定。（2）從117份奶樣中共分離到致病菌107株，其中金黃色葡萄球菌70株，占分離菌株的65.4%；無乳鏈球菌27株，占分離株的25.2%；大腸桿菌10株，占分離株的9.3%。在采集的117份奶樣中，未分離出細菌的奶樣有11份，可能為非特異性乳房炎或是由其他病原微生物引起。106份有菌奶樣中，多數(shù)樣本（79/106）只分離到一種優(yōu)勢菌，其余27份奶樣（25.5%）中分離得到兩種或兩種以上細菌。乳房炎奶樣分離到的細菌感染情況見表2。

表2 乳房炎樣本的細菌感染情況

2.2.4 藥敏試驗 經(jīng)分離培養(yǎng)及鑒定，將分離到的107株致病菌進行了以下藥物的藥敏試驗：青霉素、阿莫西林、頭孢噻呋、氧氟沙星、紅霉素、慶大霉素、環(huán)丙沙星、氟苯尼考。藥敏試驗結(jié)果如表3所示。

表3 藥物對三種病原菌的平均抑菌圈直徑（mm）

2.3 犢牛腹瀉

犢牛腹瀉是指斷奶前的犢牛所發(fā)生的一種以消化不良及腹瀉為主要特征的消化道疾病。該病是由腸道內(nèi)的細菌、病毒或寄生蟲等病原微生物或是營養(yǎng)性因素、環(huán)境因素致使機體抵抗力下降及發(fā)病后所表現(xiàn)出來的一種多因素綜合征，是造成犢牛死亡、生長發(fā)育不良且危害犢牛養(yǎng)殖最為嚴重的疾病之一，給牛場造成巨大的經(jīng)濟損失，嚴重阻礙了養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展［10］。引起犢牛腹瀉的細菌主要有大腸桿菌、沙門氏菌、巴氏桿菌及魏氏梭菌等，單一細菌的感染往往不會引起嚴重的腹瀉，往往是伴隨著飼養(yǎng)管理因素或應激因素一起導致犢牛抵抗力下降、腸道菌群失調(diào)，加之細菌感染而誘發(fā)嚴重的腹瀉［11，12］。因此，如何預防和治療犢牛腹瀉就成了急需解決的難題。目前，對犢牛腹瀉病的治療主要采用抗生素治療并結(jié)合支持療法，由于致病因素眾多，針對性不強，臨床治療效果往往不夠理想，加之長期而廣泛地使用抗生素，細菌耐藥性和藥物殘留引起的社會問題也日益凸顯。為明確犢牛腹瀉病例中細菌性致病因素所占的比重及致病細菌的耐藥情況，特對接診的犢牛腹瀉病例進行了細菌的分離鑒定及藥敏試驗。

2.3.1 樣品采集 應用滅菌棉拭子采取病牛肛門處新鮮糞便或肛門拭子共計50份，標記后冰浴中運送至實驗室待檢。送檢的樣品短時間保存于4℃冰箱中，并在12h內(nèi)開展細菌分離工作。

2.3.2 細菌分離及純培養(yǎng) 將無菌采集的棉拭子樣品置于0.5ml滅菌生理鹽水中，混勻后，分別取0.1ml接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板、伊紅美藍瓊脂平板及SS平板中，用滅菌L棒涂布均勻。將涂布后的平板倒置放于37℃溫箱中培養(yǎng)24h后進行菌落形態(tài)觀察，并對可疑菌落進行涂片、革蘭氏染色及鏡檢。大腸桿菌在伊紅美藍瓊脂平板中的菌落形態(tài)為紫黑色并帶有綠色金屬光澤的菌落；挑取疑似菌落革蘭氏染色后，鏡檢可見革蘭氏陰性的棒狀桿菌（圖7）；將疑似大腸桿菌菌落接種于營養(yǎng)肉湯中，置于37℃搖床中進行純培養(yǎng)。沙門氏菌在SS平板中的菌落形態(tài)為中心黑色的圓形菌落；挑取疑似菌落革蘭氏染色后，鏡檢可見革蘭氏陰性的小桿菌；將疑似沙門氏菌菌落接種于營養(yǎng)肉湯中，置于37℃搖床中進行純培養(yǎng)。

