類球紅細菌輔酶Q10發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化*

.福建師范大學生命科學學院　2.廈門市科環(huán)海洋生物科技有限公司　周　勇　鄭　毅

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類球紅細菌輔酶Q10發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化*

1.福建師范大學生命科學學院2.廈門市科環(huán)海洋生物科技有限公司周勇1,2鄭毅1

[摘要]為了提高類球紅細菌輔酶Q10的發(fā)酵能力，本研究對發(fā)酵培養(yǎng)基中重要因子進行優(yōu)化組合。首先對重要因子進行單因子實驗，確定最佳濃度范圍。在最佳濃度范圍內進行均勻設計試驗，分別采用多項式逐步回歸、偏最小二乘二次回歸、偏最小二乘二次回歸（考慮交換項）、偏最小二乘二次回歸（考慮平方項）分析。結果表明，偏最小二乘二次回歸分析的優(yōu)化方案預測值與實驗值最為接近，顯示各因子濃度與輔酶Q10濃度呈現二次曲線關系，各因子間的交換作用不能忽略。偏最小二乘二次回歸分析優(yōu)化方案使輔酶Q10濃度得到明顯提高，輔酶Q10的發(fā)酵水平達到230.71mg.L-1，比優(yōu)化前提高了53.81%。

[關鍵詞]類球紅細菌輔酶Q10均勻設計偏最小二乘二次回歸

輔酶Q（Coenzyme Q，CoQ）又稱泛醌（Ubiquinone），是自然界中廣泛存在的脂溶性醌類化合物，存在于原核生物的細胞膜或真核生物的線粒體內膜的磷脂雙分子層的疏水區(qū)域中。輔酶Q是有氧呼吸電子傳遞鏈的重要遞氫體，同時也是一種天然的抗氧化性劑和非特異免疫增強劑，在多種疾病中具有良好的輔助醫(yī)療效果[1, 2]。

目前輔酶 Q10的制備方法有三種：動植物組織提取法、化學合成法、微生物發(fā)酵生產法[3]。由于微生物發(fā)酵法的產物為天然物質，生物活性高、容易被人體吸收[4]，成為制備輔酶 Q10最有潛力的方法與研究熱點。發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化是提高微生物代謝產物積累水平最有效的辦法。于子玲等[5]采用Plackett-Burman實驗設計和Box- Behnken響應面分析方法對輔酶Q10生產菌的發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，優(yōu)化后輔酶Q10產量為51.31mg/L，比優(yōu)化前提高了 99.34%。邵玲莉等[6]對輔酶Q10生產菌鞘氨醇單胞菌YZ0803的發(fā)酵條件進行探討及組分的正交試驗優(yōu)化，在搖瓶水平上，輔酶 Q10的最終濃度高達192mg/L，比優(yōu)化前提高了39.13%。

均勻設計法[7]是一種常用的因子優(yōu)化組合方法，它利用試驗設計和數學建模，通過局部試驗回歸，擬合因素與結果間的全局函數關系，從而能獲得比較準確的優(yōu)化組合。

本文先采用單因子實驗，確定基礎培養(yǎng)基中重要成分的適宜濃度范圍。在單因子實驗基礎上，對重要因子進行均勻設計試驗，分別采用二次多項式逐步回歸、偏最小二乘二次回歸、偏最小二乘二次回歸（考慮交換項）、偏最小二乘二次回歸（考慮平方項）分析，以期提高類球紅細菌產輔酶Q10的發(fā)酵水平。

1　材料和方法

1.1菌株

類球紅細菌（Rhodobacter sphaeroides），本實驗室選育保藏。

1.2培養(yǎng)基

（1）瓊脂平板培養(yǎng)基（單位：g·L-1）：葡萄糖18、酵母粉4.5、味精2、(NH4)2SO45.25、MgSO48.75、KH2PO41.5、FeSO41.2、NaCl4.2、瓊脂粉 20。

（2）種子培養(yǎng)基：與瓊脂平板培養(yǎng)基相同，但不添加瓊脂，另外添加0.5% CaCO3作為pH緩沖劑。

（3）基礎培養(yǎng)基（單位：g·L-1）：葡萄糖20、玉米漿粉3.5、味精2.5、(NH4)2SO44.0、MgSO41.0、KH2PO41.2、FeSO41.6、NaCl 3.5、A 0.1、B 0.1，添加1% CaCO3作為pH緩沖劑。

1.3培養(yǎng)方法

從活化的瓊脂平板培養(yǎng)基上，挑取單菌落，接入裝有20mL種子培養(yǎng)基的 250mL三角瓶中，在溫度 32℃、轉速220r/min下培養(yǎng)24h，作為搖瓶種子液；按10%接種量，將種子液接入 45mL基礎培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，在溫度32℃、轉速220r/min下培養(yǎng)48h。

