泰安地區(qū)雞源致病性大腸桿菌流行病學(xué)調(diào)查與耐藥性分析

宿志民 孫 燕（山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院 山東 濰坊 261061）

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調(diào)查報(bào)告

泰安地區(qū)雞源致病性大腸桿菌流行病學(xué)調(diào)查與耐藥性分析

宿志民 孫 燕（山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院 山東 濰坊 261061）

本調(diào)查對(duì)雞場(chǎng)采集的疑似雞大腸桿菌病例的相關(guān)病料進(jìn)行大腸桿菌的分離鑒定，共分離鑒定出14株雞源大腸桿菌，以微量平板凝集試驗(yàn)鑒定分離菌株的O抗原血清型，分別屬于O78、O2和O1等3個(gè)血清型，其中O78（6/14）、O2（6/14）為主要流行血清型，占分離菌株總數(shù)的85.71%。選取了20種常用治療腸桿菌病的抗生素對(duì)14株雞源大腸桿菌分離株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，對(duì)14株大腸桿菌的β-內(nèi)酰胺類耐藥基因TEM、CTX-M-1基因及氨基糖甙類耐藥基因acc（6'）-Ib、aph（3'）-IIa等耐藥基因進(jìn)行了PCR檢測(cè)，雞大腸桿菌病是由大腸埃希氏桿菌某些血清型菌株引起的一類疾病的總稱。常引起家禽胚胎死亡、臍炎、敗血癥、肝周炎、心包炎、卵黃性腹膜炎、輸卵管炎等一系列疾病，對(duì)養(yǎng)雞業(yè)的危害很大。大腸桿菌易產(chǎn)生耐藥性，養(yǎng)殖過(guò)程中不規(guī)范用藥進(jìn)一步加劇了耐藥性的發(fā)展。藥物敏感性試驗(yàn)表明，雞源大腸桿菌耐藥菌株越來(lái)越多，耐藥譜也越來(lái)越廣，甚至有的分離株對(duì)尚未廣泛用于獸醫(yī)臨床的新型抗生素也表現(xiàn)出很強(qiáng)的耐藥性。本研究對(duì)泰安地區(qū)幾個(gè)規(guī)?；B(yǎng)雞場(chǎng)分離到的大腸桿菌耐藥性情況進(jìn)行了系統(tǒng)的調(diào)查，以期揭示該地區(qū)雞源性大腸桿菌病的流行情況和細(xì)菌的耐藥狀況，為該地區(qū)雞大腸桿菌病的發(fā)生流行的有效控制提供可靠的理論依據(jù)

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.l 病料采集 自2013～2014年從山東省泰安市10個(gè)規(guī)?；u場(chǎng)疑似大腸桿菌感染病死雞無(wú)菌采集的肝臟等臟器。

1.1.2 主要試劑 PBS緩沖液、LB培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、50×TAE電泳緩沖液、胰蛋白胨（Typetone）、大豆蛋白胨（Peptone-B）、酵母抽提物（Yeast extract）、瓊脂（Agar）、氯化鈉（NaCl）等均購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；腸桿菌科細(xì)菌生化常規(guī)鑒定管購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；大腸桿菌O1、O2、O78、O133標(biāo)準(zhǔn)血清均購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所。

1.1.3 供試藥敏紙片 多粘菌素B、慶大霉素、鏈霉素、阿米卡星、卡那霉素、妥布霉素、復(fù)方新諾明、氧氟沙星、氨曲南、哌拉西林、氨芐西林、頭孢噻肟、頭孢噻吩、頭孢他啶、頭孢呋辛、頭孢曲松、頭孢哌酮、頭孢西叮、頭孢吡肟等19種藥敏紙片購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.4 主要儀器和設(shè)備 PYX-DHS型生化培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、電子天平、電熱恒溫培養(yǎng)箱、高壓滅菌鍋、水平搖床 WD-9405B、PCR儀、DYYnl-3IA/3IB 型核酸電泳槽、DYYnl-2 型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、超純水系統(tǒng)、凝膠自動(dòng)成像儀、可調(diào)恒溫水浴箱。

1.2 方法

1.2.1 營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板和麥康凱瓊脂平板的制備 按常規(guī)及試劑說(shuō)明制備，冷卻后于放置37℃溫箱中16～24h，檢查無(wú)菌后置4℃冰箱中備用。

