棉布支架固定化米根霉聯(lián)產(chǎn)果膠酶及用于處理煙梗

何源，鄭羽西，潘君，王遠亮（生物流變科學(xué)與技術(shù)教育部重點實驗室；生物材料與仿生工程中心；重慶大學(xué)生物工程學(xué)院，重慶 400044）

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研究開發(fā)

棉布支架固定化米根霉聯(lián)產(chǎn)果膠酶及用于處理煙梗

何源，鄭羽西，潘君，王遠亮
（生物流變科學(xué)與技術(shù)教育部重點實驗室；生物材料與仿生工程中心；重慶大學(xué)生物工程學(xué)院，重慶 400044）

摘要：利用果膠酶處理煙梗纖維生產(chǎn)乳酸等對環(huán)境友好，而應(yīng)用新的發(fā)酵組合方式和優(yōu)化發(fā)酵條件是提高產(chǎn)酶量，降低成本的有效途徑。本文采用實驗室研發(fā)的棉布支架固定化米根霉細胞的技術(shù)，優(yōu)化了底物為果膠或煙梗的發(fā)酵產(chǎn)果膠酶的培養(yǎng)條件，還優(yōu)化了處理煙梗果膠的條件。底物為果膠的最佳產(chǎn)酶條件為：轉(zhuǎn)速190r/min，裝液量50mL/250mL，發(fā)酵溫度30℃，初始pH值5，初始孢子濃度0.75×106個/mL。底物為煙梗的最佳產(chǎn)酶條件為：初始pH值4.6、初始孢子濃度0.5×106個/mL等。在優(yōu)化處理煙梗果膠的條件下，固定化米根霉產(chǎn)果膠酶連續(xù)法比游離的果膠酶法降解煙梗果膠的效果好，果膠降解率提高18.5%，達到74.1%。棉布支架固定化米根霉利用果膠發(fā)酵產(chǎn)果膠酶量較高，利用煙梗發(fā)酵脫膠效果較好。

關(guān)鍵詞：米根霉；果膠酶；固定化；生物脫膠；煙梗

第一作者：何源（1990—），男，碩士研究生。聯(lián)系人：王遠亮，教授，博士生導(dǎo)師，從事組織工程與生物材料。E-mail wyl@cqu.edu.cn。

四川、云南、貴州等是煙草資源較為豐富的省份，每年經(jīng)過打葉復(fù)烤會有大量的煙梗產(chǎn)生，絕大部分煙梗被廢棄，造成了資源的極大浪費，還給當(dāng)?shù)貛砹谁h(huán)境污染的問題［1-2］。對煙梗進行綜合開發(fā)、利用，是實現(xiàn)煙梗經(jīng)濟價值的重要途徑［3］。煙梗作為一種可再生天然纖維素資源，是生產(chǎn)乳酸等的有效碳源。天然纖維素的預(yù)處理方法中非酸的物理化學(xué)方法對原料中果膠等的處理不夠［4］。果膠是一種無定形的植物多糖，是胞間層的主要組成，在初生壁中與木質(zhì)纖維的微纖維以及某些伸展蛋白相互交聯(lián)作用［5］。果膠的去除可以改變纖維原料表面的物化性質(zhì)，增大其孔隙率和酶的接觸面積，從而提高纖維素的酶解率，此外還可減少黏性物質(zhì)對糖化過程高底物濃度導(dǎo)致的混合和傳熱的影響［6-8］。處理木質(zhì)纖維素中果膠的方法有物理化學(xué)法、微生物法和生物酶法［9］。物理化學(xué)法產(chǎn)生的廢酸液會嚴重污染環(huán)境，還可能產(chǎn)生高濃度的糠醛毒害發(fā)酵微生物［10］。生物酶法和微生物法因不存在上述缺點，所以受到人們的關(guān)注［7，11-12］。生物酶法和微生物法是直接利用果膠酶等或產(chǎn)果膠酶的微生物處理纖維素原料，從而獲得纖維素。

