響應面法優(yōu)化超聲波-微波協(xié)同提取富硒蛹蟲草硒多糖工藝

張國財，趙 博，劉春延，趙金艷，林連男，于 舒（東北林業(yè)大學林學院，黑龍江 哈爾濱　150040）

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響應面法優(yōu)化超聲波-微波協(xié)同提取富硒蛹蟲草硒多糖工藝

張國財，趙 博，劉春延，趙金艷，林連男，于 舒
（東北林業(yè)大學林學院，黑龍江 哈爾濱150040）

摘 要：在單因素試驗基礎上，采用響應面法對富硒蛹蟲草硒多糖超聲波-微波協(xié)同提取工藝進行優(yōu)化，并與超聲波提取法和水提法提取硒多糖抗氧化活性進行比較分析，探究3種提取方法對硒多糖提取效果 的影響。結果表明：超聲波-微波協(xié)同提取最佳工藝條件為超聲時間26.0 min、微波時間3.20 m in、微波功率350 W、液料比32.00∶1（mL/g），在此條件下，硒多糖提取率為5.05%，比超聲提取法和水提法分別提高了19.96%和3.70%；3種提取方法硒多糖體外抗氧化活性排序依次為：超聲波-微波協(xié)同 提取法＞超聲波提取法＞水提法。此外，超聲波-微波協(xié)同提取法可獲得更高的多糖硒含量，為360.37 mg/kg，相比超聲提取法和水提法分別提高了4.47%和12.92%。

關鍵詞：響應面法；超聲波-微波協(xié)同；富硒蛹蟲草；硒多糖；抗氧化活性

引文格式：

張國財, 趙博, 劉春延, 等. 響應面法優(yōu)化超聲波-微波協(xié)同提取富硒蛹蟲草硒多糖工藝[J]. 食品科學, 2016, 37(12): 33-39. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201612006. http://www.spkx.net.cn

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蛹蟲草（Cordyceps militaris (Vuill.) Fr.）屬子囊菌門（Ascomycota）昆蟲寄生真菌，為我國傳統(tǒng)名貴藥食同源中藥材之一。已有研究[1]表明，蛹蟲草富含核苷、多糖、生物堿、甾醇等多種活性物質。其中，多糖類化合物作為蛹蟲草重要的活性物質之一，具有抗氧化/衰老[2]、抗腫瘤[3]、調節(jié)免疫[4]、抗炎[5]等諸多藥理作用。硒是人體必需的微量元素，缺硒會導致人體多種疾病發(fā)生[6]。然而，硒的生物利用度與其化學形態(tài)關系密切，有機硒更易為機體吸收和利用，且具有較高的安全性[7]。真菌對硒具有良好的富集能力，并將無機硒轉化成有機硒[8]，其中，多糖結合硒是硒在食用菌中主要賦存形態(tài)之一[9-10]。此外，硒多糖作為一種有機硒化合物兼有多糖和硒二者的活性和優(yōu)點[11]。研究[12-14]表明，相比普通多糖，硒多糖具有更高的抗氧化、抗腫瘤及免疫增強活性。因此，以富硒食用菌為原料開發(fā)硒多糖功能食品或加工成膳食補充劑已成為未來發(fā)展的必然趨勢。

已有研究表明，蛹蟲草有很強的富硒和耐硒能力[15]，且富硒蛹蟲草硒多糖抗氧化活性均高于普通蟲草多糖[16-17]，利用富硒蛹蟲草活性物質開發(fā)藥物或保健品已引起業(yè)界的廣泛關注，其開發(fā)潛力大，應用前景廣闊。目前，對蟲草多糖提取工藝研究亦多有報道[18-19]，但對富硒蛹蟲草產品研究較少。此外，研究[20-21]證實，硒多糖熱穩(wěn)定性較差，可見若利用現有的蟲草多糖工藝條件提取蛹蟲草硒多糖，必然會造成活性的大幅下降，然而迄今針對硒多糖提取工藝的研究鮮有報道。超聲波-微波協(xié)同提取法具有提取時間短、提取率高及對有效成分影響小等優(yōu)點，目前已成功應用于多種多糖提取研究中[22-24]。因此， 本實驗采用響應面法對超聲波-微波協(xié)同提取富硒蛹蟲草硒多糖工藝進行優(yōu)化，并與超聲波提取法和傳統(tǒng)水提法的提取效果和硒多糖抗氧化活性進行比較分析，旨在提供一套高效富硒蛹蟲草硒多糖提取工藝，為其生產和綜合開發(fā)利用提供依據，亦可為普通蛹蟲草多糖提取工藝提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

