超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法直接測定白酒中8種甜味劑

柯潤輝，王麗娟，安紅梅，黃新望，尹建軍，宋全厚（1.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100015；2.國家食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，北京100015）

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超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法直接測定白酒中8種甜味劑

柯潤輝1，2，王麗娟1，2，安紅梅1，2，黃新望1，2，尹建軍1，2，宋全厚1，2
（1.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100015；2.國家食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，北京100015）

摘要：建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（UPLC-MS/MS）測定白酒中8種甜味劑（安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、阿斯巴甜、三氯蔗糖、紐甜、阿力甜和甜菊糖苷）含量的分析方法。樣品經(jīng)蒸餾水稀釋一定倍數(shù)后，過0.22 μm微孔濾膜，直接進入UPLC-MS/MS中分析檢測。Waters HSS T3色譜柱為分析柱，甲醇-0.1%乙酸水溶液為流動相進行梯度洗脫，在電噴霧電離源負離子模式下，采用多反應(yīng)監(jiān)測模式進行檢測。結(jié)果表明，8種甜味劑在10～500 μg/L的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（相關(guān)系數(shù)r＞0.996），方法檢出限在1～3 μg/L之間，基質(zhì)加標回收率在89%～106%之間，相對標準偏差≤9%，均可達到白酒中痕量甜味劑的檢測要求。該方法前處理簡單，測定快速、準確、靈敏度高，非常適合白酒中多種甜味劑的快速篩查和定量分析。

關(guān)鍵詞：超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀；白酒；甜味劑

優(yōu)先數(shù)字出版時間：2016-02-25；地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160225.1725.003.html。

近年來，隨著消費和認識水平的提高，食品的營養(yǎng)和健康逐步成為消費者關(guān)心的重點。因此，食品中各種添加劑的使用情況越來越受到人們的關(guān)注。甜味劑是一類十分重要的食品添加劑，用以改善食品口感和風(fēng)味，由于其低熱量、高甜度、適合糖尿病人食用等特點而成為蔗糖替代品在食品工業(yè)中廣泛使用。國家標準《食品添加劑使用衛(wèi)生標準》（GB 2760—2014）規(guī)定了可用于食品加工的甜味劑，包括甜蜜素、安賽蜜、木糖醇、阿力甜等的適用范圍和添加限量［1］。食品添加劑在規(guī)定的劑量范圍內(nèi)使用對人無害，若超量使用，則可能引起各種形式的毒性表現(xiàn)，因此，必須對其使用量進行嚴格管理。

中國白酒歷史悠久，是中華民族寶貴的文化遺產(chǎn)和特有的傳統(tǒng)產(chǎn)品，深受消費者喜歡。為了保護我國傳統(tǒng)產(chǎn)品，我國在食品安全國家標準中明確規(guī)定白酒不允許添加任何甜味劑［1］。但個別生產(chǎn)企業(yè)為了降低成本，掩蓋其產(chǎn)品的口感缺陷，仍在生產(chǎn)和勾調(diào)過程中違規(guī)添加甜味劑，干擾了行業(yè)的健康發(fā)展。近些年來，國家有關(guān)部門在對全國白酒的抽檢過程中發(fā)現(xiàn)，濫用甜味劑的現(xiàn)象時有發(fā)生。目前，國標檢驗方法中一次只能檢測一種或兩種添加劑［2］，測定多種成分時不得不頻繁改變前處理方法和儀器條件，費時費力。隨著食品中甜味劑復(fù)配使用的情況越來越普遍，為提高工作效率，方便監(jiān)管部門和生產(chǎn)企業(yè)對白酒中甜味劑的日常監(jiān)測，有必要研究對多種甜味劑同時進行測定的方法［3］，這不僅是技術(shù)發(fā)展的需求，也是實際應(yīng)用的需求。

目前，文獻報道白酒中甜味劑的檢測方法較多，主要有離子色譜法［4］、氣相色譜法［5］、液相色譜法［6-7］、氣相色譜-質(zhì)譜法［8］、液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法［9-11］等，檢測對象涉及多種甜味劑。經(jīng)文獻檢索，目前尚未見到用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法同時測定白酒中安賽蜜、甜蜜素、糖精鈉、阿斯巴甜、三氯蔗糖、紐甜、阿力甜、甜菊糖苷8種常見甜味劑的報道。由于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀的高選擇性與高靈敏度，其在甜味劑檢測中的應(yīng)用范圍越來越廣。本實驗建立了超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀同時測定白酒中8種常見甜味劑的方法，簡便、快速、靈敏度高，為大規(guī)模的白酒監(jiān)督抽查和企業(yè)日常監(jiān)控提供及時準確可靠的技術(shù)手段。