果膠酶是一類果膠分解酶的總稱，在食品、紡織、醫(yī)藥、造紙、環(huán)境、生物技術(shù)等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用，市場需求量越來越大［13］。米根霉是一種高商業(yè)價值的安全菌種，產(chǎn)生的果膠酶主要是聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonases，PG），該酶作用于部分D-半乳糖醛酸的α-1，4-糖苷鍵，有內(nèi)切酶和外切酶之分［14-15］。目前國內(nèi)外對黑曲霉、芽孢桿菌等生產(chǎn)果膠酶研究較多。對米根霉生產(chǎn)果膠酶的研究主要是利用橘子漿或橘皮的固態(tài)發(fā)酵［16-18］，由于發(fā)酵形式傳統(tǒng)，缺乏對培養(yǎng)基和條件的優(yōu)化，果膠酶產(chǎn)量不高。纖維類材料適合固定化細胞，能提高產(chǎn)酶量，有半連續(xù)和連續(xù)發(fā)酵的潛力［19-20］。棉布支架固定化效果好，適合發(fā)酵工藝的擴大化，便于工業(yè)上應(yīng)用［21］。本研究在已優(yōu)化的兩種培養(yǎng)基條件下，分別對棉布支架固定化米根霉的產(chǎn)果膠酶條件進行初步優(yōu)化，對游離的果膠酶直接處理煙梗的條件進行初步優(yōu)化，并與產(chǎn)酶優(yōu)化條件下的固定化米根霉連續(xù)化處理煙梗的效果進行比較。固定化米根霉產(chǎn)果膠酶連續(xù)化處理煙梗的方法有利于解決乳酸等生產(chǎn)過程中果膠帶來的系列問題，為天然纖維素資源生產(chǎn)乳酸等提供了一種新的微生物預(yù)處理方法。

1 材料與方法

1.1 原料

煙梗由重慶某公司提供，經(jīng)分揀、小型粉碎機粉碎過篩得50目粉末，放入干燥器待用。棉布支架由不銹鋼細網(wǎng)和棉布組成，幾何尺寸為長3.00cm× 高0.75cm的六角形支架，各分支成60°夾角，如圖1所示。

圖1 棉布支架的三視圖

1.2 菌種

米根霉（Rhizopus oryzae）As3.3158:產(chǎn)乳酸優(yōu)良型，中國科學(xué)院微生物研究所生產(chǎn)。

1.3 試劑

果膠（半乳糖醛酸≥74%，甲氧基≥6.7%，Sigma）；D-半乳糖醛酸（Sigma）；其余試劑均為國產(chǎn)試劑，分析純。

1.4 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基:PDA46g/L。滅菌后，倒入試管，傾斜擺放。

種子培養(yǎng)基:葡萄糖 30g/L，酵母提取物 2.5 g/L，自然pH值。

果膠發(fā)酵培養(yǎng)基:果膠25g/L，（NH4）2SO415g/L，K2HPO44g/L，KH2PO44g/L，ZnSO40.168g/L，Tween80 1.5 g/L，pH值5.8。

煙梗發(fā)酵培養(yǎng)基:煙梗20g/L，葡萄糖6g/L，硫酸銨3g/L，K2HPO42.0g/L，KH2PO42.0g/L，ZnSO40.168 g/L，Tween80 1g/L，自然pH值4.6。

以上培養(yǎng)基均采用 1×105Pa條件下，滅菌 20 min，pH值用 2mol/L NaOH和 1mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)。

1.5 固定化種子培養(yǎng)及發(fā)酵［21］

種子培養(yǎng)：用無菌生理鹽水洗脫PDA斜面培養(yǎng)基上的孢子。按接種后種子培養(yǎng)液中孢子濃度0.25×106個/mL，將孢子懸液加入 250mL三角瓶中，種子培養(yǎng)液50mL，加入1×105Pa滅菌30min的棉布支架一個，搖床轉(zhuǎn)速 170 r/min，30℃培養(yǎng)24h。

發(fā)酵培養(yǎng):棄去原種子液，將固定化的菌體用無菌水沖洗3次，然后將其裝入含有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，搖床轉(zhuǎn)速170r/min，30℃培養(yǎng)24h。

1.6 測定方法

果膠酶（pectinases，PEC）活力測定［22］:底物pH值調(diào)至4。酶活力單位定義:在45℃下，30min催化產(chǎn)生 1mg還原糖所需的酶量為一個酶活力單位（U）。聚半乳糖醛酸內(nèi)切酶（endopolygalacturonase，Endo-PG）活力測定［23］:底物pH值調(diào)至4。酶活力單位定義:在45℃下，30min使黏度下降50%所需要的酶量為一個酶活力單位（U）。

CMC酶活力定義:在50℃下，1h水解CMC-Na生成相當(dāng)于 1mg葡萄糖的還原糖的量為一個酶活力單位（U）。FPA酶活力定義:在50℃下，1h水解濾紙生成相當(dāng)于 1mg葡萄糖的還原糖的量為一個酶活力單位（U）。纖維素酶活力測定依據(jù)QB2583—2003。還原糖的測定采用DNS法［24］。