蛹蟲草母種由東北林業(yè)大學森林保護學國家重點學科保藏；富硒蛹蟲草由本實驗室自行栽培，以亞硒酸鈉為硒源，硒添加量為200 mg/kg，蛹蟲草子座有機硒含量為187.89 mg/kg，無機硒含量為0.09 mg/kg。

葡萄糖標準品、硒標品、2,3-二氨基萘、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）美國Sigma公司；抗?OH試劑盒、抗O2－·試劑盒南京建成生物工程研究所；其他試劑購于國藥集團化學試劑有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2儀器與設備

GE ULtrospec 5300 pro紫外分光光度計美國通用電氣醫(yī)療集團；F-2500熒光分光光度計日本日立公司；JY92-IIN超聲波細胞粉碎機寧波新芝生物科技股份有限公司；G70F23CN2P-BM1（S0）微波爐格蘭仕微波爐電器制造有限公司。

1.3方法

1.3.1提取工藝流程

富硒蛹蟲草子座→鼓風干燥（溫度為45 ℃至恒質量）→粉粹（100 目篩）→超 聲提取→微波提取→抽濾→濾液→醇沉過夜（體積分數80%乙醇溶液）→離心（8 000 r/min）→沉淀→AB-8大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附脫色→Sevag法除蛋白→醇沉過夜（體積分數80%乙醇溶液）→沉淀→無水乙醇、丙酮、乙醚依次洗滌去脂→透析（截流量為分子質量3 500 kD）→超濾濃縮（截流量為分子質量2 000 kD）→冷凍干燥→粗多糖粉末。

1.3.2單因素試驗

以富硒蛹蟲草粉末為原料，分別研究超聲功率、超聲時間、微波功率、微波時間及液料比對富硒蛹蟲草多糖提取率的影響。提取基本條件為：超聲時間25 min、超聲功率400 W、微波時間3 min、微波功率280 W、液料比30∶1（mL/g）。各因素水平為：超聲時間5、15、25、35、45、55、65 min；超聲功率200、250、300、350、400、450、500 W；微波時間0.5、1、3、5、7、9、11 min；微波功率140、210、280、350、420、490、560 W；液料比5∶1、30∶1、45∶1、60∶1、75∶1、90∶1（mL/g）。

1.3.3響應面優(yōu)化試驗

根據提取工藝單因素試驗結果，選擇超聲時間、微波時間、微波功率、料液比4 個因素，選用Box-Behnken模型對以上因素進行響應面設計，以富硒蛹蟲草多糖提取率為響應值進行優(yōu)化。試驗設計因素與水平見表1。

表1　Box-Behnken試驗因素與水平Table 1　Scheme of Box-Behnken design

1.3.4硒多糖和多糖硒含量的測定

1.3.4.1硒多糖含量測定和提取率的計算

采用苯酚-硫酸法[25]進行測定。線性回歸得標準曲線為：y=15.059 8x＋0.042 5（y為吸光度；x為硒多糖質量濃度/（mg/mL）），R2=0.999 8，線性范圍為0.016～0.16 mg/mL。根據標準曲線計算硒多糖提取率，按公式（1）計算：

式中：mp為硒多糖提取量/g；mt為富硒蛹蟲草子座原料用量/g。

1.3.4.2多糖硒含量測定

采用熒光分光光度法[26]對樣品多糖硒含量進行測定。線性回歸得標準曲線為：y=15 042x＋149.27，（y為熒光讀數；x為試管中硒含量/μg），R2=0.999 6，線性范圍為0～0.5 μg。具體操作為：精確稱取粗多糖粉末0.05 g，以雙蒸水定容至100 mL，取溶液1 mL測定硒含量，以經硝化樣品多糖中總硒含量，以未經硝化樣品測定其無機硒含量，多糖硒含量按公式（2）計算：