圖7 大腸桿菌鏡下為革蘭氏陰性短桿菌

2.3.3 細菌生化鑒定 將分離自選擇性培養(yǎng)基上的、經(jīng)染色鏡檢為疑似大腸桿菌及沙門氏菌的菌落增菌培養(yǎng)后調(diào)整濃度為0.5麥氏比濁單位的菌液。根據(jù)E40/12腸桿菌科細菌生化反應鑒定系統(tǒng)說明對疑似大腸桿菌進行生化試驗鑒定，先進行葡萄糖發(fā)酵試驗，糖發(fā)酵試驗陽性菌株繼續(xù)進行16種生化反應試驗。與大腸桿菌生化特性100%符合的菌株判為大腸桿菌。對疑似沙門氏菌進行鑒定時，先進行葡萄糖發(fā)酵試驗，陽性菌株繼續(xù)進行E40/12腸桿菌科細菌生化反應鑒定系統(tǒng)規(guī)定的16種生化試驗，試驗結(jié)果與沙門氏菌符合率為100%的確定為沙門氏菌。經(jīng)過細菌分離、染色及生化鑒定，最終從50份腹瀉糞便樣品中分離得到39株大腸桿菌和17株沙門氏菌（表4）。

表4 犢牛腹瀉糞便樣品中細菌分離情況

2.3.4 藥敏試驗 經(jīng)分離培養(yǎng)及鑒定，將分離到的56株致病菌進行常用藥物的藥敏試驗，試驗結(jié)果如表5所示。

表5 藥物對兩種病原菌的平均抑菌圈直徑 （mm）

由于抗生素在人醫(yī)及獸醫(yī)臨床的大量應用，細菌耐藥性問題較為普遍，特別是葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌及沙門氏菌的耐藥性急劇增強，尤其嚴重的是多重耐藥菌株的大量出現(xiàn)，會經(jīng)由食物鏈傳遞給人類而危及人類健康。

3 結(jié)論

從表1、表3及表5可知，牛病常見致病菌的多重耐藥現(xiàn)象較為普遍，僅有少數(shù)幾種藥物如頭孢類及喹諾酮類藥物能夠發(fā)揮有效抗菌作用，提示在生產(chǎn)中要選對藥、用對藥，在維護畜禽健康的同時保障人類健康。

參考文獻

［1］胡長敏，程淑芳，彭清潔等.肉牛主要細菌性疾病的診治及療效評價［J］.養(yǎng)殖與飼料，2013，8:9-11.

［2］石慧，鄭明學，王仲兵等.近年來牛主要細菌性傳染病及其流行特點［J］.動物醫(yī)學進展，2009，1:116-120.

［3］岳瑞超，程子龍，薛仲行等.對一例疑似肉牛運輸熱的診斷［J］.中國動物檢疫，2014，11:60-62+68.

［4］俸忠蘭，石鳳海，陶永艷等.一起牛巴氏桿菌病的細菌分離及藥敏試驗［J］.上海畜牧獸醫(yī)通訊，2015，2:59-61.

［5］唐先春.豬多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及生物學特性研究［D］.武漢:華中農(nóng)業(yè)大學，2004.

［6］鄧海平，俞詩源，王玲等.內(nèi)蒙古地區(qū)奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定及藥敏試驗研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2009，2:595-596+598.

［7］張中文，吳國娟，劉鳳華等.北京地區(qū)奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定及藥敏試驗［J］.北京農(nóng)學院學報，2002，4:42-47.

［8］張忠厚.呼市地區(qū)奶牛隱性乳房炎主要病原菌的分離鑒定及藥敏試驗［D］.呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學，2005.

［9］郭海勇，韓國華，崔京春.大連地區(qū)奶牛隱性乳房炎主要病原菌的分離鑒定及藥敏試驗［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2011，9:163-166.

［10］荔霞，王勝義，劉永明等.犢牛腹瀉病因及其藥物防治研究進展［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2010，10:161-165.

［11］曹斌斌，趙勐，林濤等.犢牛腹瀉病因及治療方法［J］.中國奶牛，2012，5:51-53.

［12］王靜，何生虎，葛松等.犢牛腹瀉的發(fā)病原因及治療的研究進展［J］.農(nóng)業(yè)科學研究，2013，3:59-62

中圖分類號：S858.23

文獻標識碼：A

文章編號：1007-1733（2016）04-0001-04

基金項目：山東省牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資助（SDAIT-12-011-04）

*通訊作者

收稿日期：（2016–01–21）