溫膽湯對焦慮性失眠大鼠即刻早期基因表達的影響*

張　慧　馮衛(wèi)星　張煥超

陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腦病科 (咸陽 712000)

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溫膽湯對焦慮性失眠大鼠即刻早期基因表達的影響*

張慧馮衛(wèi)星張煥超△

陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腦病科 (咸陽 712000)

摘要目的: 觀察溫膽湯對焦慮性失眠大鼠腦皮層和海馬部位c-fos和c-jun的影響。方法: 健康SD大鼠90只,隨機分為正常組、空白模型組、西藥組及中藥大、中、小劑量組,每組各15只?？瞻啄Ｐ徒M、西藥組和中藥組分別給予蒸餾水、地西泮和溫膽湯煎劑灌胃。空白模型組、西藥組、中藥大中小劑量組接受不確定性空瓶飲水刺激并采用對氯苯丙氨酸腹腔注射建立焦慮性失眠模型,并行行為學(xué)測試。末次測試24h后,用免疫組化法測大鼠海馬區(qū)c-fos及c-jun含量。結(jié)果:西藥組及中藥大中小劑量組失眠大鼠的焦慮行為較空白模型組減少；中藥大中小劑量組大鼠海馬區(qū)c-fos和c-jun含量較空白模型組降低 (P<0.05)。結(jié)論: 溫膽湯大中小劑量同地西泮均具有一定的抗焦慮作用，c-fos和c-jun 基因很可能參與了焦慮性失眠大鼠細胞凋亡過程，溫膽湯可能是通過抑制腦組織c-fos 和c-jun的表達上調(diào)，而發(fā)揮腦保護作用。

主題詞失眠/中醫(yī)藥療法溫膽湯即刻早期基因大鼠實驗，動物

焦慮障礙是最常見的精神障礙，失眠常伴隨出現(xiàn)，約1/3的焦慮障礙患者常以失眠為主訴就診[1]。焦慮所引起的失眠可能會影響患者生活質(zhì)量及工作能力，加重患者經(jīng)濟負擔(dān)[2]。溫膽湯為治療痰熱內(nèi)擾型失眠的傳統(tǒng)方劑，前期臨床試驗研究證實其治療焦慮性失眠安全有效。本研究從即刻早期基因表達探討溫膽湯治療“痰熱內(nèi)擾”型焦慮性失眠的分子機制，能加深對溫膽湯方證的系統(tǒng)了解，揭示其深層次作用機制。

1材料和方法

1. 1實驗動物由第四軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心提供清潔級雌性SD大鼠90只,體重180±50g, 許可證號SCXK (陜) 2013-002。

1.2藥物與試劑溫膽湯原方組成藥物加8倍水浸泡30min,煎煮2次,每次40min, 合并濾液, 濃縮成1∶1藥液, 4℃冰箱保存?zhèn)溆?臨用時用蒸餾水配成40%溶液。全部藥材購自陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房。舒樂安定片( 北京益民藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號131003)。對氯苯丙氨酸(美國Sigma公司生產(chǎn)),臨用前將對氯苯丙氨酸與弱堿性生理鹽水以45mg/100g比例配置成混懸液備用。

1.3動物分組與給藥大鼠按隨機數(shù)字法隨機分為正常組、空白模型組、西藥組和中藥大、中、小劑量組,每組各15 只。除正常組外，其余五組均采用單籠飼養(yǎng)且接受不確定性空瓶飲水刺激建立焦慮應(yīng)激模型。在第6、7日早上8:00開始，按1mL/100g腹腔注射對氯苯丙氨酸，連用兩天，復(fù)制大鼠失眠模型。應(yīng)激結(jié)束后各組交叉進行EPM行為學(xué)測試。大鼠出現(xiàn)晝夜節(jié)律消失, 白天也活動不停, 表明模型復(fù)制成功?？掌看碳?周后空白模型組即給予蒸餾水灌胃，西藥組給予地西泮(0.5mg/kg)灌胃，中藥大、中、小劑量組分別給予溫膽湯(2 mL/ 100g、1 mL/ 100g 、0.5mL/ 100g)灌胃，上述治療連續(xù)應(yīng)用7d。正常組不做任何處理，自由攝食及飲水。

