淫羊藿苷對顱腦損傷大鼠血清MBP、GFAP表達(dá)的影響*

方永軍　周雄波　周　鋒　徐澤彪　胡珍淵　范小璇　韋鵬方

陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院(咸陽 712000)

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淫羊藿苷對顱腦損傷大鼠血清MBP、GFAP表達(dá)的影響*

方永軍周雄波周鋒徐澤彪胡珍淵范小璇韋鵬方△

陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院(咸陽 712000)

摘要目的：探討不同劑量淫羊藿苷對顱腦損傷大鼠血清MBP、GFAP含量的影響。方法：100只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、ICA低劑量治療組(30mg/kg·d)、中劑量治療組(60mg/kg·d)及高劑量治療組(120mg/kg·d)。各組分別在造模后第1、3、7、14天取血，測定血清MBP、GFAP含量。結(jié)果：模型組與假手術(shù)組同期比較，MBP及GFAP含量增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 各治療組與模型組同期比較，MBP及GFAP含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高劑量治療組與低劑量治療組同期比較，MBP及GFAP含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：Ica對創(chuàng)傷性腦損傷大鼠有腦保護(hù)作用，其作用與Ica劑量呈正相關(guān)，其機(jī)制與抑制MBP、GFAP 表達(dá)有關(guān)。

主題詞顱腦損傷動物實(shí)驗(yàn)大鼠

顱腦損傷(traumatic brain injury，TBI)居全身創(chuàng)傷發(fā)生率的第二位，但致死率、致殘率卻高居首位。顱腦損傷患者醫(yī)療費(fèi)用不斷增加，美國國立衛(wèi)生研究院調(diào)查顯示[1]，一名嚴(yán)重顱腦損傷幸存者，如果得到精心的醫(yī)治和護(hù)理，估計(jì)一生的花費(fèi)可能超過400萬美元。顱腦損傷多見于交通事故，亞洲開發(fā)銀行的報告顯示，中國交通事故也可能對經(jīng)濟(jì)構(gòu)成威脅，使中國的年國內(nèi)生產(chǎn)總值降低1%～3%[2]。由此可見顱腦損傷已成為一項(xiàng)世界性的嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。

中醫(yī)藥價格低廉，以其多途徑、多靶點(diǎn)作用的特點(diǎn)，引起了學(xué)者的關(guān)注，越來越多的被用于各種腦損傷患者。近年的研究表明，淫羊藿苷(Icariin，Ica)具有抗癡呆、抗衰老作用，抗缺血性腦損傷作用，抗抑郁作用，神經(jīng)保護(hù)作用，對老年性癡呆、缺血性中風(fēng)、抑郁癥等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有良好的防治作用[3]。但I(xiàn)ca對創(chuàng)傷性腦損傷的影響卻鮮見報道。

國內(nèi)外研究表明，髓鞘堿性蛋白(Myelin basic protein，MBP)和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(Glial fibillary acidic protein，GFAP)分別是少突膠質(zhì)細(xì)胞髓鞘、星形細(xì)胞的特異性蛋白，在腦損傷時其在血清中的含量均有不同程度升高，其升高程度與病情嚴(yán)重程度及預(yù)后密切相關(guān)，并可作為指導(dǎo)臨床治療的客觀指標(biāo)[4]。本實(shí)驗(yàn)觀察不同劑量淫羊藿苷對顱腦損傷大鼠血清MBP，GFAP含量的影響，報道如下。

1材料與方法

1.1動物分組及給藥健康SPF級成年SD雄性大鼠100只，由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，體重250g～300g。將動物隨機(jī)分為5組，每組20只。假手術(shù)組：只開骨窗，不予落體撞擊。0.9%氯化鈉注射液2mL灌胃，造模前1次，造模后1次/d。模型組：只造模，不給Ica治療。0.9%氯化鈉注射液2mL灌胃，造模前1次，造模后1次/d。Ica低劑量組30mg/kg·d：0.9%氯化鈉注射液2mL + Ica30mg/kg·d灌胃，造模前1次，造模后1次/d 。Ica中劑量組60mg/kg·d：造模后0.9%氯化鈉注射液2mL +Ica60mg/kg·d灌胃，造模前1次，造模后1次/d。Ica高劑量組120mg/kg·d：造模后0.9%氯化鈉注射液2mL +Ica120mg/kg.d灌胃，造模前1次，造模后1次/d。

