抑制組蛋白去乙酰酶1后對人胃癌干細胞的影響*

侯曦露,唐　郡,朱　斌,嚴(yán)和中,余森源,賀　艷,歷海清,王教學(xué),劉　衛(wèi)△

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬解放軍臨床學(xué)院消化內(nèi)科/解放軍第一〇五醫(yī)院消化內(nèi)科，合肥 230601；2.蚌埠醫(yī)學(xué)院附屬解放軍臨床學(xué)院消化內(nèi)科，合肥 230031)

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抑制組蛋白去乙酰酶1后對人胃癌干細胞的影響*

侯曦露1,唐郡1,朱斌1,嚴(yán)和中1,余森源1,賀艷2,歷海清1,王教學(xué)1,劉衛(wèi)1△

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬解放軍臨床學(xué)院消化內(nèi)科/解放軍第一〇五醫(yī)院消化內(nèi)科，合肥 230601；2.蚌埠醫(yī)學(xué)院附屬解放軍臨床學(xué)院消化內(nèi)科，合肥 230031)

[摘要]目的研究抑制組蛋白去乙?；?(HDAC1)后對人胃癌干細胞(GCSGs)增殖、干性及侵襲作用的影響。方法以CD44為胃癌干性標(biāo)志物，流式分選出GCSCs。實時熒光定量核酸擴增檢測(RT-qPCR)和蛋白免疫印跡法(Western blot)分別檢測GCSGs與胃癌非干細胞中HDAC1的表達量。組蛋白去乙?；敢种苿┨幚鞧CSCs后，CCK-8法、克隆形成和Transwell實驗觀察細胞增殖和侵襲的變化；RT-qPCR和Western blot檢測其對凋亡、侵襲相關(guān)蛋白及干性標(biāo)志物表達的影響。結(jié)果HDAC1在GCSCs中的表達比胃癌非干細胞高。實驗組細胞的增殖和侵襲能力相較于對照組均減弱，且下調(diào)干性標(biāo)志物及介導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。結(jié)論抑制HDAC1的去乙?；饔煤驡CSCs的增殖、干性及侵襲能力降低。

[關(guān)鍵詞]組蛋白去乙酰化酶1；胃癌干細胞；增殖；干性；侵襲

胃癌是我國常見的惡性腫瘤之一，其病死率居惡性腫瘤的首位[1]。即使正規(guī)治療后，大多數(shù)患者仍死于轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)[2]。腫瘤干細胞是一種具有自我更新和產(chǎn)生異質(zhì)性腫瘤細胞系的腫瘤細胞亞群[3]。近年研究表明，腫瘤干細胞對多種腫瘤增殖和侵襲作用相關(guān)[3]。然而腫瘤干細胞增殖與侵襲的相關(guān)分子標(biāo)志物與胃癌的關(guān)系尚需確定。表觀遺傳修飾是分子調(diào)控中的重要作用模式之一，在細胞的增殖、分化中起著重要的作用。組蛋白乙?；?去乙?；{(diào)控是表觀遺傳學(xué)中研究的主要內(nèi)容，組蛋白去乙?；?(HDAC1)催化組蛋白去乙酰化作用，可使基因轉(zhuǎn)錄活性下降[1]。近年來研究表明，異常的組蛋白去乙?；赡芘c腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，并且HDAC1在結(jié)腸癌、肝癌、胰腺癌和前列腺癌中均高表達[4-8]。筆者前期研究結(jié)果提示，HDAC1在胃癌干細胞(GCSCs)中表達異常，同時也提示HDAC1可能在GCSCs自我更新及分化過程中起一定的作用。因此，本研究通過CCK-8法、克隆形成、Transwell實驗及檢測干性(SOX2、BMI1、c-Myc)、侵襲(E-cadherin、Vimentin)標(biāo)志物的表達，探究去乙酰化酶抑制劑(TSA)抑制HDAC1去乙?；饔煤髮CSCs中增殖、干性及侵襲的影響，以進一步明確HDAC1在GCSCs生長中的作用。

1材料與方法

1.1材料人胃癌MGC803細胞(購自中國科學(xué)院上海細胞庫)培養(yǎng)于含10%胎牛血清、雙抗(青霉素100 U/mL+鏈霉素100 μg/mL)的RPMI-1640培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2和100%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將實驗分成兩組，每組培養(yǎng)48 h，每24小時更換1次培養(yǎng)液。實驗組：培養(yǎng)液中TSA濃度400 nmol/L；對照組：培養(yǎng)液中與實驗組TSA等量的DMSO。