式中：mst為多糖中總硒質量/μg；msi為多糖中無機硒質量/μg；msp為硒多糖質量/g。

1.3.5不同提取方法硒多糖抗氧化活性測定

分別利用超聲波-微波協(xié)同提取法、超聲波提取法和水提法提取富硒蛹蟲草硒多糖，并對體外抗氧化活性進行比較分析。其中，水提法取條件為：提取溫度90 ℃、提取時間2 h、液料比30∶1（mL/g）；超聲波提取法提取條件為：超聲功率500 W、超聲時間40 min、超聲溫度50 ℃、液料比40∶1（mL/g）。

1.3.5.1總還原能力測定

參照文獻[27]方法進行測定。

1.3.5.2?OH清除率測定

采用抗?OH試劑盒，按說明書進行測定。

1.3.5.3DPPH自由基清除率測定

參照文獻[28]方法進行測定。

1.4數據處理

實驗所得數據利用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析，顯著性檢驗采用最小顯著差數法。

2　結果與分析

2.1單因素試驗結果

圖1　超聲時間（a）、超聲功率（b）、微波時間（c）、微波功率（d）及液料比（e）對硒多糖提取率的影響Fig. 1　Effects of ultrasonication time (a), ultrasonic power (b), microwave treatment time (c), microwave power (d) and liquor to solid ratio (e) on Se-polysaccharides yield

由圖1a可知，隨著超聲時間的延長，富硒蛹蟲草硒多糖提取率呈明顯上升趨勢，當超聲時間為25 min時，硒多糖提取率最高，為4.59%，當超聲時間大于25 min后，提取率逐漸下降，因此選擇超聲時間25 min對硒多糖進行提取。同理由圖1b～1e可得，確定超聲功率400 W、微波時間3 min、微波功率350 W，液料比30∶1（mL/g）為適宜提取條件。由SPSS 17.0 軟件方差分析得，除超聲功率對提取率影響不顯著外（P＞0.05），其余各因素對硒多糖提取率，存在極顯著影響（P＜0.01）。此外，單因素試驗結果表明，當超聲時間、微波時間及微波功率超過適宜條件后，其硒多糖提取率均呈現出了不同程度的下降，這可能是由于過長的超聲波機械作用和熱效應或過長/強的微波強熱效應，使部分硒多糖發(fā)生降解造成的[29-30]。

2.2響應面優(yōu)化試驗

2.2.1響應面試驗結果

根據單因素試驗結果，選取超聲時間、微波時間、微波功率及液料比4 個因素，采用四因素三水平進行響應面設計，試驗方案及結果見表2。

表2　Box-Behnken試驗設計與結果Table 2　Scheme and results of Box-Behnken design

2.2.2回歸方程的建立與顯著性檢驗

利用Design-Expert 8.0軟件，通過對多項式回歸分析，得到的擬合全變量二次回歸方程模型為：Y=5.05＋0.10A＋0.12B＋0.065C＋0.078D－0.11AB－0.012AC－0.086AD－0.17BC－0.074BD＋0.034CD－0.38A2－0.41B2－0.42C2－0.25D2?；貧w方程及偏回歸系數方差分析結果見表3。

表3　回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted quadratic polynomial model

2.2.3響應面各因素交互作用分析

由圖2可知，AB、AD、BC及BD響應曲面坡度陡峭，交互作用高度顯著，CD響應面相對陡峭，交互作用顯著，但AC交互作用不顯著。4 個因素中微波時間和超聲時間對富硒蛹蟲草硒多糖提取率影響最大，隨著二者的延長，硒多糖提取率亦快速上升。

圖2　兩因素交互作用對富硒蛹蟲草硒多糖提取率影響的響應面分析Fig. 2　Response surface plots showing the interactive effects of four extraction parameters on Se-polysaccharides yield

2.2.4優(yōu)化提取工藝參數的驗證

對回歸模型進行響應面分析，得到最佳工藝條件為：超聲時間26.02 min、微波時間3.21 min、微波功率354.22 W、液料比31.88∶1（mL/g）。在此條件下，硒多糖提取率預測值為5.07%。考慮到實際操作，選用超聲時間26.0 min、微波時間3.20 min、微波功率3 5 0 W、液料比3 2.0 0∶1（m L/g），在此條件下，經3 次重復實驗，得到硒多糖提取率平均值為5.05%，由此確定富硒蛹蟲草硒多糖提取工藝條件。

