桑蠶卵蛋白的制備及其特性研究

丁克廉， 王建芳， 鄧紅俠， 岳 原

(西北農(nóng)林科技大學(xué)理學(xué)院，陜西楊凌 712100)

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桑蠶卵蛋白的制備及其特性研究

丁克廉， 王建芳*， 鄧紅俠， 岳 原

(西北農(nóng)林科技大學(xué)理學(xué)院，陜西楊凌 712100)

摘要[目的]探索蠶卵蛋白的提取制備方法并對其特性進(jìn)行分析。[方法]采用堿溶酸沉法提取制備蠶卵蛋白粉，測定其等電點(diǎn)，并進(jìn)一步檢測分析其蛋白質(zhì)含量、氨基酸組成及其酶解特性等。[結(jié)果]試驗(yàn)顯示，蠶卵蛋白的等電點(diǎn)為4.55，其氨基酸組成豐富，含有人體必需的多種氨基酸，用堿性蛋白酶水解后得到以三肽為主的多肽類物質(zhì)。[結(jié)論]采用該研究方法可獲得蠶卵蛋白多肽，為蠶卵蛋白的開發(fā)利用奠定研究基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞桑蠶卵；卵蛋白；蛋白質(zhì)特性；酶解；多肽

蠶業(yè)生產(chǎn)中每年都會有一些桑蠶種因相關(guān)質(zhì)量指標(biāo)不合格而被淘汰銷毀，而對廢棄蠶卵資源開發(fā)利用的研究目前還不多見。經(jīng)檢測，桑蠶卵中蛋白質(zhì)含量超過了干物質(zhì)的50%。卵蛋白存在于一切卵生動(dòng)物中，含有大量高密度糖脂蛋白，對生物體具有相當(dāng)重要的生理功能。此外，蛋白多肽比大分子的蛋白質(zhì)更易于吸收利用，且對生物體更具有生理活性，近幾年人們利用生物技術(shù)不斷獲得具有多種生物活性功能的多肽類產(chǎn)品，如免疫活性肽、抗氧化肽等[1-2]。筆者利用蛋白質(zhì)堿溶酸沉的性質(zhì)從桑蠶卵中提取制備了蠶卵蛋白，檢測了其相關(guān)的特性指標(biāo)，并經(jīng)過堿性蛋白酶水解得到了以三肽為主的多肽類物質(zhì)。該研究可為廢棄桑蠶種卵資源的開發(fā)利用奠定實(shí)踐基礎(chǔ)，并為進(jìn)一步開發(fā)新產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料桑蠶種卵，陜西省石泉縣蠶種場淘汰的廢棄桑蠶種。主要試劑：活性﹥10 000 U/g的堿性蛋白酶(wolsen),雙縮脲試劑(1%的硫酸銅溶液和20%的氫氧化鈉溶液1∶2.5混合)，10%三氯乙酸(TCA)溶液，還原型谷胱甘肽GSH (Solarbio)等。主要儀器、裝置：集熱式磁力攪拌恒溫水浴鍋，索氏提取裝置，數(shù)顯pH計(jì)，磁力攪拌器，超聲清洗器，F(xiàn)OSS-2300型定氮儀，L-8900型全自動(dòng)氨基酸分析儀，722s型可見分光光度計(jì)，UN mini-1240型紫外分光光度計(jì)，分析天平，恒溫干燥箱，離心機(jī)等。

1.2方法

1.2.1原材料預(yù)處理。將廢棄鮮蠶卵置于電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱，50 ℃干燥至水分低于5%，用多功能粉碎機(jī)粉碎,過60目篩。將此干蠶卵粉用濾紙筒包好置于索氏提取裝置中，以石油醚(沸程30～60 ℃)進(jìn)行回流脫脂5 h左右，觀察到抽提筒中溶劑無顏色、滴在濾紙上揮干后無油斑時(shí)，取出打開濾紙包，倒出脫脂蠶卵粉，室溫?fù)]干殘留溶劑，備用。

1.2.2桑蠶卵蛋白的提取制備。稱取干燥的脫脂蠶卵粉20 g，加入200 mL蒸餾水中，以數(shù)顯pH計(jì)監(jiān)測，用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)并保持pH(10.50±0.10)，50 ℃水浴恒溫?cái)嚢枞芙獾鞍? h左右，當(dāng)pH不再下降時(shí)，停止攪拌，靜置2 h。雙層篩網(wǎng)過濾，濾渣洗滌后再過濾，2次濾液合并，3 000 r/min離心10 min，上清液經(jīng)濾紙過濾。濾液在室溫、數(shù)顯pH計(jì)監(jiān)測、磁力攪拌下，以1 mol/L的鹽酸溶液緩慢調(diào)節(jié)pH至出現(xiàn)大量沉淀時(shí)(此為蠶卵蛋白的等電點(diǎn))，停止攪拌，于4 ℃靜置過夜。次日，棄去上清液，以蒸餾水洗滌沉淀物數(shù)次至上清液pH 5～6，沉淀經(jīng)真空冷凍干燥后制成蠶卵蛋白粉，備用。