1.2主要試劑RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青生物制品公司)；CCK8(上海碧云天生物制品公司)；TSA(美國Cayman公司)；鼠抗人HDAC1、SOX2、BMI1、c-Myc 、GAPDH單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)；鼠抗人E-cadherin、Vimentin單克隆抗體(美國Cell Signaling Technology公司)；羊抗鼠二抗(上海碧云天生物制品公司)。

1.3方法

1.3.1流式分選收集1×106個貼壁培養(yǎng)的胃癌MGC803細胞， 磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2次，重懸在100 μL FACS緩沖液中。設(shè)立實驗組和對照組，實驗組加入CD133-PE和CD133-FITC各10 μL，對照組為CD133-PE和CD133-FITC單陽性對照組，陰性對照加入10 μL同型對照抗體，于4 ℃避光孵育，每隔10 min混懸1次細胞，30 min后流式細胞儀檢測。流式分選的目標(biāo)細胞群體為CD133+和CD133-細胞亞群。

1.3.2平板克隆形成用0.25%胰酶徹底分離MGC803-control 和MGC803-TSA細胞，使其為單細胞懸液，以200個/孔的濃度接種到6孔板中。用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng) 2周，Giemsa染色后計數(shù)菌落個數(shù)。

1.3.3實時熒光定量核酸擴增檢測(RT-qPCR)按照TRIzol(TAKARA,Kyoto,Japan)說明書提取總RNA，經(jīng)紫外分光光度計測量其純度及濃度后，分別取總RNA 1 000 ng，按照運轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成20 μL體系cDNA。以反應(yīng)所得cDNA及SYBR Premix Ex TaqⅡ (TAKARA,Kyoto,Japan)進行定量PCR擴增，以GAPDH為內(nèi)參照。所有引物序列見表1。

表1　RT-qPCR檢測引物序列

1.3.4蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測用含有1 mmol/L蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液在冰上裂解細胞30 min。將總細胞裂解物在4 ℃下離心15 min后吸取上清液并用DAB試劑(Thermo,USA)測量總蛋白水平。以10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，半干電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，室溫下?lián)u床封閉2 h。4 ℃過夜敷一抗，PBST洗膜后放入羊抗鼠二抗(1∶5 000)中，室溫孵育1～2 h，PBST洗膜后電化學(xué)發(fā)光法顯色，以GAPDH為內(nèi)參照。

1.3.5CCK-8檢測用0.25%胰酶分離MGC803-control和MGC803-TSA細胞，使其成為單細胞懸液，以5 000個/孔的濃度接種到96孔板中。每組設(shè)4個平行孔,并設(shè)3個不含細胞的空白對照，37 ℃環(huán)境中用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h使細胞貼壁后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后檢測光密度(OD)值(450 nm)。

1.3.6體外侵襲實驗在Transwells上室中加入20 μL Matrigel/RPMI-1640 (1∶2)混合液后放入37 ℃孵育箱中30 min使其凝固。用0.25%胰酶分離MGC803-control和MGC803-TSA細胞，使其成為單細胞懸液，以3×104個/孔的濃度接種到Transwells上室中。上室再加入200 μL無血清RPMI-1640培養(yǎng)基，下室加入500 μL含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。在37 ℃中培養(yǎng)24 h后，用4%多聚甲醛將上室細胞固定15 min,結(jié)晶紫染色5 min,最后用棉簽小心擦拭染色細胞。隨機取10個200倍下視野拍照并計數(shù)細胞個數(shù)。

2結(jié)果

2.1HDAC1在GCSCs與胃癌非干細胞中的表達將流式分選的CD133+GCSCs和CD133-胃癌非干細胞分別通過RT-qPCR和Western blot的方法在mRNA和蛋白水平上檢測HDAC1表達水平。結(jié)果表明在mRNA和蛋白水平上HDAC1在CD133+GCSCs的表達高于CD133-胃癌非干細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖1、2。

2.2GCSCs增殖能力的變化抑制HDAC1去乙酰化導(dǎo)致GCSCs增殖能力降低。為了檢測HDAC1去乙?；瘜CSCs增殖能力的影響，采用200 nmol/L TSA處理GCSCs 24 h。細胞增殖通過CCK-8實驗和克隆實驗檢測。如圖3所示：前3 d 實驗組與對照組中細胞的增殖能力差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。后3 d 實驗組GCSCs的增殖能力較對照組逐漸減弱，而且隨著時間的推移，兩組差距增大(P<0.05)。TSA抑制GCSCs的增殖能力且具有時間依賴性?？寺⌒纬蓪嶒灲Y(jié)果也表明，實驗組GCSCs的克隆形成能力比對照組明顯減弱(P<0.01)，HDAC1去乙酰化被抑制后GCSCs的增殖能力明顯降低，見圖4。