發(fā)酵粗酶液的制備:將發(fā)酵液在 4℃、8000 r/min離心5min后取上清液作為粗酶液，冰箱中4℃保存。粗酶液稀釋倍數(shù)的確定［25］:在不同稀釋倍數(shù)下，作稀釋倍數(shù)與酶活力的曲線選取偏差小，穩(wěn)定范圍較大的稀釋倍數(shù)。

生物量的測定:取出棉布支架，剝離菌體，三蒸水洗滌（當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基為果膠時，先用 6mol/L的鹽酸洗滌），過濾，于70℃烘至恒重。

果膠含量測定采用檸檬酸-乙醇沉淀法［26］。煙梗中纖維素、半纖維素、木質(zhì)素及灰分含量的測定參照文獻［27］。

1.7 產(chǎn)酶條件的優(yōu)化及數(shù)據(jù)分析

發(fā)酵底物為果膠時，研究搖床轉(zhuǎn)速、裝液量、發(fā)酵溫度、初始pH值和初始孢子濃度對固定化米根霉產(chǎn)果膠酶的影響。轉(zhuǎn)速梯度為 150r/min、170r/min、190r/min、210r/min；裝液量梯度為50mL、 60mL、70mL；發(fā)酵溫度梯度為28℃、30℃、32℃；初始pH值梯度為3、4、5、6、7、8；初始孢子濃度梯度為 0.25×106個/mL、0.50×106個/mL、0.75×106個/mL、1×106個/mL。每個因素的同一個水平重復(fù)3次。

發(fā)酵底物為煙梗時，主要研究初始pH值和初始孢子濃度對產(chǎn)酶的影響，梯度設(shè)置與上述相同。每個因素的同一個水平重復(fù)三次。

1.8 游離的果膠酶和固定化米根霉連續(xù)降解煙梗實驗

游離的果膠酶降解煙梗:研究了果膠酶量和液料比對煙梗果膠降解率的影響。果膠酶量梯度為400U/mL、600U/mL、800U/mL、1000U/mL；液料比梯度為10、15、20、25。酶解條件:初始pH值3.5，溫度45℃，搖速150r/min，反應(yīng)時間12h。以煙梗果膠的絕對降解率為指標，還測定了處理后煙梗果膠、纖維素、半纖維素及木質(zhì)素的相對百分含量。

固定化米根霉連續(xù)降解煙梗:在優(yōu)化后的產(chǎn)酶培養(yǎng)條件下進行發(fā)酵。測定了煙梗果膠的絕對降解率，還測定纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的絕對百分含量。發(fā)酵結(jié)束后取游離煙梗粉末測定果膠、纖維素、半纖維素及木質(zhì)素的相對百分含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 底物為果膠的發(fā)酵條件優(yōu)化

2.1.1 最佳轉(zhuǎn)速的確定

轉(zhuǎn)速影響培養(yǎng)液中溶解氧，較高轉(zhuǎn)速和較少裝液量下溶氧量較多，產(chǎn)酶量較大。固定化米根霉在190r/min時PEC產(chǎn)量達到最大，而在150r/min時Endo-PG產(chǎn)量最大，如圖 2所示。最低轉(zhuǎn)速下Endo-PG產(chǎn)量最大，可能是菌體對溶氧不足的響應(yīng)，通過合成更多Endo-PG減少培養(yǎng)基黏度，提高氧傳遞速率。過高轉(zhuǎn)速會帶來高剪切力，影響菌體形態(tài)，直接影響碳源分流，進而影響產(chǎn)酶量。以PEC產(chǎn)量為準，選擇轉(zhuǎn)速為190 r/min。

2.1.2 最佳裝液量的確定

裝液量也對培養(yǎng)液中的溶解氧有影響，裝液量越少，搖瓶中溶氧越多，產(chǎn)酶量越大。經(jīng)過不同的裝液量培養(yǎng)，在裝液量為50mL（滿足菌體被浸沒）時，PEC和Endo-PG產(chǎn)量較大，如圖3所示。

2.1.3 最佳發(fā)酵溫度的確定

溫度對微生物生長和代謝產(chǎn)物合成的影響是許多因素綜合作用的體現(xiàn)。發(fā)酵溫度升高，酶反應(yīng)速率增加，菌體生長代謝加快，產(chǎn)物提前產(chǎn)生。但溫度升高，酶失活加快，菌體易衰老，合成產(chǎn)物受影響。溫度還對發(fā)酵液中溶解氧含量有直接的影響。如圖4所示，在30℃時PEC、Endo-PG產(chǎn)量均達到最大。