2.3不同提取方法的富硒蛹蟲草硒多糖體外抗氧化能力比較

圖3　不同提取方法得富硒蛹蟲草硒多糖體外抗氧化能力Fig. 3　Reducing power (a) and scavenging effects on hydroxyl radical (b), DPPH radical (c) and superoxide radical (d) of SCMP obtained with different extraction methods

由圖3a可知，硒多糖質量濃度在0.5～3.5 mg/mL范圍內，3種方法提取富硒蛹蟲草硒多糖均具有一定的還原能力，且隨硒多糖質量濃度的增大而增加，呈現明顯的量效關系，其中，超聲波-微波協(xié)同法提取硒多糖總還原能力最高，超聲波提取法次之，水提法硒多糖總還原能力最弱。當硒多糖質量濃度為3.5 mg/mL時，其吸光度分別為0.372、0.335和0.251。方差分析結果表明，即3種提取方法對硒多糖總還原能力影響極顯著（P＜0.01）。

由圖3b可知，3種方法提取的多糖均表現出質量濃度與·OH清除率間的量效關系，當硒多糖質量濃度在0.6～1.8 mg/mL范圍內，超聲波-微波協(xié)同提取和超聲波提取硒多糖對·OH清除率均隨著質量濃度的增加而上升，其后趨于平穩(wěn)，而水提法硒多糖在所選質量濃度范圍內，清除率始終呈緩慢上升趨勢，且低于超聲波-微波協(xié)同提取和超聲波提取的清除率。利用SPSS 17.0軟件擬合計算，超聲波-微波協(xié)同提取、超聲波提取法和水提法硒多糖對·OH清除率IC50值分別為0.766、1.019 mg/mL和1.324 mg/mL，以超聲波-微波協(xié)同提取清除能力最強。方差分析結果表明，不同方法提取的硒多糖對·OH清除率IC50值間存在極顯著差異（P＜0.01）。

由圖3c可知，在一定的質量濃度范圍內，3種方法對硒多糖DPPH自由基清除率均隨著質量濃度的增加而增強，呈現顯著劑量依賴性，且具有較強的DPPH自由基清除能力，當超聲波-微波協(xié)同提取硒多糖的質量濃度為0.55 mg/mL時，其對DPPH自由基清除率即達90.81%，當硒多糖質量濃度為0.65 mg/mL時，超聲波提取法和水提法硒多糖對DPPH自由基清除率亦超過70%。經SPSS 17.0軟件分析得，超聲波-微波協(xié)同提取、超聲波提取法及水提法硒多糖對DPPH自由基清除率IC50值依次為0.143、0.238 mg/mL 和0.322 mg/mL，以超聲波-微波協(xié)同法提取硒多糖清除能力最強。方差分析結果表明，不同方法提取的硒多糖對DPPH自由基清除率IC50值間差異極顯著（P＜0.01）。

表3　不同提取方法提取效果綜合比較分析Table 3 Comparative analysis of different extraction methods

由表3可知，超聲波-微波協(xié)同提取法可有效縮短提取時間，提高硒多糖提取率，且提取多糖具有較高的硒含量和抗氧化活性。相比超聲波提取法，超聲波-微波協(xié)同提取法硒多糖提取率由4.21%提升到了5.05%，提高了19.96%，差異極顯著（P＜0.01），相比水提法，超聲波-微波法提取率雖然僅提高了3.70%，差異顯著（P＜0.05），但提取的硒多糖具有更高的抗氧化活性，其對·OH和DPPH自由基清除能力IC50值分別提高了42.15%和55.59%，差異極顯著（P＜0.01）。此外，實驗結果表明，不同提取方法對多糖中硒含量產生不同程度的影響，超聲波-微波協(xié)同法提取多糖硒含量最高，為360.37 mg/kg，相比超聲提取法和水提法分別提高了4.47%和12.92%，方差分析結果表明，超聲波-微波協(xié)同法與超聲法差異不顯著（P＞0.05），但與水提法差異極顯著（P＜0.01），三者差異均顯著（P＜0.05）。