圖1　流式分選出CD133+和CD133-的胃癌細胞

2.3處理GCSCs后侵襲能力的變化抑制HDAC1去乙酰化導(dǎo)致GCSCs侵襲能力降低基于侵襲是GCSCs重要特征之一，通過Transwell實驗檢測GCSCs的侵襲能力。為了評估HDAC1在GCSCs侵襲中的作用，用TSA抑制HDAC1去乙?；瑥亩笻DAC1失去功能。實驗組GCSCs的侵襲能力顯著減弱(50%，P<0.01)，見圖5。

圖2　RT-qPCR和Western blot鑒定HDAC1在CD133+

2.4抑制HDAC1去乙?；瘜?dǎo)致GCSCs干性蛋白的下調(diào)和介導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)因為胃癌腫瘤干性標(biāo)志物都不夠特異，所以檢測了幾種可能維持腫瘤干細胞干性的轉(zhuǎn)錄因子表達情況。RT-qPCR和Western blot表明實驗組細胞的Sox2、Bmi1和c-Myc 的mRNA和蛋白表達量均比對照組細胞的表達量低(P<0.05)。為探究實驗組侵襲能力減弱的可能機制，筆者進一步檢測了TSA抑制HDAC1乙酰化作用后細胞中侵襲相關(guān)分子的表達，發(fā)現(xiàn)抑制HDAC1乙?；骎imentin的mRNA和蛋白表達均降低(P<0.05)。而E-cadherin的mRNA和蛋白表達均增高(P<0.05)，見圖6。

圖3　CCK-8實驗檢測TSA處理GCSCs

A:兩組克隆實驗；B:兩組克隆個數(shù)定量分析。

圖4克隆實驗檢測TSA處理GCSCs后增殖能力的變化

A:兩組Transweel實驗(×200)；B:兩組侵襲細胞數(shù)定量分析。

圖5處理GCSCs后侵襲能力的變化

圖6　RT-qPCR和Western blot檢測TSA處理GCSCs后

3討論

HDACs屬于去乙?；讣易?，有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4型。HDACs可通過調(diào)節(jié)組蛋白或者轉(zhuǎn)錄因子等其他蛋白的轉(zhuǎn)錄從而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄[9]。近年發(fā)現(xiàn)，HDACs參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，且在人類多種腫瘤細胞中均高表達，如HDACs可增加腫瘤細胞的增殖能力，可影響細胞外基質(zhì)從而增強腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的能力。同時HDACs抑制劑可通過抑制去乙?；饔脧亩种企w外腫瘤細胞的增殖[10]。組蛋白的去乙?；揎椩谂咛ジ杉毎尚缘木S持和分化過程中起著非常重要的作用。大量研究表明，胚胎干細胞特征性的基因都受去乙?；降恼{(diào)控，例如BMI1、OCT4和SOX2等，對胚胎干細胞的自我更新和分化的狀態(tài)產(chǎn)生重要影響[11]。其中，HDAC1是一種與腫瘤關(guān)系最密切的組蛋白去乙?；竅4]。

HDAC1是由美國哈佛大學(xué)的Taunton等發(fā)現(xiàn)的第1個哺乳動物的組蛋白去乙?；?，其蛋白質(zhì)含有482個氨基酸，相對分子質(zhì)量約5.5×104。HDAC1不僅抑制基因的轉(zhuǎn)錄，而且可以通過線粒體轉(zhuǎn)位促進癌基因合成，抑制細胞凋亡與分化障礙。因此，深入探討HDAC1的調(diào)節(jié)機制有助于研發(fā)高效安全的靶向藥物。前期筆者驗證了HDAC1在GCSCs中高表達。為了探究HDAC1去乙酰化作用對GCSCs的影響，通過TSA抑制HDAC1的去乙?；饔茫l(fā)現(xiàn)抑制乙?；驡CSCs的增殖、侵襲及其干性能力均減弱。另外，莊涵虛等[1]用HDAC1 siRNA干擾片段干擾HDAC1的表達后發(fā)現(xiàn)HDAC1 siRNA可使胃癌細胞MGC-803癌基因c-Myc基因表達降低，下調(diào)凋亡相關(guān)蛋白caspase-9、caspase-3及抗凋亡蛋白BCL-2。同時Zhang等[12]發(fā)現(xiàn)HDAC抑制劑能活化胃癌細胞系中的抑癌基因p21 VAF1，組蛋白去乙?；墒刮赴┘毎衟21VAF1基因失活，而p21VAF1基因可影響c-Myc、Bcl-2的表達，從而抑制DNA的復(fù)制，阻斷細胞周期。