1.2模型制作①SD大鼠稱重后，10%水合氯醛0.3mL/100g腹腔注射麻醉；②將動物俯臥固定在立體定位儀上，調(diào)節(jié)門齒托的高度，使大鼠的前后囟處于同一水平；③消毒皮膚，頭部正中切開，剝離骨膜，暴露右頂骨，用牙科鉆在冠狀縫后2mm，中線旁2mm處鉆一直徑4mm骨窗，保持硬腦膜完整。參照Feeny 等[5]方法制作大鼠顱腦損傷模型。打擊后切口內(nèi)滴入8萬單位硫酸慶大霉素3～4滴，縫合頭皮；④假手術(shù)組只開骨窗，不予落體撞擊；⑤術(shù)后將大鼠在20℃～25℃恒溫條件下飼養(yǎng)，每3天換墊料一次，自由活動及進(jìn)食水。

1.3檢測指標(biāo)及方法ELISA 法檢測：造模后第1、3、7、14天各組分別處死大鼠5只，腹主動脈采血，酶聯(lián)免疫吸附法測血清MBP和GFAP水平。動物采血順序按造模順序進(jìn)行，采血工作在半小時內(nèi)完成，血樣離心后取血清低溫冷藏備用，統(tǒng)一按試劑盒說明檢測。

2結(jié)果

模型組與假手術(shù)組同期比較，MBP及GFAP含量增高(P<0.05); 低劑量治療組與模型組同期比較，MBP及GFAP含量降低(P<0.05)； 中劑量治療組與低劑量治療組及高劑量治療組與中劑量治療組同期比較，MBP、GFAP含量無明顯差異(P>0.05)； 高劑量治療組與低劑量治療組同期比較，MBP及GFAP含量降低(P<0.05)。各組不同時間點(diǎn)血清MBP、GFAP含量比較(見表1)。

表1　各組大鼠血清MBP、GFAP含量比較

注：模型組與假手術(shù)組同期比較，*P<0.05；低劑量治療組與模型組同期比較，△P<0.05；高劑量治療組與低劑量治療組同期比較，▲P<0.05

3討論

TBI常引起神經(jīng)元的壞死、神經(jīng)髓鞘的崩解及血腦屏障(BBB)的破壞等原發(fā)性腦損傷， 還因傷后腦血流及腦細(xì)胞代謝變化、腦水腫形成和占位效應(yīng)引起繼發(fā)性腦損害，進(jìn)一步引起脫髓鞘或髓鞘變性，使腦實(shí)質(zhì)或髓鞘受到不同程度的損傷， BBB也可受到破壞，通透性發(fā)生改變。MBP是脊椎動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)少突細(xì)胞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)雪旺細(xì)胞合成的一種強(qiáng)堿性膜蛋白，含有多種堿性氨基酸。MBP位于髓鞘多層膜結(jié)構(gòu)的漿膜面， 與髓鞘脂質(zhì)緊密結(jié)合， 維持了中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定。正常情況下，腦脊液MBP<6.95 mg/L，TBI時上述因素引起腦細(xì)胞膜完整性破壞從而導(dǎo)致MBP進(jìn)入血液循環(huán)[6]。國外報道腦外傷后頸內(nèi)靜脈與外周靜脈所測得的MBP濃度基本相同，因此通過檢測外周血中MBP濃度即可反映腦損害嚴(yán)重程度[7]。李永領(lǐng)等研究結(jié)果顯示，TBI患者傷后血清MBP水平有著不同程度的升高，腦損傷程度與MBP水平呈正相關(guān)，即腦損傷程度越重，MBP水平越高[8]。GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞中直徑8μm～10μm的中間絲，位于核周和細(xì)胞質(zhì)中，是構(gòu)成膠質(zhì)細(xì)胞的重要骨架成分，可作為星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志，血清GFAP水平可用作評估TBI原發(fā)性損傷和判斷預(yù)后[9]。TBI后腦組織損傷， GFAP 從損傷的星形膠質(zhì)細(xì)胞漏出，通過破壞的BBB進(jìn)入腦脊液和體循環(huán)，引起腦脊液和血液中GFAP水平升高。實(shí)驗(yàn)表明TBI后大鼠血清MBP濃度在傷后升高，常持續(xù)較高水平7～9d[10]， GFAP 在血清中的水平分別在傷后1～3d 達(dá)到最高值，如無繼發(fā)性損害，則在傷后6～14d 明顯下降[11]。