3　討論與結論

多糖的生物活性與其結構包括化學組成、分子質量、分支、糖苷鍵、高級結構、理化性質等關系十分密切[31-33]。同時，利用不同方法提取多糖，其分子質量、單糖比例、糖醛酸含量、形貌特征、黏度具有一定差異[34-36]，從而對其活性產生不同程度的影響。實驗中不同提取方法硒多糖體外抗氧化活性比較分析結果表明，3種提取方法對富硒蛹蟲草硒多糖總還原能力、·O H、O2－·及D PPH自由基清除率影響顯著，總體上超聲波-微波協(xié)同提取法＞超聲波提取法＞水提法。除以上原因外，這也可能是由于硒多糖穩(wěn)定性較差，在長時間的高溫或超聲波機械剪切作用下，導致硒多糖結構發(fā)生改變或降解[37]，從而造成了多糖活性下降。本研究結果還發(fā)現，不同提取方法對富硒蛹蟲草多糖硒含量亦具有一定的影響，以超聲波-微波協(xié)同提取法硒含量最高，達360.37 mg/kg，這可能是由于硒在富硒蛹蟲草多糖不同極分中分布不均，而不同方法提取的多糖分子質量分布不同引起的[34]。另一方面，從硒多糖提取率看，超聲波-微波協(xié)同法的硒多糖提取率比超聲波法提高了19.96%，比水提法僅提高了3.70%，分析其原因，推測是相比單一超聲波提取，超聲波-微波協(xié)同提取在適宜的超聲波的空化作用和次級效應加之微波的熱效應以及二者的協(xié)同作用下[38-39]，可在短時間內進一步破壞富硒蛹蟲草細胞結構，增加了細胞膜和細胞壁的通透性[40]，更有利于硒多糖釋放進入溶劑中，進而大幅提高了提取率；而傳統(tǒng)水提法因長時間的高溫作用，亦有利于多糖的溶出[41]，從而獲得了較高的提取率，確切機理還有待于進一步研究。

在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken試驗設計和響應面分析法，得到超聲波-微波協(xié)同提取富硒蛹蟲草硒多糖最佳工藝條件為超聲時間26.0 min、微波時間3.20 min、微波功率350 W、液料比32.00∶1 （mL/g），在此條件下，硒多糖提取率可達5.05%，相比超聲波提取法和水提法，硒多糖提取率分別提高了19.96%和3.70%。

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Optimization of Ultrasound-Microwa ve Assisted Extraction of Selenium-Containing Polysaccharides from Se-Enriched Cordyceps militaris by Response Surface Methodology

ZHANG Guocai, ZHAO Bo, LIU Chunyan, ZHAO Jinyan, LIN Liannan, Y U Shu
(College of Forestry, Northeast Forestry Univer sity, Harbin150040, China)

Abstract:Response surface methodology was used to optimize the ultrasound-microwave assi sted extraction (UME) of selenium-containing polysaccharid es from Se-enriched Cordyceps militaris (SCMP) based on single factor experiments. The yield, selenium content and antioxidant activities in vitro of SCMP were compared with those obtained with hot water extraction (HW E) and ultrasonic extraction (UE). The results indicated that the optimum conditions for UME extraction were as follows: ultrasonication time, 26.0 min; subsequent microwave trea tment, 3.20 min; microwave power, 350 W; and ratio of liquor to solvent, 32.00:1 (mL/g). Under these conditions, the ex traction yield of SCMP was 5.05%, which was inc reased by 19.96% and 3.70% compared with UE an d HWE, respectively. Furthermore, the SCMP prepared by UME exhibited the strongest antioxidant activity and contained the highest level of organic selenium, and its selenium content was 360.37 mg/kg, which was increased by 4.47% and 12.92% as compared with those obtained with UE and HWE.

Key words:response surface methodology; ultr asound-mi crowave assisted extraction; Se-enriched Cordyceps militaris; Se-p olysaccharides; antioxidant activity

收稿日期：2015-09-29

基金項目：中央高校基本科研業(yè)務費專項（2572014AA08）

作者簡介：張國財（1964—），男，教授，博士，研究方向為森林資源保護及利用。E-mail：zhang640308@126.com

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201612006 [10] 鐵梅. 食用菌中硒的形態(tài)分析[D]. 上海: 華東師范大學, 2006. 10.7666/d.y896676.

中圖分類號：TS209

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6630（2016）12-0033-07