坤泰膠囊對(duì)小鼠子宮內(nèi)膜容受性影響的研究*

王　慧，李玉潔,陳　帆，南　燕

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南新鄉(xiāng) 453003)

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坤泰膠囊對(duì)小鼠子宮內(nèi)膜容受性影響的研究*

王慧，李玉潔△,陳帆，南燕

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南新鄉(xiāng) 453003)

[摘要]目的通過比較溶血磷脂酸受體-3(LPAR3)在小鼠胚胎著床期子宮內(nèi)膜的表達(dá)，了解坤泰膠囊對(duì)小鼠子宮內(nèi)膜容受性的影響。方法將90只6～8周齡的昆明雌鼠分為3組[A組：控制性超促排卵(COH)；B組：坤泰+COH；C組：生理鹽水對(duì)照)，每組30只]，檢查合籠次日晨陰栓，于第1～6天每天每組處死5只雌鼠，測定血清中雌二醇(E2)、孕酮(P)水平，以及腺體數(shù)和LPAR3免疫組化光密度值(IOD)。 結(jié)果A、B組血清E2、P水平值均高于同期C組(P<0.05)；HE染色，A組較B、C組腺體數(shù)明顯減少(P<0.05)。A組第3天LPAR3的IOD值高于B、C組(P<0.05)，而A組第4天IOD值明顯小于B、C組(P<0.05)，B組較C組略高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論坤泰膠囊可能通過改善COH小鼠LPAR3正常時(shí)空表達(dá)，起到改善子宮內(nèi)膜容受性的作用。

[關(guān)鍵詞]坤泰膠囊；子宮內(nèi)膜容受性；控制性超促排卵；溶血磷脂酸受體-3

隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，輔助生殖技術(shù)在卵子的獲取、受精卵的培養(yǎng)、胚胎移植等方面取得很大的進(jìn)步，為廣大的不孕癥患者帶來希望；但是胚胎的著床率較前并未出現(xiàn)明顯改善[1]，嚴(yán)重影響了妊娠結(jié)局，為此子宮內(nèi)膜容受性即子宮內(nèi)膜對(duì)胚胎的接受能力就成為當(dāng)今生殖醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)問題[2]。本實(shí)驗(yàn)建立了控制性超促排卵(controlled ovarian hyperstimulation，COH)小鼠模型，觀察坤泰膠囊對(duì)小鼠子宮內(nèi)膜容受性的影響，并了解溶血磷脂酸受體-3(lysophosphatidic acid receptors 3，LPAR3)在小鼠子宮內(nèi)膜上的表達(dá)特點(diǎn)，對(duì)坤泰膠囊作用機(jī)制及胚胎著床影響的機(jī)制進(jìn)行探討。

1材料與方法

1.1材料清潔級(jí)昆明雌鼠90只，6～8周齡，24～34 g；雄鼠45只，8～10周齡，28～37 g，由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。雌雄分籠飼養(yǎng)，自由取食水，室溫22～25 ℃。

1.2方法將90只雌鼠分為A、B、C 3組(n=30)，B組給予坤泰膠囊(貴陽新天藥業(yè)股份有限公司提供)，A、C組給予相同劑量生理鹽水，均灌胃1個(gè)月，每只每天劑量為0.7 mL。將坤泰膠囊溶于生理鹽水濃度為50 mg/mL，灌胃劑量根據(jù)許文生氏公式和Meeh-Rubner氏公式，按中國婦女的平均身高158.6 cm，體質(zhì)量53.6 kg，本次實(shí)驗(yàn)雌鼠的平均體質(zhì)量27.5 g計(jì)算，小鼠的每日灌藥量約為1.2 mg/g。3組小鼠灌胃20 d后，于小鼠發(fā)情后期，A、B兩組均于上午9：00腹腔注射促性腺激素釋放激素拮抗劑(GnRHa)1.5 μg/100 g，連續(xù)9 d，第9天加注孕馬血清促性腺激素(PMSG)10 IU/只，48 h后腹腔注射人絨毛膜促性腺激素(HCG)10 IU/只,C組同時(shí)注射同等劑量的生理鹽水。HCG注射日當(dāng)晚A、B、C 3組雌∶雄比2∶1合籠，次日晨7：00～8：00時(shí)檢查陰栓，并記為第1天，依次為第2、3、4、5、6天，每天每組平均頸椎脫臼處死5只雌鼠，心臟取血行雌二醇(E2)、孕酮(P)測定，解剖取其子宮組織，放置4%的多聚甲醛中固定待行HE染色和免疫組化檢測LPAR3表達(dá)的光密度值(IOD)。