2.1.4 最佳初始pH值的確定

不同初始pH值會改變底物帶電性，會抑制或激活酶的活性使菌體代謝途徑發(fā)生改變，會改變細胞原生質(zhì)膜的電荷使膜的滲透性改變，從而影響米根霉對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。如圖5所示，在pH值為4～5時，PEC和Endo-PG產(chǎn)量均較高。在pH值分別為5～7和5～6時，產(chǎn)酶量急劇減少，在pH值為7～8時，產(chǎn)酶趨于平穩(wěn)。這可能與酶最適pH值有關(guān)，米根霉產(chǎn)生的Endo-PG的最適pH值為4.5［28］，果膠裂解酶最適pH值為7.5且在酸性條件下酶活力和穩(wěn)定性極低［29］，真菌產(chǎn)生果膠酯酶最適pH值一般偏酸性。本研究初始pH值選為5。

圖2 不同轉(zhuǎn)速下底物為果膠的果膠酶產(chǎn)酶

圖3 不同裝液量下底物為果膠的果膠酶產(chǎn)量

圖4 不同發(fā)酵溫度下底物為果膠的果膠酶產(chǎn)量

2.1.5 最佳初始孢子濃度的確定

孢子濃度與生物量關(guān)系密切，合適的生物量避免細胞之間對營養(yǎng)物質(zhì)激烈的競爭，對生長和產(chǎn)酶有利。如圖6所示，PEC和Endo-PG產(chǎn)量的變化趨勢相近，在濃度為0.75×106個/mL時產(chǎn)酶達到最高。

2.2 底物為果膠的固定化米根霉產(chǎn)果膠酶動力學(xué)行為

圖5 不同初始pH值下底物為果膠的果膠酶產(chǎn)量

圖6 不同初始孢子濃度下底物為果膠的果膠酶產(chǎn)量

如圖7所示，PEC和Endo-PG的最高產(chǎn)量分別在30h和72h達到，發(fā)酵前24h產(chǎn)酶量急劇增加，48h后PEC產(chǎn)量下降較快而Endo-PG產(chǎn)量平穩(wěn)；pH值變化呈V形，pH值由5到3再到6.4；生物量持續(xù)增加，在96h時達到最大。PEC和Endo-PG產(chǎn)量變化顯著不同，可能是由于產(chǎn)物的抑制作用，也可能是由于發(fā)酵條件的變化，如pH值等［30］；pH值的V形變化與寡聚半乳糖醛酸、半乳糖醛酸等酸性物質(zhì)的產(chǎn)生和消耗或堿性化合物的產(chǎn)生有關(guān)［31］。因此造成了PEC產(chǎn)量變化與pH值變化表現(xiàn)出較強的負相關(guān)性。

由于PEC的大小受底物、稀釋倍數(shù)等影響，因此PEC產(chǎn)量估計在3.34×102～1.00×103U/mL。有研究報道固定化黑曲霉的果膠酶產(chǎn)量為0.64×102U/mL［20］和固定化芽孢桿菌的果膠酶產(chǎn)量為 8.55×102U/mL［32］。因此固定化米根霉利用果膠產(chǎn)果膠酶能達到或高于已有產(chǎn)酶水平，具有可開發(fā)前景。

2.3 底物為煙梗的發(fā)酵條件優(yōu)化

底物為果膠的產(chǎn)酶研究發(fā)現(xiàn)，初始pH值和初始孢子濃度對產(chǎn)酶有較大影響，因此主要對這兩個因素進行優(yōu)化。在轉(zhuǎn)速190r/min、裝液量50mL/250 mL、發(fā)酵溫度30℃下，研究這兩個因素對產(chǎn)酶的影響。如圖8和圖9所示，初始pH值、初始孢子濃度對產(chǎn)酶的影響與底物為果膠產(chǎn)酶時相似，初始pH值在自然pH值4.6時產(chǎn)酶最佳，初始孢子濃度在0.5×106個/mL時產(chǎn)酶量最高。