1.2.2 細(xì)菌的分離培養(yǎng)與純化 從所采集具有典型大腸桿菌臨診癥狀和病理變化（敗血癥、包心、包肝等）的病死雞的肝臟，無(wú)菌操作劃線接種于普通培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂平板上37℃培養(yǎng)24h。挑取麥康凱瓊脂平板上單個(gè)紅色的菌落，再接種于麥康凱瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24h，同時(shí)挑取單個(gè)紅色菌落涂片、革蘭氏染色、鏡檢。如此反復(fù)純化3～4代，直到獲得純菌落為止。

1.2.3 生化試驗(yàn) 選取麥康凱瓊脂平板上純化好的紅色單菌落，分別做各種細(xì)菌微量生化管，對(duì)糖發(fā)酵管要使管口稍下置于無(wú)菌平皿中，37℃培養(yǎng)18～24h。

1.2.4 藥物敏感性試驗(yàn)（1）培養(yǎng)基制備：常規(guī)方法將LB培養(yǎng)基制成瓊脂平板，置4℃冰箱中備用。（2）瓊脂紙片擴(kuò)散法：按世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦的Kirby-Bauer氏法（即美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)NCCLS的藥敏試驗(yàn)方法）進(jìn)行。（3）測(cè)試菌的制備：在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上挑取2個(gè)相似菌落接種于2ml營(yíng)養(yǎng)肉湯管，37℃培養(yǎng)2-6h，其濁度相當(dāng)于0.5號(hào)麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)，此時(shí)肉湯中細(xì)菌數(shù)約為1億個(gè)細(xì)菌/ml，相當(dāng)于1.5×108CFU/ml。（4）平板接種及貼加藥敏紙片：用無(wú)菌棉拭子蘸取稀釋液，在LB培養(yǎng)基上均勻涂抹，每次將平板轉(zhuǎn)動(dòng)60°，必須使細(xì)菌涂布均勻，最后用棉簽涂抹瓊脂平板邊緣，蓋上平皿蓋，在室溫下放置5min。用無(wú)菌眼科鑷子在無(wú)菌狀態(tài)下將20種藥敏紙片貼于平板上，要求藥敏紙片分布均勻，藥敏紙片貼完15min后將平板倒置，置37℃溫箱中培養(yǎng)16h-18h，觀察結(jié)果。

1.2.5 耐藥基因的PCR檢測(cè)（1）基因的PCR擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)：下載GenBank中大腸桿菌耐藥基因序列，使用Lasergene7.0軟件分析，應(yīng)用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增大腸桿菌中β-內(nèi)酰胺酶基因和氨基糖苷類耐藥基因，具體序列及擴(kuò)增長(zhǎng)度如表2所示。引物由上海生工公司合成。（2）PCR擴(kuò)增：以本研究分離到的14株大腸桿菌全菌體菌液為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系如下所示：10×反應(yīng)緩沖液2.5μl，Mg2+（25mmol/L）1.5μl，dNTPs（各10mmol/L）2μl，上下游引物各1μl，模板DNA1μl，rTaq 0.5μl，ddH2O 15.5μl，共25μl，所用試劑均購(gòu)自大連寶生物公司。將以上組分分別加入到ependoff管中，混和均勻后置于PCR儀中，按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)：預(yù)變性95℃5min，變性95℃1min，復(fù)性55℃50s，延伸72℃ 2min，共30個(gè)循環(huán)，終末延伸72℃10min。同時(shí)設(shè)立無(wú)模板的陰性對(duì)照。PCR產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離與純化

經(jīng)37℃培養(yǎng)18～24h，分離菌在麥康凱瓊脂平板上形成粉紅色或紅色、光滑、圓形隆起、邊緣整齊，直徑1.5～2.5mm的小菌落，見(jiàn)圖1。

圖1 雞源大腸桿菌在麥康凱培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況

2.2 革蘭氏染色鏡檢

挑取菌落及病料涂片經(jīng)革蘭氏染色鏡檢，可見(jiàn)革蘭氏陰性、兩端鈍圓的短粗桿菌，多單在，偶有2～3個(gè)菌體連在一起，見(jiàn)圖2。

圖2 分離菌在顯微鏡下的形態(tài)（1000×）

2.3 生化試驗(yàn)

分離到的14株菌都符合大腸桿菌的特征，各菌均發(fā)酵大多數(shù)糖類（葡萄糖、麥芽糖、乳糖、甘露糖、果糖），產(chǎn)氣產(chǎn)酸，不發(fā)酵蔗糖，VP試驗(yàn)陰性，MR試驗(yàn)陽(yáng)性，三糖鐵底層產(chǎn)酸，產(chǎn)生靛基質(zhì)，尿素酶試驗(yàn)陰性。