淫羊藿是傳統(tǒng)補(bǔ)腎之中藥，又稱仙靈脾，是多年生的草本植物。據(jù)《中國藥典》記載，其性味辛、甘、溫，歸肝、腎經(jīng)，具有補(bǔ)腎壯陽、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)除濕等功效?！澳I生髓”是中醫(yī)學(xué)重要觀點(diǎn)之一，腎主藏精生髓，督脈上通于腦，下通于腎，而脊是精髓升降之通路；髓又上通于腦，腦為髓海，府精神明，才可作用強(qiáng)力，能多精巧。正如《中西匯通醫(yī)經(jīng)精義》云：“腎系貫脊，通于脊髓，腎精足，則入脊化髓上循入腦而為腦髓，是髓者精氣之所會也?！蹦X與五臟均有聯(lián)系，但與腎的關(guān)系最為密切。依據(jù)以上理論，補(bǔ)腎填髓可健腦益智。淫羊藿藥理學(xué)研究表明，Ica是其主要有效成分。近年來，通過對Ica對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥理作用及機(jī)制研究，Ica能夠通過血腦屏障，抑制β淀粉樣蛋白產(chǎn)生的毒性作用，降低腦組織中乙酰膽堿酯酶活性，保護(hù)神經(jīng)[12]；Ica 能抑制缺氧引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞的減少，有效的減少缺氧誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[13]；Ica可在體外刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和血管生成[14]；Ica能一定程度的降低神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的通透性，抑制NO、前列腺素活性氧的釋放及促炎細(xì)胞因子抑制膠質(zhì)細(xì)胞增生活化、減輕炎癥反應(yīng)[15-16]。所以推測Ica可通過維持血管內(nèi)皮細(xì)胞完整性，刺激內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，改善缺血-再灌注，減輕炎癥反應(yīng)，保護(hù)神經(jīng)，對顱腦損傷后血清MBP與GFAP的表達(dá)產(chǎn)生影響。

本研究結(jié)果表明，假手術(shù)組大鼠血清MBP、GFAP 含量在術(shù)后各時間點(diǎn)無明顯變化；模型組大鼠血清MBP、GFAP含量在術(shù)后均有升高，術(shù)后第1天開始明顯升高，至第7天達(dá)峰值，后逐漸下降，至第14天仍明顯高于假手術(shù)組。Ica對顱腦損傷后升高的血清MBP、 GFAP表達(dá)具有明顯的抑制效果，各治療組血清MBP、GFAP含量在術(shù)后第1、3、7、14天與模型組對比均有明顯降低，同期高劑量治療組血清MBP、GFAP水平比低劑量治療組的血清水平明顯降低。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Ica對TBI大鼠具有腦保護(hù)作用，Ica的腦保護(hù)作用與其使用劑量呈正相關(guān)。其機(jī)制主要有兩方面，一方面Ica改善TBI后腦微循環(huán)，保護(hù)了受損的神經(jīng)細(xì)胞，加速了受損細(xì)胞的修復(fù)，清除氧自由基，減少了MBP、GFAP的釋放；另一方面Ica保護(hù)受損血管的內(nèi)皮細(xì)胞，改變了BBB的通透性，減少了MBP、GFAP進(jìn)入血液，從而穩(wěn)定BBB，降低血清MBP、GFAP的表達(dá)，減輕創(chuàng)傷性腦損傷的危害。

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(收稿2016-03-16；修回2016-04-08)

The effects of Icariin on serum MBP and GFAP levels in traumatic brain injury rats

Affiliated Hospital of ShanXi College of Traditional Chinese Medicine(Xianyang 712000)

Fang YongjunZhou XiongboZhou Fenget al

ABSTRACTObjective：To investigate the effects of different doses of icariin(ICA) for traumatic brain injury (TBI) in rats serum myelin basic protein(MBP)and glial fibillary acidic protein(GFAP). Methods：100 SD rats were randomly divided into control group， model group， the ICA low dose treatment group (30 mg/kg·d)， middle dose treatment group (60 mg/kg·d) and high dose treatment group (120 mg/kg·d).The contents of serum MBP and GFAP were determined on day 1， 3， 7 and 14 after operation. Results：The results of model group compared with control over the same period， higher content of MBP and GFAP， the difference was statistically significant (P< 0.05); Each treatment group compared with model group at the same time， content of MBP and GFAP is reduced， the difference was statistically significant (P< 0.05);High dose treatment group compared with the same period lower dose treatment groups， MBP and GFAP content is reduced， the difference was statistically significant (P< 0.05). Conclusions ：The ICA in traumatic brain injury in rats with cerebral protection， its effect is positively related with the ICA dose， its mechanism is related to the inhibition of MBP， GFAP expression.

KEY WORDSTraumatic Brain InjuryAnimalExperimentationRats

【中圖分類號】R651.15

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7369.2016.07.080

*陜西省咸陽市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2012K16-01、2011K13-01)

△陜西中醫(yī)藥大學(xué)(咸陽 712000)