2.4 底物為煙梗的固定化米根霉產(chǎn)果膠酶動力學(xué)行為

如圖10所示，發(fā)酵過程中PEC和Endo-PG產(chǎn)量分別在24h和96h較高，發(fā)酵前24 h產(chǎn)酶量急劇增加，48h后PEC產(chǎn)量下降較快而Endo-PG產(chǎn)量繼續(xù)增加；pH值由4.6持續(xù)增加至6.8；總量濃度呈V形變化且在24h最低。底物為煙梗的發(fā)酵產(chǎn)酶變化、菌體量變化與底物為果膠的發(fā)酵類似，這可能是葡萄糖被米根霉利用合成大量果膠酶等，加劇了煙梗多糖被降解利用的程度，同時菌體量得以增加。pH值變化與底物為果膠的pH值變化不同，這可能是由于煙梗果膠含量相對較少，產(chǎn)生的酸性物質(zhì)很快被消耗。

2.5 游離的果膠酶法和固定化米根霉連續(xù)法處理煙梗

2.5.1 游離的果膠酶法處理煙梗

最佳果膠酶量的確定，如圖11所示，隨果膠酶量的增加，果膠降解率增加，酶量大于600U/mL時，增加不明顯；隨酶量的增加，煙梗質(zhì)量損失增加；綜合考慮降解效果和經(jīng)濟成本，選擇為600U/mL。最佳液料比的確定，如圖12所示，隨液料比的增大，果膠的降解率和煙梗質(zhì)量損失的變化呈倒V形，在液料比為20時，果膠降解率較大為55.6%，高于文獻報道的42%［33］。

2.5.2 固定化米根霉連續(xù)法處理煙梗

圖7 底物為果膠的固定化米根霉產(chǎn)果膠酶動力學(xué)行為

圖8 不同初始pH值下底物為煙梗的果膠酶產(chǎn)量

圖9 不同初始孢子濃度下底物為煙梗的果膠酶產(chǎn)量

圖10 底物為煙梗的固定化米根霉產(chǎn)果膠酶動力學(xué)行為

如圖13所示，煙梗果膠降解率在前期急劇增加，然后變慢，96h后降解率為74.1%。纖維素酶產(chǎn)量峰值出現(xiàn)在24h，48h后產(chǎn)酶較低平，如圖14所示。煙梗經(jīng)過米根霉發(fā)酵，植物性多糖如果膠、半纖維素和纖維素等被不同程度利用。如圖15所示，發(fā)酵 96h后煙梗各物質(zhì)的絕對含量為果膠25.9%、半纖維素 45.5%、纖維素 86.7%和木質(zhì)素98%，煙梗中果膠與半纖維素降解較多且變化相似，纖維素降解較少，木質(zhì)素基本不變。這是由于米根霉缺乏降解木質(zhì)素的酶類，因此木質(zhì)素含量變化不大。纖維素由于結(jié)晶性對酶的高度抵制及有限的酶結(jié)合位點數(shù)又可能受到果膠和半纖維等的屏蔽作用使之難以被微生物利用。由于無定性的半纖維素和果膠易與微生物產(chǎn)生的酶作用，因此它們的損失較大，煙梗果膠降解率為74.1%，高于文獻報道45%［34］。

2.5.3 游離果膠酶法和固定化米根霉連續(xù)法處理煙梗效果的比較

煙梗經(jīng)不同方法處理后各組分相對含量如表 1所示。煙梗經(jīng)固定化米根霉連續(xù)法處理后，纖維素和木質(zhì)素的含量增加明顯，果膠含量變化不大。經(jīng)米根霉處理的煙梗與未經(jīng)過處理煙梗相比，果膠含量增加2.2%，纖維素含量提高2.9倍，半纖維素含量持平，木質(zhì)素提高3.4倍。而游離果膠酶法（酶量為 1000U/mL）處理的煙梗與未處理煙梗相比，果膠含量增加4.4%，纖維素含量提高1.4倍，半纖維含量提高1.2倍，木質(zhì)素提高1.4倍。

圖11 不同果膠酶量下果膠降解率和煙梗損失率

圖12 不同液料比下果膠降解率和煙梗損失率

圖13 發(fā)酵過程中果膠降解率與果膠酶產(chǎn)量變化

圖14 發(fā)酵過程中纖維素酶產(chǎn)量變化

圖15 發(fā)酵過程中果膠和木質(zhì)纖維素絕對含量變化

固定化米根霉連續(xù)法與游離果膠酶法處理煙梗相比，煙梗果膠降解率提高18.5%。這是由于一方面菌體合成較為豐富的酶系利用煙梗，另一方面菌體消耗了酶解產(chǎn)物避免了底物對酶的抑制作用。通過對煙梗果膠和半纖維素（主要為木糖）的去除，使煙梗的結(jié)構(gòu)變得疏松，纖維素的相對含量增加，纖維表面與酶接觸的可及度增大，有利于提高酶解煙梗產(chǎn)糖率和緩解木糖對米根霉產(chǎn)乳酸的抑制作用［7，35-36］。