2.4 血清型鑒定

應(yīng)用微量平板凝集試驗(yàn)鑒定14株雞源大腸桿菌分離株的O抗原血清型，結(jié)果顯示分別屬于O78、O2、和O1等3個(gè)血清型，其中O78（6/14）、和O2（6/14）為主要流行血清型，占分離菌株總數(shù)的85.7%。具體見(jiàn)表1。

表1 14株分離菌血清型鑒定結(jié)果 （%）

2.5 14株雞源大腸桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

按照前述方法，培養(yǎng)24h后，個(gè)別藥敏片周圍出現(xiàn)典型抑菌圈，見(jiàn)圖3。藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果依據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)（CLSI2008）標(biāo)準(zhǔn)判定敏感率、中介率、耐藥率。藥敏試驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2。

圖3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

表2 14株大腸桿菌對(duì)20種抗生素藥物藥敏試驗(yàn)結(jié)果（mm）

統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知，14株大腸桿菌對(duì)多種頭孢菌素類抗生素如頭孢噻肟、頭孢噻吩、頭孢呋辛、頭孢曲松、頭孢哌酮、頭孢吡肟、頭孢唑啉均具有極高的耐藥性。此外，14株大腸桿菌對(duì)慶大霉素、鏈霉素、阿米卡星、卡那霉素、哌拉西林、氨芐西林等常用抗生素的耐藥性也達(dá)到100%，對(duì)妥布霉素（92.9%）、氧氟沙星（85.7%）、氨曲南（85.7%）、頭孢他啶（71.4%）及復(fù)方新諾明（64.3%）也具有較高的耐藥性。這14株大腸桿菌僅對(duì)多粘菌素B（100%）、頭孢西叮（100%）和復(fù)方新諾明（21.4%）的敏感性較高。

2.6 14株雞源大腸桿菌的多重耐藥情況

14株雞源大腸桿菌的多重耐藥情況統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 14株雞源大腸桿菌對(duì)20種藥物的多重耐藥情況

從表3可以看出，在14株雞源大腸桿菌分離株中，有1株大腸桿菌對(duì)15種抗生素耐藥，3株對(duì)16種抗生素耐藥，5株對(duì)17種抗生素耐藥，5株對(duì)17種抗生素耐藥。由此可見(jiàn)，本研究中所分離到的大腸桿菌具有很強(qiáng)的耐藥性。

2.7 大腸桿菌耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

2.7.1 TEM耐藥基因檢測(cè)結(jié)果 以14株大腸桿菌全菌體為模板，以TEM引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)TEM基因的攜帶情況。結(jié)果表明，在14株分離菌株中，有9株大腸桿菌的TEM基因擴(kuò)增出陽(yáng)性，陽(yáng)性率占總菌株的64.3%。擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖見(jiàn)圖4所示。

圖4 14株大腸桿菌TEM基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳

2.7.2 CTX-M-1耐藥基因檢測(cè)結(jié)果 以14株大腸桿菌全菌體為模板，以CTX-M-1引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)CTXM-1基因的攜帶情況。結(jié)果表明，全部14株分離菌株中均為陽(yáng)性。擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖見(jiàn)圖5所示。

圖5 14株大腸桿菌CTX-M-1基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳

2.7.3 aph（3'）-IIa耐藥基因檢測(cè)結(jié)果 以14株大腸桿菌全菌體為模板，以aph（3'）-IIa引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)aph（3'）-IIa基因的攜帶情況。結(jié)果表明，在14株分離菌株中，有2株大腸桿菌的aph（3'）-IIa基因擴(kuò)增出陽(yáng)性，陽(yáng)性率占總菌株的14.3%。擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖見(jiàn)圖6所示。

圖6 14株大腸桿菌aph（3'）-IIa基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳

2.7.4 acc（6'）-Ib耐藥基因檢測(cè)結(jié)果 以14株大腸桿菌全菌體為模板，以acc（6'）-Ib引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)acc（6'）-Ib基因的攜帶情況。結(jié)果表明，在14株分離菌株中，有13株大腸桿菌的TEM基因擴(kuò)增出陽(yáng)性，陽(yáng)性率占總菌株的92.8%。擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖見(jiàn)圖7所示。