研究胃癌細胞的干性對于了解胃癌細胞轉(zhuǎn)移的機制至關(guān)重要。然而，GCSCs的分離和培養(yǎng)仍具有挑戰(zhàn)性。盡管大多數(shù)的胃癌細胞表達CD133，但其可作為GCSCs的一個標(biāo)志分子。本研究發(fā)現(xiàn)抑制HDAC1去乙酰化后，干性因子SOX2、BMI1、c-Myc的表達也隨之降低。張永杰等[13]發(fā)現(xiàn)在腸型胃癌組織標(biāo)本中HDAC1和Oct4兩者表達呈正相關(guān)，且HDAC1可通過調(diào)節(jié)Oct4的表達從而維持干細胞的干性特征和多能性。說明HDAC1的去乙?；饔脤S持GCSCs的干性有影響，因此HDAC1有望成為鑒定和分離GCSCs的一個新的標(biāo)志物。

EMT是胚胎發(fā)育過程中的一個關(guān)鍵步驟，并且是休眠腫瘤細胞獲得侵襲能力的一種最常見的現(xiàn)象[14]。越來越多的證據(jù)表明EMT與GCSCs侵入鄰近胃癌組織相關(guān)[2]。EMT的主要分子機制為上調(diào)間質(zhì)標(biāo)志物和下調(diào)上皮標(biāo)志物[15]。研究發(fā)現(xiàn)，抑制HDAC1去乙?；胶?，GCSCs間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin表達降低和上皮標(biāo)志物細胞黏附分子E-cadherin表達升高，該結(jié)果代表EMT過程的抑制。本研究結(jié)果表明HDAC1去乙酰化作用通過介導(dǎo)EMT促進GCSCs的侵襲作用。

綜上所述，TSA抑制GCSCs HDAC1去乙?；饔煤?，體外GCSCs的增殖、干性和侵襲能力顯著降低。其機制可能與下調(diào)干性標(biāo)志物、凋亡相關(guān)蛋白及EMT相關(guān)蛋白相關(guān)。本研究豐富了HDAC1在GCSCs中的作用研究，探究其成為胃癌預(yù)測指標(biāo)的可能性。但其在腫瘤致瘤、進展、增殖、侵襲等方面相關(guān)具體分子機制復(fù)雜，所以HADC1影響GCSCs干性、增殖和侵襲的其他機制有待進一步研究。

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Effection of HDAC1 deacetylase inhibition on gastric cancer stem cells*

Hou Xilu1,Tang Jun1,Zhu Bin1,Yan Hezhong1,Yu Senyuan1,He Yan2,Li Haiqing1,Wang Jiaoxue1,Liu Wei1△

(1.DepatmentofGastroenterology,theAffiliatedPeople′sLiberationArmyClinicalCollegeofAnhuiMedicalUniversity/the105thHospitalofPeople′sLiberationArmy,Hefei,Anhui230060,China;2.DepatmentofGastroenterology,theAffiliatedPeople′sLiberationArmyClinicalCollegeofBengbuMedicalCollege,Hefei,Anhui230031,China)

[Abstract]ObjectiveTo explore the effect of HDAC1 deacetylase inhibition on the proliferation differentiation and invasion in human gastric cancer stem cells(GCSCs).MethodsThe GCSCs were selected as CD44 marker by using flow cytometry.RT-qPCR and Western Blot were used to detect the expression of HDAC1 in GCSCs and non GCSCs.The effect of proliferation and invasion in GCSCs were observed by CCK-8 assay,colony formation and transwell assay after the cells were treated with TSA.The expression of proteins related apoptosis,differentiation and invasion were detected by using RT-qPCR and Western blot.ResultsThe expression of HDAC1 in GCSCs was higher than that in non GCSCs.The capacities of proliferation and invasion in experimental group were attenuated compared to the control group.The proteins related differentiation was down regulated,and epithelial mesenchymal transition was mediated.ConclusionAfter the deacetylation of HDAC1 was inhibited,the proliferation,differentiation and invasion of GCSCs were reduced.

[Key words]HDAC1;gastric cancer stem cells;proliferation;differentiation;invasion

doi:·論著·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.17.005

*基金項目：南京軍區(qū)面上A類項目(11MA041)。

作者簡介：侯曦露(1989-)，住院醫(yī)師，碩士，主要從事胃癌的分子生物學(xué)研究?！魍ㄓ嵶髡?，Tel:18909696246；E-mail:liuwei196432@sina.com。

[中圖分類號]R735.2

[文獻標(biāo)識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)17-2319-04

(收稿日期：2015-11-28修回日期：2016-01-14)