超聲波預處理對雙酶法提取酒糟中蛋白質(zhì)的影響

張丙云，裴芳霞，任海偉，馬文鵬（.蘭州理工大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州730050；.新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術學院，新疆昌吉8300）

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超聲波預處理對雙酶法提取酒糟中蛋白質(zhì)的影響

張丙云1，裴芳霞1，任海偉1，馬文鵬2
（1.蘭州理工大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州730050；2.新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術學院，新疆昌吉831100）

摘要：為提高酒糟中蛋白質(zhì)的提取率，研究了超聲波預處理對雙酶法提取蛋白質(zhì)的影響。以蛋白質(zhì)提取率為指標，篩選適宜酒糟蛋白質(zhì)提取的酶解方案，通過響應面設計考察超聲波預處理對蛋白質(zhì)提取率的影響并優(yōu)化預處理參數(shù)。結(jié)果表明，單種酶輔助提取時，添加纖維素酶的蛋白質(zhì)提取率高于木聚糖酶。與單種酶輔助提取相比，纖維素酶和木聚糖酶2種酶同步添加的雙酶法提取效果最好。雙酶同步提取蛋白質(zhì)的適宜條件為：纖維素酶和木聚糖酶的添加質(zhì)量分數(shù)分別是3%和4%，酶提取時間4.5 h，該條件下蛋白質(zhì)提取率為30.25%。響應面優(yōu)化后的超聲波預處理條件為：料液比1∶17、超聲波時間38 min和超聲波功率480 W，超聲波預處理后的蛋白質(zhì)提取率升至43.37%。超聲波預處理能有效提高酒糟蛋白質(zhì)的酶法提取率。

關鍵詞：酒糟；纖維素酶；木聚糖酶；超聲波預處理；蛋白質(zhì)提取

優(yōu)先數(shù)字出版時間：2016-02-02；地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160202.1602.009.html。

中國是白酒消費和生產(chǎn)大國，每年產(chǎn)生大量的廢棄酒糟，轉(zhuǎn)化利用不足極易造成環(huán)境污染和資源浪費。目前，酒糟的再利用途徑主要包括生產(chǎn)有機肥、發(fā)酵飼料、食用菌、燃料棒、活性炭和食醋等［1-2］。本課題組利用生化方法將酒糟轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖后發(fā)酵制備了木糖醇、乙醇和乳酸等［3-5］。另一方面，酒糟中蛋白質(zhì)含量為12%～18%，飼用價值較高，但釀酒過程添加的稻殼中含有植酸，會影響動物對酒糟蛋白的消化吸收，而且酒糟中的蛋白質(zhì)被纖維木質(zhì)素類物質(zhì)包裹，不易被釋到細胞外，難被生物利用，導致飼用品質(zhì)下降［6］。為進一步提高酒糟蛋白質(zhì)的飼用價值，應設法將其提取利用。

目前，常用的蛋白質(zhì)提取法有化學法（如醇堿法［7-8］、堿法［9］、溶劑法［10］）、生物法（如酶法［11］）和物理輔助提取法（如粉碎、超聲波、微波、球磨等［12］）。其中，化學法易引起蛋白質(zhì)變性和環(huán)境污染，酶法則多使用水解蛋白酶類，導致蛋白被水解成肽，造成蛋白損失。研究表明，纖維素酶等碳水化合物酶也可以提高蛋白質(zhì)提取率，該方法在米糠蛋白提取中已得到應用［13］，但未見在酒糟蛋白提取中應用的報道。同樣，超聲波作為一種物理輔助提取方法也能有效提高蛋白質(zhì)提取得率［14］。

鑒此，以白酒糟為原料，針對其致密網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)和木質(zhì)纖維素含量高等特點，擬采用纖維素酶和木聚糖酶等碳水化合物酶輔助進行蛋白質(zhì)提取，著重比較單種酶、雙酶分步或同步的酶法提取蛋白方案，并考察超聲波預處理對蛋白提取率的影響，以期為酒糟蛋白質(zhì)的提取奠定理論基礎。

1材料與方法

1.1材料與儀器

耗材：白酒糟（以干基計，蛋白質(zhì)含量為12.74%），甘肅金徽酒股份有限公司；纖維素酶（濾紙酶活10萬U/g，廠家推薦最適pH4.8，溫度為50℃），寧夏和氏璧生物技術有限公司；木聚糖酶（濾紙酶活5萬U/g，廠家推薦最適pH5.0，溫度為50℃），寧夏和氏璧生物技術有限公司；3，5-二硝基水楊酸等試劑均為分析純。

儀器設備：HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，北京國華電器有限公司；GZX-924MBE數(shù)顯鼓風干燥箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；KH-600DE數(shù)控超聲波清洗機，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；TDL-5-A離心機，上海安亭科學儀器廠。