1.2.3蛋白質(zhì)含量及氨基酸組成分析。采用凱氏定氮儀測定以上制備的桑蠶卵蛋白粉中蛋白質(zhì)含量，采用全自動(dòng)氨基酸分析儀檢測其氨基酸組成。

1.2.4桑蠶卵蛋白的酶解。分別稱取以上制備的蠶卵蛋白粉0.2、0.5 g，加入100 mL蒸餾水中，用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 10.50～11.00、50 ℃恒溫條件下攪拌，期間超聲輔助溶解1～2次，至完全溶解為粉紅色均勻的膠狀溶液，分別得到2 mg/mL和5 mg/mL的蠶卵蛋白溶液，留取10 mL此蛋白樣液備用。參考文獻(xiàn)[3-4]方法稍作調(diào)整，室溫下稱取堿性蛋白酶3 g加入剩余的90 mL蛋白溶液中，調(diào)節(jié)溶液的pH為8.50，然后在50 ℃水浴中恒溫?cái)嚢杳附? h左右，期間在數(shù)顯pH計(jì)監(jiān)測下，以0.5 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)并保持pH(8.50±0.10)，精確記取酶解過程所消耗的NaOH溶液的體積VNaOH和濃度CNaOH。至pH不再下降時(shí)，沸水浴使酶滅活10 min，靜置冷卻至室溫，3 000 r/min離心10 min，上清液經(jīng)粉末活性炭脫色脫臭，雙層濾紙過濾后定容至90 mL，得到的蠶卵蛋白酶解液濃度以所稱取的蠶卵蛋白粉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)。蠶卵蛋白酶解液的水解度(DH)以下式計(jì)算：

式中,CNaOH為NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(mol/L)；VNaOH為消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(mL)；Mp為所稱取的蠶卵蛋白粉中蛋白質(zhì)的含量(g)；htot為1 g蠶卵蛋白質(zhì)的肽鍵總數(shù)；α為氨基解離度，由水解時(shí)的pH和氨基解離常數(shù)pK決定。

1.2.5桑蠶卵蛋白多肽的鑒定。

1.2.5.1紫外吸收法。將制備好的蠶卵蛋白液、蠶卵蛋白酶解液和GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液分別用10%TCA溶液稀釋至質(zhì)量濃度為0.20 mg/L，搖勻并離心除去蛋白質(zhì)后，用UN mini-1240型紫外分光光度計(jì)在波長200～400 nm范圍掃描，以空白(蒸餾水)校基線，獲取各溶液在此區(qū)間的最大吸收波長λmax和最大吸光度值A(chǔ)max。

1.2.5.2雙縮脲法。將制備好的蠶卵蛋白液、蠶卵蛋白酶解液分別用10% TCA溶液稀釋至質(zhì)量濃度為1.00 mg/L，將GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液用10% TCA溶液稀釋至質(zhì)量濃度為2.00 mg/L，搖勻并離心除去蛋白質(zhì)后，加入雙縮脲試劑反應(yīng)顯色30 min，觀察各溶液的顏色，并用722s型可見分光光度計(jì)測定其在波長540 nm處的吸光度值。

2結(jié)果與分析

2.1桑蠶卵蛋白的提取制備及等電點(diǎn)利用蛋白質(zhì)堿溶酸沉的性質(zhì)從脫脂蠶卵粉中提取到了粉紅色的蠶卵蛋白粉。并檢測到蠶卵蛋白的等電點(diǎn)pI為4.55，經(jīng)凱氏定氮法檢測其中蛋白質(zhì)含量為66.17%。

2.2桑蠶卵蛋白的氨基酸組成經(jīng)全自動(dòng)氨基酸分析儀檢測到桑蠶卵蛋白的氨基酸組成及1 g蛋白質(zhì)含肽鍵毫摩數(shù)htot計(jì)算如表1。可以看出，蠶卵蛋白的氨基酸組成很豐富，總含量65.26 g,其中含有人體必需的多種氨基酸;1 g蛋白質(zhì)含肽鍵總數(shù)為8.20 mmol/g。

表1　桑蠶卵蛋白的氨基酸組成

圖1　紫外吸收光譜Fig.1　Ultraviolet absorption spectrum

2.3蠶卵蛋白的酶解蠶卵蛋白溶液經(jīng)堿性蛋白酶水解、凈化等處理后分別得到2 mg/mL及5 mg/mL的淺黃色的蠶卵蛋白酶解液，水解過程分別消耗0.553 2 mol/L的NaOH溶液1.20和2.95 mL，計(jì)算得知酶解液的水解度(DH)為70.30%和69.13%。