1. 4實驗方法

1.4.1 行為學(xué)觀察：行為學(xué)觀察包括攻擊、探究及修飾行為。即觀察大鼠空瓶應(yīng)激10min，每分鐘記錄一次，每只大鼠只要出現(xiàn)攻擊、探究或修飾行為中任一行為即記為1，未出現(xiàn)上述三種行為則記為0。由兩名觀察者同時記錄，取兩人觀察結(jié)果的平均值。

1.4.2 高架十字迷宮(Elevated plus-maze test,EPM)行為學(xué)測試：采用高架十字迷宮檢測大鼠焦慮狀態(tài)。高架十字迷宮由兩個開臂(開臂A和開臂B)及兩個閉臂(閉臂A和閉臂B)組成。測試前一星期，每天撫摸實驗大鼠1～5min，連續(xù)7d，以消除實驗大鼠對實驗者的恐懼。迷宮測試前將大鼠單獨放入100cm×100cm×40cm塑料盒中自由探究 5min。隨后迅速將實驗大鼠放入迷宮中央?yún)^(qū)，頭朝開臂A，釋放同時開啟攝像監(jiān)控器記錄5min內(nèi)大鼠下述指標(biāo)：①開臂進入次數(shù)(OE)：指進入任何1個開放臂的次數(shù)，大鼠4個爪子均進入到臂內(nèi)為進入開始，以單爪從該臂中完全退出為進入完成；②閉臂進入次數(shù)(CE)：即進入任何1個封閉臂的次數(shù)，以大鼠4個爪子均進入到臂內(nèi)為準(zhǔn)；③開臂滯留時間(OT)，以秒為單位計算；④閉臂滯留時間(CT)，以秒為單位計算。由①～④分別計算出:①開臂進入次數(shù)百分比(OE%)，即開臂進入次數(shù)/(開臂進入次數(shù)+閉臂進入次數(shù))×100%；②開臂滯留時間百分比(OT%)，即開臂滯留時間/(開臂滯留時間+閉臂滯留時間)×100%。記錄結(jié)束后清理迷宮，并用75%酒精擦拭，以消除前一實驗大鼠氣味對下一實驗大鼠的影響。

1.4.3 c-fos和c-jun陽性細胞計數(shù)：末次測試24h后處死，斷頭取腦，置于4%多聚甲醛的磷酸緩沖液(pH7.4)，固定7h后，-20℃恒冷箱切片。蒸餾水沖洗，0.01mol/LPBS浸泡5min，循環(huán)2次，0.3H2O2-PBS液中漂洗15 min，后加5%山羊血清(PBS稀釋)封閉，室溫孵育20 min。除去血清，再滴加兔抗多克隆fos抗體和兔抗多克隆jun抗體，其混合物在37℃環(huán)境下孵育2 h；蒸餾水沖洗，0.01mol/L PBS浸泡5min，共3次，37℃環(huán)境下加入生物素化羊抗兔IgG (1∶150)孵育1 h，蒸餾水沖洗，0.01mol/L PBS浸泡5min，共3次，再入SABC復(fù)合物中孵育1h(37℃)。蒸餾水沖洗，0.01mol/LPBS浸泡5min，循環(huán)3次，DAB顯色5min，重蒸水終止染色10min，脫水、透明后封片備檢。每只大鼠腦海馬及皮層區(qū)各選3張切片，應(yīng)用10×10倍顯微鏡觀察5個視野的c-fos和c-jun陽性細胞并計數(shù)。取同一區(qū)域同一視野相同面積內(nèi)陽性細胞數(shù)的平均值進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS17.0進行單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1溫膽湯對大鼠行為學(xué)的影響空白模型組、中藥大中小劑量組及西藥組大鼠行為學(xué)測試中，入臂總次數(shù)較正常組增高。中藥大、中劑量組及西藥組開臂入臂次數(shù)百分比及開臂滯留時間百分比較空白模型組升高。具體數(shù)據(jù)見表1。