1.2實驗方法

1.2.1酶法提取酒糟中蛋白質(zhì)的方案篩選

為確定纖維素酶和木聚糖酶的適宜加酶量和酶解時間，首先進行單種酶輔助提取實驗。分別考察酶添加量（1%、2%、3%、4%和5%）和酶提取時間（纖維素酶：1 h、1.5 h、2 h、2.5 h和3 h；木聚糖酶：1.5 h、2 h、2.5 h、3 h和3.5 h）對蛋白質(zhì)提取率的影響，在此基礎上按照表1中酶解順序進行雙酶組合提取實驗。

表1　酶添加順序組合方案設計

具體方法為：準確稱取5 g酒糟樣品，以1∶10（w/v）料液比加入pH4.8的檸檬酸緩沖液，依次進行單種酶提取和雙酶組合提取實驗，50℃恒溫提取一定時間，沸水浴滅酶，快速冷卻后以4000 r/min離心10 min，所得上清液定容至50 mL，采用凱氏定氮法測定其蛋白質(zhì)濃度并按公式（1）計算提取率：

1.2.2超聲波預處理條件的優(yōu)化

分別選取超聲波時間（10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min）、超聲波功率（100 W、200 W、300 W、400 W、500 W、600 W）和料液比（1∶8 g/mL、1∶10 g/mL、1∶12 g/mL、1∶14 g/mL、1∶16 g/mL、1∶18 g/mL）3個因素進行超聲波預處理，預處理后的酒糟在1.2.1中確定的適宜酶解條件下提取蛋白質(zhì)，步驟與計算方法同1.2.1。在單因素結(jié)果基礎上，利用Box-Benhnken中心組合實驗設計原理，以蛋白質(zhì)提取率為評價指標進行超聲波預處理參數(shù)的響應面優(yōu)化，見表2。

表2　因素水平表

2結(jié)果與分析

2.1單種酶輔助提取蛋白質(zhì)的研究篩選

2.1.1酶添加量對蛋白質(zhì)提取率的影響

由圖1可知，隨著纖維素酶和木聚糖酶添加量的增加，蛋白質(zhì)提取率呈先增加后降低的趨勢，纖維素酶在添加量3%時，提取率最高達28.34%；木聚糖酶在添加量4%時，提取率達到最高值26.43%。另一方面，相同酶添加量條件下，添加纖維素酶的蛋白提取率始終高于木聚糖酶，這是因為酒糟原料中纖維素含量較多，且木質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)最易受到纖維素酶的作用，使得蛋白質(zhì)提取率升高；而半纖維素是木質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)的粘合劑，被纖維素和木質(zhì)素等組分包埋，只有在木質(zhì)纖維網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)疏松后才能被木聚糖酶作用。故添加纖維素酶的提取率高于木聚糖酶［15］。纖維素酶的添加量確定為3%，木聚糖酶的添加量確定為4%。

圖1　　加酶量對蛋白質(zhì)提取率的影響

2.1.2酶提取時間對蛋白質(zhì)提取率的影響

由圖2可知，隨著提取時間的延長，蛋白質(zhì)提取率呈先上升后下降的趨勢，纖維素酶作用2.5 h時的蛋白質(zhì)提取率最高，為25.16%，而木聚糖酶在提取2 h后達到最高值25.80%?？梢?，適當延長提取時間有利于蛋白質(zhì)提取。因為反應初始階段的底物濃度較高，酶與底物接觸較充分，酶作用時間越長，木質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)越松散，蛋白質(zhì)越易溶出。但時間過長會因木質(zhì)素組分對纖維素酶和木聚糖酶產(chǎn)生的吸附作用而導致蛋白質(zhì)提取率下降。因為酒糟的木質(zhì)纖維素底物上有很多孔洞，相當數(shù)量的孔洞尺寸與酶分子直徑相近。酶一旦進入孔洞，就很難游離到水解液中［16］。故纖維素酶和木聚糖酶的酶解時間分別確定為2.5 h和2 h。

圖2　　酶提取時間對蛋白質(zhì)提取率的影響

2.2酶添加方案對蛋白質(zhì)提取率的影響

由圖3可知，與單種酶輔助提取蛋白質(zhì)相比，雙酶分步或同步添加的組合法均能有效提高蛋白質(zhì)提取率，且同步添加纖維素酶和木聚糖酶時的蛋白質(zhì)提取率最高，達到30.24%，說明纖維素酶和木聚糖酶協(xié)同作用可將原料中纖維素和木聚糖切成短鏈寡聚糖，有利于切斷多糖基質(zhì)中的連接，釋放出更多的蛋白質(zhì)［17］。故確定纖維素酶和木聚糖酶同步添加為適宜酒糟蛋白質(zhì)提取的酶解方案。