1材料與方法

1.1材料、儀器與試劑

酒樣：市售。

儀器設(shè)備：ACQUITY Ultra Performance LCTM超高效液相色譜儀-ACQUITY TQD電噴霧串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀（美國Waters公司）；ACQUITY UPLC HSS T3（100 m× 2.1 mm×1.8μm）（美國Waters公司）；Milli-Q Reference超純水發(fā)生器（美國Millipore公司）；0.22 μm有機濾膜（上海安譜科學(xué)儀器有限公司）。

試劑：甲醇、乙腈（色譜純，美國Tedia公司）；甲酸、乙酸（HPLC級，迪馬科技有限公司）；乙酸銨（分析純，迪馬科技有限公司）；實驗用水為Milli-Q超純水。8種甜味劑標樣：糖精鈉、安賽蜜、阿斯巴甜、三氯蔗糖、紐甜、甜蜜素、甜菊糖苷（純度＞98%，美國Sigma公司和加拿大TRC公司），阿力甜（純度＞98%，加拿大TRC公司）。

1.2實驗方法

1.2.1標準溶液的配制

分別準確稱取10 mg（精確至0.1 mg）糖精鈉、安賽蜜、阿斯巴甜、三氯蔗糖、紐甜、甜蜜素、甜菊糖和阿力甜標準品于10 mL棕色容量瓶中，用超純水溶解并定容至10 mL，配制成1 mg/mL的標準儲備液。阿斯巴甜在中性水溶液中易分解，配制時需加入少量乙酸（使溶液pH4.3左右）。將上述標準溶液置于4℃冰箱中保存，根據(jù)使用需要用流動相溶液逐級稀釋成適當濃度的混合標準工作液。

1.2.2樣品前處理方法

準確吸取白酒樣品2.0 mL于10 mL容量瓶中，用純水定容至刻度，混勻，經(jīng)0.22 μm有機濾膜過濾，濾液供UPLC-MS/MS測定。

1.2.3色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3（100 m×2.1 mm× 1.8μm）；柱溫為40℃；進樣量：10 μL；流動相：A相為甲醇，B相為0.1%乙酸水溶液；流速：0.35 mL/min；梯度洗脫程序：0 min，10%A；0～4 min，10%A～90%A；4.0～4.5 min，90%A；4.5～7.0 min，10%A。

1.2.4質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：負離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式；毛細管電壓為2.90 kV；離子源溫度為120℃；脫溶劑氣溫度為400℃，流速為700 L/h；錐孔氣流速為50 L/h。

2結(jié)果與討論

2.1色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.1.1色譜條件的選擇

實驗考察了BEH C18柱和BEH HSS T3柱對8種甜味劑的分離效果，發(fā)現(xiàn)在相同的分離條件下，T3柱的分離效果更好。由于某些被測物極性較強，流動相的洗脫能力不宜過強，同時乙腈的毒性較甲醇大；又由于流動相進入質(zhì)譜儀，添加一定量的緩沖鹽可以增加響應(yīng)值；所以考慮甲醇-水、甲醇-乙酸銨溶液、甲醇-甲酸水溶液3種流動相體系。以待測物質(zhì)在色譜柱上的分離度、峰形、靈敏度等為考察指標對3種流動相體系進行了比較。結(jié)果表明，用0.1%乙酸-甲醇作為流動相時各物質(zhì)分離度、峰形、響應(yīng)值以及保留時間的穩(wěn)定性均優(yōu)于0.1%甲酸-甲醇和5 mmol/L乙酸銨-甲醇。在流動相中加入0.1%的乙酸有助于［M+H］+準分子離子的形成，繼續(xù)增加流動相中乙酸的含量，質(zhì)譜響應(yīng)基線噪音增加，靈敏度下降，故實驗選用0.1%乙酸-甲醇為流動相進行梯度洗脫。

2.1.2質(zhì)譜條件的選擇

離子源為電噴霧電離源（ESI），采用注射泵直接連續(xù)進樣方式進行全掃描檢測，得到一級質(zhì)譜圖和準分子離子峰，再用惰性氣體Ar轟擊該母離子，獲得其二級質(zhì)譜圖及相應(yīng)子離子。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，8種甜味劑在負離子模式中響應(yīng)值及靈敏度均高于正離子模式，因此，本實驗選擇負離子電離模式。除甜蜜素和甜菊糖苷的母離子裂解時只得到1個碎片子離子外（表1），其余6種甜味劑均獲得了豐富的碎片離子。利用多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式對選定的定性和定量離子對進行質(zhì)譜毛細管電壓、碰撞能量、錐孔電壓等質(zhì)譜參數(shù)進行優(yōu)化，使各監(jiān)測離子豐度和信號達到最強，所得最佳質(zhì)譜條件參數(shù)見表1。在優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件下8種甜味劑的總離子流（TIC）色譜圖見圖1。

表1　　8種甜味劑的質(zhì)譜分析參數(shù)