2結(jié)果

2.13組小鼠第1～6天E2、P水平比較A、B組E2、P水平均高于同期C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；B組E2、P水平高于A組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1、表2。

2.23組小鼠第4天子宮內(nèi)膜HE染色比較A、B、C組腺體數(shù)分別為(12.6±3.36)、(19.8±1.92)、(17.0±2.45)個(gè)，B組腺體數(shù)高于A、C組，與A組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與C組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。鏡下觀A組腺體發(fā)育差，腺腔小，間質(zhì)致密，血管較少；B組腺體發(fā)育好，腺腔大，間質(zhì)疏松，血管多；C、B組鏡下比較無明顯差別。圖1～3。

2.33組小鼠LPAR3表達(dá)的IOD比較LPAR3在3組小鼠的第1～6天出現(xiàn)規(guī)律性表達(dá)，A組峰值出現(xiàn)在第3天，B、C組峰值均出現(xiàn)在第4天，且A組第3天的IOD值高于B、C組(P<0.05)；B、C組第4天的IOD值高于A組(P<0.05)；B組第4、5天的IOD值略高于C組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。三組峰值可見免疫組化圖4～6。

表1　　3組小鼠第1～6天E2水平比較

a：P<0.05，與同期C組比較。

表2　　3組小鼠第1～6天P水平比較

a：P<0.05，與同期C組比較。

表3　　3組小鼠LPAR3的IOD比較

a：P<0.05，與同期A組比較。

圖1 A組第4天HE染色(×400)圖2 B組第4天HE染色(×400)圖3 C組第4天HE染色(×400)

圖4 A組第3天LPAR3的表達(dá)(×400)圖5 B組第4天LPAR3的表達(dá)(×400)圖6 C組第4天LPAR3的表達(dá)(×400)

3討論

通過提高子宮內(nèi)膜容受性，從而提高輔助生殖技術(shù)的臨床妊娠率是現(xiàn)在生殖醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)問題，國內(nèi)外學(xué)者通過大量研究以期解決超促排卵后導(dǎo)致的種植窗期子宮內(nèi)膜容受性低下的問題，同時(shí)也是目前解決胚胎種植率低的切入點(diǎn)。

溶血磷脂酸(LPA)存在于機(jī)體的血清、眼房水、精漿等多種體液中，其受體有4種，分別是LPAR1、LPAR2、LPAR3、LPAR4，其中LPAR3與雌性生殖系統(tǒng)關(guān)系密切。有研究發(fā)現(xiàn)，LPAR3基因缺陷的雌性小鼠中LPAR3空間分布異常，并推測其表達(dá)異?？蓪?dǎo)致胚胎種植的延遲[3]。本實(shí)驗(yàn)免疫組化提示，LPAR3表達(dá)于子宮內(nèi)膜上皮及腺上皮細(xì)胞質(zhì)，且在子宮內(nèi)膜上的表達(dá)具有規(guī)律性，3組均出現(xiàn)峰值，A組峰值出現(xiàn)在第3天，B、C組出現(xiàn)第4天；B組峰值高于A組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，這種規(guī)律性表達(dá)可能與生殖關(guān)系密切相關(guān)。