表1 煙梗經(jīng)不同方法處理后各組分相對含量

3 結(jié) 論

（1）通過單因素試驗對固定化米根霉利用果膠產(chǎn)果膠酶條件進行優(yōu)化，得到的優(yōu)化條件如下:最佳轉(zhuǎn)速190r/min，最佳裝液量50mL/250mL，最佳發(fā)酵溫度30℃，最佳初始pH值5，最佳初始孢子濃度0.75×106個/mL，PEC和Endo-PG產(chǎn)量最高能達到1.00×103U/mL和1.91×102U/mL。

（2）通過單因素法優(yōu)化影響固定化米根霉利用煙梗產(chǎn)果膠酶的兩個關(guān)鍵因素，得到優(yōu)化條件如下:最佳初始 pH值 4.6，最佳初始孢子濃度 0.5×106個/mL，其他條件不變，PEC和Endo-PG產(chǎn)量最高能達到3.42×102U/mL和5.27×10 U/mL。

（3）棉布支架固定化米根霉在利用果膠發(fā)酵產(chǎn)果膠酶的產(chǎn)量約 3.34×102～1.00×103U/mL，在利用煙梗發(fā)酵產(chǎn)果膠酶的產(chǎn)量約 1.14×102～3.42×102U/mL，達到或高于已有產(chǎn)酶水平。

（4）通過優(yōu)化處理煙梗的條件，得到結(jié)果如下:游離的果膠酶法在酶量600U/mL、液料比20等條件下，煙梗果膠降解率達到55.6%；固定化米根霉連續(xù)法在優(yōu)化產(chǎn)酶的條件下，煙梗果膠降解率達到為74.1%，半纖維素降解率達到54.5%。

（5）棉布支架固定米根霉產(chǎn)果膠酶連續(xù)化處理煙梗的研究表明，這不僅能獲得一定量果膠酶，還能大量降解煙梗中果膠和半纖維素等，為天然纖維素資源生產(chǎn)乳酸等提供了一種新的微生物預(yù)處理方法。

參 考 文 獻

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Pectinase production with Rhizopus oryzae mycelium immobilized on cotton matrix and treatment of tobacco stem

HE Yuan，ZHENG Yuxi，PAN Jun，WANG Yuanliang
（Key Laboratory of Biorheological Science and Technology，Ministry of Education；Center of Bioinspired Material Science and Engineering；Bioengineering College，Chongqing University，Chongqing 400044，China）

Abstract：The use of pectinases causes less environmental pollution in tobacco stem fiber processing for the production of lactic acid，etc. The effective way to improve pectinase production and reduce cost is to use a new combined fermentation mode and optimize its conditions. Mycelia of Rhizopus oryzae were immobilized on the cotton matrix by immobilized cells technology developed in our laboratory. Conditions of pectinase production were optimized in culture medium of pectin or tobacco stem and the treatments of tobacco stem pectin were also optimized. The optimal fermentation conditions in pectin medium were rotary speed of 190r/min，liquid volume of 50mL/250mL，temperature of 30℃，pH value of 5，and spore concentration of 0.75×106/mL. The optimal fermentation conditions in tobacco stem medium were，pH value of 4.6，spore concentration of 0.5×106/mL，etc. Under the optimal treatment conditions of tobacco stem pectin，immobilized Rhizopus oryzae continuous processing method showed a better pectin degradation performance than the free pectinases processing method with the pectin degradation rate increased by 18.5%，up to 74.1%. Pectinase production with Rhizopus oryzae mycelium immobilized on the cotton matrix showed a higher pectinase production in pectin medium and better tobacco stem fiber degumming in tobacco stemfermentation.

Key words：Rhizopus oryzae；pectinase；immobilization；bio-degumming； tobacco stem

中圖分類號：TQ 920.6

文獻標志碼：A

文章編號：1000-6613（2016）05-1494-08

DOI：10.16085/j.issn.1000-6613.2016.05.34

收稿日期：2015-11-10；修改稿日期：2015-12-24。

基金項目：國家自然科學(xué)基金（30870609）及重慶市自然科學(xué)基金重點項目（CSTC2012JJB90009）。