圖1　　 8種甜味劑混合標準溶液的總離子流色譜圖（200 μg/L）

2.1.3樣品前處理條件的選擇

由于白酒含有高比例的乙醇，若直接進樣分析，乙醇會影響8種甜味劑在反相C18柱上的保留時間和峰形，導(dǎo)致保留時間偏移，影響檢測結(jié)果的準確性和重現(xiàn)性。為了消除乙醇對檢測的影響，可采用加水稀釋、氮吹或旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的方法，考慮到氮吹和旋蒸操作相對復(fù)雜及耗時，本研究采用加水稀釋的方式。綜合考慮了乙醇濃度、色譜峰形和儀器響應(yīng)值等因素，最終確定稀釋倍數(shù)為5倍。

2.2方法的線性范圍和檢出限

將8種甜味劑混合標準儲備液用甲醇∶水（1∶9，v/v）溶液稀釋，分別配制成含量為10 μg/L、20 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、500 μg/L的混合標準工作液，按2.1所確定的色譜-質(zhì)譜條件進行測定，繪制標準工作曲線。以目標組分的峰面積y對相應(yīng)的質(zhì)量濃度x繪制標準曲線，相關(guān)系數(shù)（r）都在0.996以上。用信噪比（S/N）為3確定方法的檢出限（LOD），相關(guān)參數(shù)見表2。

2.3精密度和回收率

準確吸取空白白酒樣品，用微量移液器準確加入一定量的8種甜味劑混合標準溶液，配制成100 μg/L濃度水平進行回收實驗，按1.2節(jié)所述實驗步驟進行處理和測定，進行6次重復(fù)實驗，計算其回收率及相對標準偏差（RSD）。結(jié)果表明，白酒中8種甜味劑的回收率在89%～106%之間，相對標準偏差小于9%（表3）。方法的準確度和精密度均符合殘留分析的要求，可用于白酒中8種甜味劑的同時檢測。

表2　　8種甜味劑的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

表3　白酒中8種甜味劑的添加回收率和相對標準偏差（n=6）

2.4實際樣品的測定

按照本文建立的檢測方法，對90個市售白酒樣品進行了檢測，每個樣品重復(fù)測定3次，計算被測樣品中各種甜味劑的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4個樣品中檢測出甜蜜素，4個樣品檢出甜菊糖苷，2個樣品檢出紐甜，其中有2個樣品檢出2種甜味劑，其余5種甜味劑未檢出。實際樣品中各甜味劑檢測濃度水平范圍為100～1950 μg/L之間。

3　結(jié)論

本研究建立了超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀直接測定白酒中安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、阿力甜、紐甜和甜菊糖苷8種甜味劑含量的快速測定和確證方法。應(yīng)用本方法對白酒中的微量甜味劑進行檢測，前處理步驟簡單、分離度好、準確度和靈敏度高，能夠滿足白酒中多種痕量甜味劑殘留的分析要求，與國標方法相比，大大提高了分析效率。本方法的建立為白酒中甜味劑的檢測提供了可靠而準確的技術(shù)手段，對規(guī)范食品添加劑在食品中的使用行為具有重要意義。

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中圖分類號：TS262.3；TS261.7

文獻標識碼：A

文章編號：1001-9286（2016）05-0107-03

收稿日期：2015-11-13

作者簡介：柯潤輝（1980-），博士，高級工程師，主要研究方向為食品安全分析與檢測技術(shù)，E-mail：runhuike@163.com。

DOI：10.13746/j.njkj.2015418

Simultaneous Determination of Eight Sweeteners in Baijiu by UPLC-MS/MS

KE Runhui1，2，WANG Lijuan1，2，AN Hongmei1，2，HUANG Xinwang1，2，YIN Jianjun1，2and SONG Quanhou1，2
（1. China National Research Institute of Food & Fermentation Industries，Beijing 100015；2. National Food Quality Supervision and Inspection Center，Beijing 100015，China）

Abstract：The method of ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric（UPLC-MS/MS）had been developed for simultaneous determination of eight sweeteners in Baijiu as follows：liquor samples were diluted with distilled water，then filtered through 0.22 μm microporous membrane，and LC separation was performed on a Waters Acquity UPLC system with a HSS T3 column，and 0.1%（v/v）acetic acid-methanol solution were used as mobile phase for gradient elution，after LC separation，MS/MS was adopted for multiple reaction monitoring mode（MRM）. The calibration curves showed good linearity in the range of 10 μg/L to 500 μg/L with the correlation coefficients higher than 0.996. The limits of detection（LODs）were between 1 μg/L and 3 μg/L. The matrix recoveries were within 89%-106%and the relative standard deviations（RSDs）were lower than 9%（n=6）. Such method had the advantages including simple pretreatment，fast and accurate measurement，and high sensitivity，which was suitable for qualitative and quantitative measurement of sweeteners in Baijiu.

Key words：ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry；Baijiu；sweeteners