圖3　酶添加方式對蛋白質(zhì)提取率的影響

2.3超聲波預處理對蛋白質(zhì)提取率的影響

2.3.1超聲波時間對蛋白質(zhì)提取率的影響

固定超聲波功率300 W，料液比1∶10，研究超聲波時間對蛋白質(zhì)提取率的影響。由圖4可知，隨著超聲波時間的延長，蛋白質(zhì)提取率呈先上升后下降的趨勢，并且超聲波處理40 min時蛋白質(zhì)提取率達到最高值43.95%。因為超聲波作用時能產(chǎn)生熱效應、機械效應和空化效應等［17］，能加速木質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)的破壞與瓦解，促進蛋白質(zhì)提取。但隨著超聲波時間的延長，產(chǎn)生的熱量過多易導致蛋白質(zhì)穩(wěn)定性降低，使溶出的蛋白質(zhì)變性或沉淀［18］，故超聲波預處理時間設置為40 min。

圖4　超聲波時間對蛋白質(zhì)提取率的影響

2.3.2超聲波功率對蛋白質(zhì)提取率的影響

固定料液比1∶10，超聲時間40 min，研究超聲波功率對蛋白質(zhì)提取率的影響。由圖5可知，隨著超聲波功率的增大，蛋白質(zhì)提取率逐漸增加，但功率高于500 W時增加趨勢放緩。因為隨著超聲波功率的提高，振動空化等作用使原料木質(zhì)纖維網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)變疏松，有利于酶分子滲透進入和蛋白質(zhì)的溶出。當功率超過500 W時，超聲波熱效應瞬間增強，容易使蛋白質(zhì)變性，反而不利于其提取溶出［17］，故初步選擇超聲波功率為500 W。

22.3.3料液比對蛋白質(zhì)提取率的影響

圖5　超聲波功率對蛋白質(zhì)提取率的影響

固定超聲波功率300 W，超聲波時間40 min，研究料液比對蛋白質(zhì)提取率的影響。由圖6可知，隨著料液比的減小，蛋白質(zhì)提取率先上升后下降，當料液比為1∶16時，提取率達最高值43.31%。因為當料液比較高時，體系濃度和黏度值較高，酶解反應的傳熱傳質(zhì)進程易受高黏度影響；而液體體積的增加可以降低體系黏度，增加傳質(zhì)過程，同時增大了酶和底物的接觸機率，有利于蛋白質(zhì)溶出。當料液比達到一定值后會使溶液濃度過小，超聲波產(chǎn)生的機械作用不能均勻地作用于底物，使提取率降低［17］，故初步選取料液比為1∶16。

圖6　料液比對蛋白質(zhì)提取率的影響

2.4響應面分析與優(yōu)化

根據(jù)2.3中單因素實驗結(jié)果，采用Box-Behnken設計對超聲波預處理參數(shù)進行優(yōu)化。實驗方案及結(jié)果見表3。

表3　響應面法設計及其實驗結(jié)果

根據(jù)表3實驗結(jié)果，對響應值（蛋白質(zhì)提取率）進行回歸分析，回歸擬合得到蛋白質(zhì)提取率與3個因素的回歸方程：Y=41.82+0.18*A+0.18*B-0.38*C-0.12*A*B+ 2.5*A*C+0.12*B*C+0.63*A2+0.99*B2+0.15*C2。

回歸方程的方差分析結(jié)果如表4所示，結(jié)果表明該模型P＜0.001極顯著；失擬項P=0.2813＞0.05，差異不顯著，說明殘差由隨機誤差引起。方程一次項中A和C（固液比）是極顯著因素，B是顯著因素，方程二次項中A2和B2是顯著因素。AC交互相顯著，表明實驗因子對響應值不是簡單的線性關系，二次項與響應值有很大關系。在所選取的各因素水平范圍內(nèi)，根據(jù)F值大小可知影響因素的主次順序為超聲波功率＞料液比＞超聲波時間。該模型的相關系數(shù)R2為0.971，R2Adj為0.933，因此回歸方程具有相當高的擬合度。信噪比S/N為12.636，遠大于4.0，說明模型的可信度很高，故該模型可用于超聲波預處理參數(shù)的理論預測［19］。