2.4蠶卵蛋白酶解液主要成分鑒定

2.4.1紫外吸收法。蠶卵蛋白多肽的紫外光譜吸收鑒定結(jié)果如圖1。蛋白質(zhì)或多肽類物質(zhì)因含有某些芳香氨基酸殘基而在波長280 nm附近有最大特征吸收[5]，由于不同蛋白質(zhì)的芳香氨基酸殘基的數(shù)量和位置不同，其最大吸收波長也會有差異。經(jīng)10%TCA沉淀后，蠶卵蛋白液的上清液在波長200～400 nm未掃描出吸收峰；而未經(jīng)10%TCA沉淀的蠶卵蛋白液和經(jīng)10%TCA沉淀后的酶解液及GSH溶液在波長290 nm附近均有最大吸收峰，三者的最大吸收波長很接近，表明酶解液中含有多肽類物質(zhì)。

2.4.2雙縮脲法。雙縮脲反應(yīng)顯色結(jié)果如圖2。加入10%TCA后，蠶卵蛋白溶液中出現(xiàn)大量沉淀，其上清液加入雙縮脲試劑后微顯淡藍(lán)色(圖2中2#管)，與空白管(圖2中0#管)顯色相近；而酶解液幾乎無沉淀出現(xiàn)，其上清液加入雙縮脲試劑后顯紫色(圖2中3#管)；GSH溶液無沉淀，加入雙縮脲試劑后顯藍(lán)紫色(圖2中4#管)；未經(jīng)10%TCA沉淀的蛋白液加入雙縮脲試劑后呈紫紅色(圖2中1#管)。雙縮脲反應(yīng)是針對分子中的NH2—CO—NH—CO—NH2結(jié)構(gòu)的，是蛋白質(zhì)或多肽特有的反應(yīng)[5]，其顯色的差異可反映出肽鏈的長短，如二肽呈藍(lán)色、三肽呈紫色、四肽及以上呈紅色[6]。該試驗(yàn)用10%TCA溶液除去酶解液中的蛋白質(zhì)后，酶解液與雙縮脲試劑反應(yīng)顯現(xiàn)紫色，并且A540 nm值為0.711，表明其中含有多肽類物質(zhì)，且以三肽居多。

3結(jié)論與討論

采用該試驗(yàn)的技術(shù)條件可從桑蠶卵中提取蠶卵蛋白，并測得其等電點(diǎn)pI為4.55。檢測到蠶卵蛋白的氨基酸組成很豐富，含有多種人體必需氨基酸。采用該試驗(yàn)的技術(shù)條件以堿性蛋白酶水解蠶卵蛋白，水解過程保持pH 8.50可使水解度達(dá)到70%左右，此時(shí)的酶解液含有以三肽為主的多肽類物質(zhì)。該研究所獲得的蠶卵蛋白多肽的功能特性還有待于進(jìn)一步試驗(yàn)研究。

圖2　雙縮脲反應(yīng)顯色結(jié)果Fig.2　Biuret color rendering results

參考文獻(xiàn)

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[3] 盧楠,廖鮮艷,翁新楚,等.蠶蛹抗氧化肽的制備及其體外抗氧化活性評價(jià)[J].上海大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2013,19(2):215-220.

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[5] 郭藹光.基礎(chǔ)生物化學(xué)[M].西安:世界圖書出版公司,1997：43-46.

[6] 李德和,李長太.實(shí)驗(yàn)有機(jī)化學(xué)[M].濟(jì)南:山東科學(xué)技術(shù)出版社,1980:134-135.

基金項(xiàng)目西北農(nóng)林科技大學(xué)科技創(chuàng)新與成果轉(zhuǎn)化基金項(xiàng)目(XNY2013-57)。

作者簡介丁克廉(1958- )，男，陜西武功人，高級實(shí)驗(yàn)師，從事分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)研究。*通訊作者，高級實(shí)驗(yàn)師，碩士，從事分析化學(xué)及蠶桑實(shí)驗(yàn)技術(shù)研究。

收稿日期2016-04-05

中圖分類號S 881.2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611(2016)13-069-03

Study of Preparation and Characteristic of Silkworm Egg Albumin

DING Ke-lian, WANG Jian-fang*, DENG Hong-xia et al

(College of Science, Northwest A&F University, Yangling, Shaanxi 712100)

Abstract[Objective]To explore the extraction and preparation method of silkworm egg albumin and analyze its characteristics. [Method]The silkworm egg protein powder was prepared by alkali-solution and acid-isolation method from silkworm eggs. And its isoelectric point, protein content, amino acid composition and enzymolysis characteristic was measured and analyzed. [Result]The result showed the isoelectric point of silkworm egg albumin was 4.55. And its amino acid composition was plentiful, there were many kinds of essential amino acid.Polypeptides mainly containing tripeptide were obtained after the hydrolysis of alkaline protease. [Conclusion]Using the research method can obtain silkworm egg albumin polypeptide. The study can provide research basis for the utilization of silkworm egg albumin.

Key wordsSilkworm egg; Egg albumin; Protein character; Enzymolysis; Polypeptide