表1　實驗大鼠行為學(xué)測試結(jié)果

2.2溫膽湯對大鼠腦內(nèi)c-fos、c-jun水平的影響空白模型組及藥物干預(yù)各組大鼠腦內(nèi)的c-fos、c-jun細胞數(shù)較正常組明顯增多(P<0.05),推測c-fos、c-jun水平升高可能與該類失眠的發(fā)生相關(guān),地西泮組及溫膽湯大、中、小劑量組大鼠大腦內(nèi)c-fos和c-jun細胞數(shù)均有不同程度減少(P<0.05)。其中溫膽湯大、中劑量組失眠大鼠大腦內(nèi)c-fos和c-jun細胞數(shù)較溫膽湯小劑量組減少明顯。

表2　c-fos細胞數(shù)( 10×10, 0.01mm2)

注:△表示與正常組比較,P<0.01；▲表示與空白模型組比較,P<0.05

表3　c-jun細胞數(shù)(10×10, 0.01mm2)

注:△表示與正常組比較,P<0.01；▲表示與空白模型組比較,P<0.05。

3討論

睡眠過程是人體正常工作所必須的生理現(xiàn)象，尤其對大腦學(xué)習(xí)、記憶功能有極大的輔助功能。緊張、焦慮、失眠會嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。嚴(yán)重的睡眠障礙可能會產(chǎn)生反應(yīng)遲鈍、思維混亂、注意力不集中、定向力、計算力及記憶力下降等一系列中樞神經(jīng)受損癥狀。剝奪睡眠24h即可使人的認(rèn)知能力下降30%～40%。若剝奪睡眠48h人的認(rèn)知能力可下降60%～70%[3-4]?，F(xiàn)代化生活節(jié)奏不斷加快，生活壓力不斷增加，導(dǎo)致人群中焦慮性失眠患者與日俱增?！端貑枴つ嬲{(diào)論》有云：“胃不和則臥不安”。即指脾胃不和，痰濕內(nèi)生，食滯內(nèi)擾，從而不得眠?！靶臑榫?，肝為相火，君火不寧，相火易動。”怒易傷肝，引起相火妄動，心火不寧，挾痰上行，導(dǎo)致痰熱內(nèi)擾，故而失眠。徐東皋云：“痰火擾亂，心神不寧，思慮過傷，火熾痰郁而致不眠者多矣?！?/p>

溫膽湯是古今臨床常用方劑，藥味較少，平淡無奇，然其配伍精當(dāng)，標(biāo)本同治，因其可調(diào)膽和胃，理氣化痰，健脾安神，故為治療痰熱內(nèi)擾型失眠的主要方劑。《三因極一病證方論》卷九中記載溫膽湯主治膽胃不和、痰熱內(nèi)擾而致的虛煩不得眠。患者常常表現(xiàn)為心煩不寐，觸事易驚，或夜多異夢，眩悸嘔惡或癲癇。方中君藥半夏，性辛溫，燥濕化痰，降逆和胃。臣藥竹茹可清化痰熱，除煩止嘔，藥甘微寒，可解少陽腑熱。半夏加竹茹，既能化痰濁，又能清膽熱，使得膽氣清肅，胃氣順降，膽胃相和，惡嘔可止。枳實，辛苦微寒，可破氣消痰，痰隨氣下，有通痞塞之功。陳皮燥濕化痰，辛苦而溫，既可以輔半夏祛痰之功，亦能健脾，強枳實行氣之效。如《本草綱目果部》卷三十記載:“橘皮，苦能泄而燥，辛能散，溫能和。其治百病，總是取其理氣燥濕之功。同補藥則補，同瀉藥則瀉，同升藥則升，同降藥則降。脾乃元氣之母，肺乃攝氣之籬，故橘皮為二經(jīng)氣分之藥，但隨所配而補瀉升降也?！眱?nèi)擾之痰，邪本在濕，臟本在脾。方中茯苓通過健脾滲濕而杜生痰之源。甘草為使，益脾和中，調(diào)和諸藥。加生姜以煎之，既助半夏竹茹祛痰止嘔，又解半夏之毒；大棗與甘草、茯苓為伍，健脾補土以治濕，與生姜相配，能調(diào)和脾胃，中州健運，諸藥相合，化痰而不過燥，清熱而不過寒，痰熱得化，膽熱得清，胃氣和降。諸要共奏理氣化痰，清膽和胃之效。前期臨床研究表明，焦慮性失眠就診患者中，痰熱內(nèi)擾證占72.1%。溫膽湯為治療痰熱內(nèi)擾型失眠癥的主要方劑，能有效緩解患者焦慮癥狀，改善睡眠質(zhì)量。