坤泰膠囊為純中藥制劑，由熟地黃、黃連、白芍、黃芩、茯苓、阿膠等六味中藥組成，無雌激素，卻有類雌激素作用。有研究證實(shí)，坤泰膠囊有雌激素樣作用，并且能改善子宮內(nèi)膜發(fā)育，有利于胚胎著床[4]；有研究證實(shí)，雌、孕激素在胚胎與子宮內(nèi)膜對(duì)話建立關(guān)聯(lián)之間起到重要的把控作用[5]。通過本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)坤泰膠囊確實(shí)具有升高雌、孕激素的作用，但作用弱。陳蓉等[6]研究的坤泰膠囊可以升高E2，且不會(huì)造成子宮內(nèi)膜過度增生。本實(shí)驗(yàn)顯示，坤泰膠囊同時(shí)具有改善COH引起的子宮內(nèi)膜腺體少且發(fā)育不良、間質(zhì)致密等作用。付連方[7]研究COH藥物具有影響小鼠子宮內(nèi)膜容受性，導(dǎo)致臨床妊娠率低；龔瑜等[8]試圖從子宮內(nèi)膜厚度、血流指數(shù)等方面研究超促排卵對(duì)子宮內(nèi)膜容受性的影響，發(fā)現(xiàn)超促排卵對(duì)內(nèi)膜厚度與血流指數(shù)影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。由本實(shí)驗(yàn)可見COH可能是在異常升高雌、孕激素水平，影響內(nèi)膜腺體發(fā)育等方面降低子宮內(nèi)膜容受性的；而坤泰膠囊在一定程度上可通過改善子宮內(nèi)膜腺體少、發(fā)育不良、疏松間質(zhì)從而改善COH引起的子宮內(nèi)膜容受性降低；這一結(jié)論與鄭瑞君等[9]研究的坤泰膠囊具有改善子宮內(nèi)膜容受性的結(jié)論相同。南燕等[10]研究發(fā)現(xiàn)，坤泰膠囊能改善子宮內(nèi)膜容受性，有助于胚胎的著床；此外宋暉等[11]研究發(fā)現(xiàn)，坤泰膠囊具有促排卵作用，但是不會(huì)造成子宮內(nèi)膜過度增生，因此和促排卵藥物聯(lián)合應(yīng)用可降低促排卵藥物對(duì)子宮內(nèi)膜的不良影響，從而達(dá)到改善子宮內(nèi)膜容受性的作用。另外臨床研究也證實(shí)，坤泰膠囊具有改善卵巢功能、調(diào)節(jié)雌激素水平、促進(jìn)子宮內(nèi)膜增生，利于胚胎著床[12-13]；還有研究顯示，坤泰膠囊對(duì)更年期大鼠子宮具有營養(yǎng)作用[14]。

小鼠子宮內(nèi)膜的種植窗為第4～5天晨，約18 h[15]。胞飲突為目前公認(rèn)的子宮內(nèi)膜容受性評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。郭燕紅等[16]研究小鼠在合籠第4天，出現(xiàn)完全發(fā)育的胞飲突,本實(shí)驗(yàn)的B組與C組的LPAR3峰值均出現(xiàn)在第4天；與胞飲突的發(fā)育一致，可見LPAR3與胚胎著床確實(shí)關(guān)系密切。坤泰膠囊在改善子宮內(nèi)膜腺體數(shù)少、發(fā)育不良的同時(shí)，也改善了LPAR3總體表達(dá)量，為此可見B組第4天較其他兩組腺體多、LPAR3的IOD值較其他兩組高，免疫組化與HE染色結(jié)果一致。為此，可推斷，LPAR3與胚胎著床關(guān)系密切，其可能通過黏附作用參與胚胎著床過程。郭燕紅等[16]研究表明，LPAR3在子宮內(nèi)膜著床期表達(dá)，對(duì)評(píng)價(jià)子宮內(nèi)膜容受性有重要意義，可作為子宮內(nèi)膜容受性的良好評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。A組LPAR3峰值提前出現(xiàn)且較B組低，第4天腺體發(fā)育不良、間質(zhì)致密、血管較少，可見COH可能導(dǎo)致胚胎種植窗提前，造成胚胎與子宮內(nèi)膜發(fā)育不同步，而坤泰膠囊改善了COH小鼠內(nèi)膜的LPAR3時(shí)空表達(dá)，并增加了LPAR3的表達(dá)量，從而起到改善小鼠子宮內(nèi)膜腺體發(fā)育，提高子宮內(nèi)膜容受性的作用。

坤泰膠囊能促進(jìn)子宮內(nèi)膜發(fā)育，并能抵制促排卵藥物引起的子宮內(nèi)膜容受性降低，而此作用可能是通過改善LPAR3的正常時(shí)空表達(dá)及量的表達(dá)實(shí)現(xiàn)；但LPAR3如何承上啟下發(fā)揮調(diào)節(jié)作用尚不清楚,有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1]魏麗坤，張雷，王藹明．子宮內(nèi)膜容受性的評(píng)價(jià)及其改善措施[J]．生殖與避孕，2008，28(5)：298-303．

[2]Jones RL,Salamonsen LA,Findlay JK.Potential roles for endometrial inhibins,activins and follistatin during human embryo implantation and early pregnancy[J].Trends Endocrinol Metab,2002,13(4):144-150.

[3]Ye X,Hama K,Contos JJ,et al.LPA3-mediated lysophosphatidic acid signalling in embryo implantation and spacing[J].Nature,2005,435(738):104-108.

[4]李存存，王晶晶，陳潮，等．坤泰膠囊與激素替代療法治療更年期綜合征有效性和安全性比較的Meta分析[J]．中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2013，33(9)：1183-1190．

[5]張煒，周劍萍，劉銀坤，吳欣等.白血病抑制因子在小鼠圍著床期子宮內(nèi)膜的表達(dá)[J].生殖醫(yī)學(xué)，2000,9(2):100-103.