1.4輔酶Q10的提取及檢測

采用超聲波提取法[8, 9]破碎細胞，獲得輔酶 Q10；采用HPLC法[10]測定輔酶Q10濃度。

1.5實驗方法

（1）采用單因子實驗，確定基礎培養(yǎng)基中重要成分的最佳濃度范圍。

（2）在Data Processing Statio（DPS)7.05軟件中對重要因子進行均勻設計實驗，分別采用二次多項式逐步回歸、偏最小二乘二次回歸、偏最小二乘二次回歸（考慮交換項）、偏最小二乘二次回歸（考慮平方項）分析，得出不同的優(yōu)化方案。通過驗證實驗，確定輔酶 Q10發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳優(yōu)化組合。

2　結果與分析

2.1重要組分的單因子濃度實驗

在輔酶Q10基礎培養(yǎng)基上，分別對葡萄糖、玉米漿粉、(NH4)2SO4、味精進行單因子優(yōu)化試驗，結果見圖1～圖4。

圖1　葡萄糖對輔酶Q10產量的影響

圖2　玉米漿粉對輔酶Q10產量的影響

圖3　(NH4)2SO4對輔酶Q10產量的影響

圖4　味精對輔酶Q10產量的影響

由圖1～圖4可初步確定這4種成分的最佳濃度范圍：葡萄糖25~40g·L-1、玉米漿粉5~9g·L-1、(NH4)2SO43~7g·L-1、味精5~9g·L-1。

2.2均勻設計試驗表格及實施

在葡萄糖、玉米漿粉、(NH4)2SO4、味精的單因子濃度基礎上，按照均勻設計表U15（54）進行試驗設計，各因子濃度安排水平見表1。

表1　均勻設計試驗因素水平

將上述4種組分的濃度水平按照DPS7.05軟件自動生成的均勻設計表U15（54）排列，培養(yǎng)基其他組分濃度按照基礎培養(yǎng)基進行，試驗結果見表2。

表2　4種培養(yǎng)基成分均勻設計優(yōu)化

2.3均勻設計試驗數據統(tǒng)計分析

2.3.1二次多項式逐步回歸分析

采用二次多項式逐步回歸分析法對表2進行數據分析，得到以下數學模型方程：

此回歸方程相關系數R2=0.9998，表明方程有效?？傮w顯著性檢驗值 F=222.25，顯著水平 P=0.05，表明該模型可信度高。其優(yōu)化組合為：葡萄糖38g·L-1、(NH4)2SO47.5 g·L-1、味精6.0 g·L-1、玉米漿粉7.0 g·L-1。結果表明，輔酶Q10積累濃度為221m g·L-1，與模型預測值（249mg·L-1）相差11.24%，這表明二次多項式逐步回歸分析法所建立的模型不能很好反映出因子與響應值的非線性關系。

2.3.2偏最小二乘二次回歸分析

對表2數據進行偏最小二乘二次回歸、偏最小二乘二次回歸（考慮平方項）、偏最小二乘二次回歸（考慮交換項）分析得出不同的優(yōu)化方案，結果見表3。

表3　培養(yǎng)基不同優(yōu)化方案對輔酶Q10發(fā)酵的影響

由表3可知，偏最小二乘二次回歸、偏最小二乘二次回歸（考慮平方項）、偏最小二乘二次回歸（考交換項）的實驗值相差不大，但是后兩者的預測值與實驗值偏差要大于前者。這表明，上述4個因子濃度與輔酶Q10濃度呈二次曲線關系，同時各因子間的交換作用不可忽略。如果在偏最小二乘二次回歸分析中，只考慮各因子的平方項或各因子間的互作項時，則分析預測值與實驗值都有較大的偏差。所以將偏最小二乘二次回歸分析方案作為輔酶Q10發(fā)酵培養(yǎng)基最佳優(yōu)化方案：葡萄糖38 g·L-1、玉米漿粉7.0 g·L-1、硫酸銨3.5g·L-1、味精 7.2 g·L-1。該優(yōu)化方案下的輔酶 Q10濃度為 230.71 mg·L-1，比優(yōu)化前（150 mg·L-1）提高了53.81%。

3　結論

本實驗先采用單因子實驗，確定基礎培養(yǎng)基中重要成分的適宜濃度范圍，再采用均勻設計對重要因子進行優(yōu)化組合，分別進行二次多項式逐步回歸、偏最小二乘二次回歸、偏最小二乘二次回歸（考慮交換項）、偏最小二乘二次回歸（考慮平方項）分析。結果表明，各因子的平方項和各因子間的互作項對響應值都具有影響作用。偏最小二乘二次回歸分析的模型預測值與實驗值偏差最小，其優(yōu)化方案使輔酶 Q10濃度得到明顯提高。

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* 福建省自然基金資助，項目編號：2015J01127。