表4　回歸模型方差分析

2.4.1響應面分析各因素對蛋白質(zhì)得率的影響及優(yōu)化結(jié)果

等高線的形狀可反映出交互效應的強弱，2個因素的交互作用越強，等高線越接近橢圓，而圓形則表示交互作用不明顯，并且等高線越密集表明該因素的影響效果越大［20］。由圖7可知，超聲波功率固定在零水平時，蛋白質(zhì)提取率隨料液比和超聲波時間的增加呈先增加后降低的趨勢，并且料液比的響應面曲面較超聲波時間陡，表明料液比較超聲波時間影響大，二者等高線接近圓形，說明超聲時間和料液比交互作用不明顯。當超聲波時間固定在零水平時，隨著超聲波功率的增加，蛋白質(zhì)的提取率呈逐漸增加的趨勢，而料液比減小使蛋白質(zhì)的提取率先增加后降低。當料液比固定在零水平時，蛋白質(zhì)提取率隨時間的延長先提高后降低。前期提取率增加的原因是超聲波一旦與體系組分接觸，會立即產(chǎn)生機械效應和空化效應，原料木質(zhì)纖維網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)被破壞，從而使蛋白質(zhì)分子的溶出能力增強。而超聲時間和超聲功率增加到一定值時，蛋白質(zhì)的某些次級鍵受到破壞而變性，從而使得蛋白質(zhì)的溶解度下降［21］。

2.4.2最佳預處理條件的確定及實驗驗證

經(jīng)Design-Expert 8.0分析，可得超聲波預處理的最佳條件為：料液比為1∶17.256（w/v）、超聲時間為38.16 min、超聲功率為485.78 W，該條件下蛋白質(zhì)預測提取率為44.26%。為了驗證此模型的可靠性和實用性，且考慮實際操作可行性，將上述工藝條件修正為料液比1∶17、超聲波時間38 min、超聲波功率480 W。該條件下進行平行實驗3次，得到酒糟蛋白質(zhì)提取率的平均值為43.37%，與預測值接近，表明此模型對優(yōu)化超聲波提取參數(shù)是可行的。

3　結(jié)論

3.1纖維素酶和木聚糖酶的雙酶法同步輔助提取酒糟蛋白質(zhì)的適宜條件為：纖維素酶和木聚糖酶的添加量分別為3%和4%，酶提取時間4.5 h，該條件下的蛋白質(zhì)提取率為30.25%。

圖7　因素交互作用對蛋白質(zhì)提取率影響的響應曲面

3.2響應面法優(yōu)化后的超聲波預處理最優(yōu)參數(shù)為：料液比為1∶17、超聲波時間為38 min、超聲波功率為480 W，經(jīng)超聲波預處理后，雙酶法輔助提取蛋白質(zhì)的提取率達到43.37%。

3.3超聲波預處理有利于纖維素酶和木聚糖酶同步提取酒糟中的蛋白質(zhì)，具體機理還需進一步研究。

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中圖分類號：TS262.3；TS261.9；X797

文獻標識碼：A

文章編號：1001-9286（2016）05-0099-05

基金項目：甘肅省自然科學基金項目（148RJZA015）；新疆維吾爾自治區(qū)高?？蒲杏媱濏椖壳嗄杲處熆蒲信嘤穑╔JEDU2014S086）。

收稿日期：2015-12-23

作者簡介：張丙云（1968-），女，副教授，碩士，研究方向為食品科學。

通訊作者：任海偉（1983-），男，副教授，研究方向為食品加工副產(chǎn)物綜合利用，E-mail：rhw52571119@163.com。

Effects of Ultrasonic Pretreatment on Protein Extraction from Distillers Grains by Dual-Enzymatic Method

ZHANG Bingyun1，PEI Fangxia1，REN Haiwei1and MAWenpeng2
（1. School of Life Science and Engineering，Lanzhou University of Technology，Lanzhou，Gansu 730050；2. Xinjiang Agricultural Vocational Technical College，Changji，Xinjiang 831100，China）

Abstract：In order to increase the extraction rate of proteins from distillers grains，the effects of ultrasonic pretreatment on protein extraction by dual-enzymatic method were investigated. Protein extraction rate was used as the index to screen out the best enzymatic hydrolysis programs for protein extraction. Besides，ultrasonic pretreatment parameters were optimized by response surface method. The results showed that，protein extraction rate by cellulase-assisted extraction was higher than that by xylanase-assisted extraction，and dual-enzymatic extraction（synchronous addition of both cellulase and xylanase）was superior to single-enzymatic extraction. The optimum dual-enzymatic extraction conditions were summed up as follows：the adding levels of cellulase and xylanase were 3%and 4%respectively，and enzymatic extraction time was 4.5 h. Under these conditions，protein extraction rate was 30.25%. The optimum ultrasonic pretreatment conditions were determined as follows：solid-liquid ratio was 1∶17（g/L），ultrasonic time was 38 min，and ultrasonic power was 480 W. Protein extraction rate increased to 43.37%after ultrasonic pretreatment. In conclusion，ultrasonic pretreatment could effectively increase protein extraction rate.

Key words：distillers grains；cellulose；xylanase；ultrasonic pretreatment；protein extraction