[6]陳蓉，林守清，楊欣，等．坤泰膠囊治療婦女更年期綜合征的臨床研究[J]．中國新藥雜志，2005，14(12)：1472-1476．

[7]付連芳．控制性超排卵(COH)藥物GnRHα對(duì)小鼠子宮內(nèi)膜整合素αv、β1表達(dá)的影響[J]．醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)與臨床，2006，17(6)：33-34,40．

[8]龔瑜，岳天孚，白曉紅，等．超促排卵與胚胎著床前期子宮內(nèi)膜容受性的關(guān)系[J]．國際婦產(chǎn)科學(xué)雜志，2010，37(3)：212-214,218,227．

[9]鄭瑞君，張宸銘．坤泰膠囊對(duì)原因不明性不孕癥子宮內(nèi)膜容受性的影響[J]．中成藥，2014，36(11)：2261-2264．

[10]南燕，段予新，李玉潔等.坤泰膠囊對(duì)不孕癥患者子宮內(nèi)膜容受性的影響[J]，新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，29(5):384-385.

[11]宋暉，韓星，田國華，等．坤泰膠囊對(duì)多囊卵巢綜合征促排卵臨床療效觀察[J]．中國婦幼保健，2012，27(32)：5194-5196．

[12] Trudel G.Sexuality and marital life：results of a survey[J].J Sex Marital Ther，2002,28(3)：229-249．

[13]Rossouw JE,Anderson GL,Prentice RL,et al.Risk and benefits of estrogen plus progestin in healthy postmenopausal woman[J].JAMA,2002,288(3)：321-333．

[14]張紹芬，朱慧庭，劉旸，等.坤泰膠囊對(duì)更年期大鼠卵巢功能及子宮內(nèi)膜影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華老年雜志，2004,23(9)：648-651.

[15]Wang H,Dey SK.Roadmap to embryo implantation:clues from mouse models[J].Nat Rev Genet,2006,7(3):185-199.

[16]郭燕紅，張雷，邵素霞，等．溶血磷脂酸受體3在小鼠胚胎圍著床期子宮內(nèi)膜的表達(dá)及意義[J]．解剖學(xué)報(bào)，2009，40(1)：141-145．

Study on effect of Kuntai Capsule on mice endometrial receptivity*

WangHui,LiYujie△,ChenFan,NanYan

(DepartmentofObstetricsandGynecology,ThirdAffiliatedHospitalofXinxiangMedicalCollege,Xinxiang,Henan453003,China)

[Abstract]ObjectiveTo understand the effect of Kuntai Capsule on mice endometrial receptivity by comparing the lysophospholipids acid receptor-3(LPAR3) expression in endometrium during mouse embryos implantation period.MethodsNinety 6-8 week old Kunming female mice were randomly divided to three groups:the group A[controlled ovarian hyperstimulation(COH)],B (COH+Kuntai Capsule) and C(normal saline control),30 cases in each group.The vaginal plug was performed on the next day after mating.Five mice in each group were daily killed on 1-6 d.The serum estradiol(E2) and progesterone(P) levels were detected.The glands number and the immunohistochemical integrated optical density(IOD) were also determined.ResultsThe levels of serum E2 amd P in the group A and B were higher than those in the group C at the same period(P<0.05);in the HE staining,the glands number in the group A was significantly decreased compared with the group B and C(P<0.05).The IOD value of LPAR3 on 3 d in the group A was significantly lower than that in the group B and C(P<0.05),while the group B was slightly higher than the group C without statistical difference(P>0.05).ConclusionKuntai Capsule may play the role for improving the endometrial receptivity by improving the normal space-time expression of LPAR3.

[Key words]Kuntai Capsule;endometrial receptivity;controlled ovarian hyperstimulation;lysophosphatidic acid receptors 3

doi:論著·基礎(chǔ)研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.18.005

基金項(xiàng)目：2012年河南省高等學(xué)校骨干教師資助項(xiàng)目(2012GGJS-135)。

作者簡介：王慧(1987-)，住院醫(yī)師，碩士研究生，主要從事子宮內(nèi)膜容受性研究?！魍ㄓ嵶髡撸珽-mail：645482554@qq.com。

[中圖分類號(hào)]R715.9

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671-8348(2016)18-2464-03

(收稿日期：2015-11-16修回日期：2016-03-08)