大鼠喜歡探究新環(huán)境,但不喜愛強光及在開闊地活動。EPM通過觀察大鼠對新環(huán)境的探究行為及對高懸著開臂的恐懼行為的矛盾狀態(tài)，來評價藥物的抗焦慮或致焦慮作用。在本實驗中，溫膽湯可以增加大鼠對開臂的偏愛(即增加進入開臂的次數(shù)和在開臂內(nèi)滯留的時間)，卻不改變?nèi)氡劭偞螖?shù)和入臂總時間，也即開臂進入次數(shù)百分比和開臂滯留時間百分比升高，則認(rèn)為該藥具有抗焦慮的作用。

即刻早期基因c-fos、c-jun，為核內(nèi)蛋白類細胞癌基因，腦功能區(qū)神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細胞接受刺激后可誘導(dǎo)相應(yīng)區(qū)域細胞的c-fos、c-jun 原癌基因短暫快速表達[5]。即刻早期基因參與細胞分裂、生長分化、信息識別與傳遞，與學(xué)習(xí)、清醒劑記憶等生理活動密切相關(guān)[6]。原癌基因c-fos 表達的核磷蛋白( Fos)作為核內(nèi)第三信使，在外界刺激與轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的信息傳導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用[7]。正常情況下, 神經(jīng)細胞中c-fos、c-jun蛋白僅有低水平表達；一旦出現(xiàn)焦慮、失眠等外源性刺激, c-fos與Fos形成的二聚體作用于AP-1位點激活遲反應(yīng)基因(LRG)，其表達產(chǎn)物可促使GABA釋放減少、谷氨酸釋放增加等，從而改變神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的興奮性。神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的興奮抑制失衡從而形成失眠[8-9]。多個實驗數(shù)據(jù)表明，c-fos蛋白的表達程度越高，因失眠所導(dǎo)致的神經(jīng)突觸越活躍[10]。本實驗結(jié)果提示，溫膽湯可使焦慮性失眠大鼠皮層及海馬區(qū)的c-fos 和c-jun蛋白表達降低,陽性細胞數(shù)減少。它可能通過降低腦內(nèi)c-fos、c-jun表達水平、減少大腦神經(jīng)細胞凋亡而對焦慮性失眠大鼠起到腦保護作用。結(jié)合溫膽湯的促眠實驗以及檢測學(xué)習(xí)記憶能力的Morris水迷宮實驗結(jié)果，均表明溫膽湯可改善睡眠質(zhì)量、具有腦保護作用。

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(收稿2016-01-05；修回2016-01-25)

【中圖分類號】R256.23

【文獻標(biāo)識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7369.2016.07.083

*陜西省教育廳專項科研計劃項目(12JK1020)

△陜西中醫(yī)藥大學(xué)(咸陽712000)