圖7 14株大腸桿菌acc（6'）-Ib基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳

3 討論

（1）泰安市是山東畜牧養(yǎng)殖大市，家禽養(yǎng)殖量大，養(yǎng)雞業(yè)發(fā)達(dá)。大腸桿菌病在山東省泰安地區(qū)的發(fā)病率較高，危害嚴(yán)重。為了解近年來(lái)泰安地區(qū)禽源大腸桿菌的血清型及其藥敏特性，有針對(duì)性地開(kāi)展禽大腸桿菌病的防治工作，本研究收集了在泰安地區(qū)多份疑似禽大腸桿菌病的病料，并進(jìn)行了病原分離，血清型及生化鑒定。結(jié)果表明，本研究中分離得到的14株細(xì)菌都符合大腸桿菌的特征。對(duì)這14株雞源大腸桿菌分離菌株菌株的血清型鑒定結(jié)果可以看出，O78和O2血清型出現(xiàn)的機(jī)率相對(duì)較高，均占比42.86%；O1血清型亦有分離，但所占比例不高。這與國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道的結(jié)果基本相符（范偉興，1997；劉遠(yuǎn)飛，2008），這說(shuō)明山東省泰安地區(qū)禽源大腸桿菌流行菌株在較長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)，均保持一定的流行穩(wěn)定性。（2）本調(diào)查采用最為常用的紙片法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示山東省泰安地區(qū)禽源大腸桿菌存在嚴(yán)重的耐藥問(wèn)題，分離到的14個(gè)菌株全部耐藥，特別是對(duì)β-內(nèi)酰胺類青霉素類和頭孢菌素類藥物表現(xiàn)為普遍的多重耐藥。這14個(gè)菌株僅對(duì)頭孢西叮、多粘菌素B、氨曲南、復(fù)方新諾明、妥布霉素、氧氟沙星和頭孢他啶較為敏感；其中最敏感的藥物為頭孢西叮和多粘菌素B，其敏感率都達(dá)到了100%。本研究分離到的14株大腸桿菌對(duì)這兩種抗生素均100%耐藥，這可能是由于前幾年養(yǎng)雞場(chǎng)大量使用這兩種抗生素，繼而導(dǎo)致耐藥細(xì)菌占據(jù)優(yōu)勢(shì)所致。這展示出泰安地區(qū)禽源大腸桿菌耐藥性的復(fù)雜性和多變性，給獸醫(yī)臨床中大腸桿菌病的防控帶來(lái)了新的挑戰(zhàn)。綜合上述數(shù)據(jù)，山東泰安地區(qū)臨床分離的致病性大腸桿菌具有非常廣泛的耐藥譜，進(jìn)行防治時(shí)應(yīng)慎用上述β-內(nèi)酰胺類青霉素類核頭孢菌素類藥物，一定要進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，選擇合適的敏感藥物，不要盲目選用價(jià)格昂貴的藥物。此外，在抗菌藥物的選擇上應(yīng)考慮聯(lián)合用藥、交叉用藥、輪換用藥，一方面可以充分發(fā)揮抗菌藥物之間的協(xié)同作用，增加療效；另一方面可以避免細(xì)菌長(zhǎng)期與某一種藥物接觸，增加產(chǎn)生耐藥性機(jī)率。（3）在本研究中，通過(guò)對(duì)泰安地區(qū)分離的禽源大腸桿菌進(jìn)行β-內(nèi)酰胺類和氨基糖苷類耐藥基因的檢測(cè)，為了解本地區(qū)養(yǎng)禽業(yè)在臨床用藥中合理選擇抗生素、防止耐藥菌的傳播提供依據(jù)，具有重要的臨床指導(dǎo)意義。檢測(cè)結(jié)果表明14株大腸桿菌普遍攜帶β-內(nèi)酰胺類耐藥基因和氨基糖苷類藥物耐藥基因。其中，14株大腸桿菌均攜帶β-內(nèi)酰胺類耐藥基因CTX-M-1；9株大腸桿菌攜帶β-內(nèi)酰胺類耐藥基因TEM，陽(yáng)性檢出率為64.3%。此外，14株大腸桿菌均攜帶氨基糖苷類耐藥基因acc（6'）-Ib，2株大腸桿菌攜帶氨基糖苷類耐藥基因aph（3'）-IIa，陽(yáng)性檢出率為14.3%。對(duì)于本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增的耐藥基因，有6株大腸桿菌攜帶2種耐藥基因，6株攜帶3中耐藥基因，2株攜帶4種耐藥基因。本研究分離到的14株大腸桿菌攜帶耐藥基因的比例很高，并且所攜帶耐藥基因的情況與藥敏試驗(yàn)的結(jié)果基本對(duì)應(yīng)，這也在分子水平上解釋了本研究中14株大腸桿菌具有極廣耐藥譜的原因，為有效控制大腸桿菌感染提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

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中圖分類號(hào)：S858.31

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-1733（2016）04-0036-04

收稿日期：（2016–01–25）