PCV2人工感染對(duì)豬肺泡巨噬細(xì)胞干擾素信號(hào)通路的調(diào)控研究

趙其嶺，張新晨，陳萌萌，孫嘉瑞，鮑恩東，張書霞，呂英軍

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，南京 210095)

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PCV2人工感染對(duì)豬肺泡巨噬細(xì)胞干擾素信號(hào)通路的調(diào)控研究

趙其嶺，張新晨，陳萌萌，孫嘉瑞，鮑恩東，張書霞，呂英軍*

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，南京 210095)

摘要：通過(guò)建立PCV2亞臨床感染模型，探究感染仔豬肺泡巨噬細(xì)胞中干擾素的變化及其調(diào)控，為PCV2復(fù)制和發(fā)病機(jī)制研究提供補(bǔ)充。30日齡豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)和豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)抗原和抗體均為陰性的仔豬15頭，隨機(jī)分成PCV2陰性對(duì)照0 d組、PCV2感染14 d組和PCV2感染28 d組。感染后熒光定量PCR方法檢測(cè)肺泡巨噬細(xì)胞中干擾素、模式識(shí)別受體和模式識(shí)別受體接頭分子mRNA水平。結(jié)果顯示，IFN-β和IFN-γ mRNA轉(zhuǎn)錄水平在14和28 d均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；模式識(shí)別受體RIG-1、MDA-5、TLR4和TLR9 mRNA轉(zhuǎn)錄水平在14和28 d顯著升高(P<0.05)；DAImRNA轉(zhuǎn)錄水平在14 d顯著升高(P<0.05)，但28 d迅速下降；TLR3、TLR7和TLR8 mRNA轉(zhuǎn)錄水平無(wú)明顯變化。接頭分子MAVS、MyD88、IRF3和IRF7 mRNA轉(zhuǎn)錄水平在14和28 d均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。以上結(jié)果表明，PCV2亞臨床感染仔豬后導(dǎo)致肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)IFN-β和IFN-γ的表達(dá)量上調(diào)，其上調(diào)和PCV2激活的TLR4/TLR9/MyD88和RIG-1/MDA-5/DAI/MAVS/IRF3信號(hào)通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞：PCV2；仔豬；肺泡巨噬細(xì)胞；干擾素；模式識(shí)別受體

豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus，PCV)，是無(wú)囊膜的單股環(huán)狀負(fù)鏈DNA病毒，屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，有PCV1和PCV2兩種血清型[1]。PCV1無(wú)致病性，PCV2通常以亞臨床感染和斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(postweaning multisystemic wasring syndrome，PMWS)的形式發(fā)病。 PCV2單獨(dú)感染不會(huì)導(dǎo)致明顯的臨床癥狀，必須在其他病原微生物(如PRRSV、豬支原體)共感染或應(yīng)激性因素的條件下導(dǎo)致疾病。目前對(duì)影響PCV2增殖的具體機(jī)制仍然不清楚，有體外試驗(yàn)表明感染過(guò)程中產(chǎn)生的氧化自由基、應(yīng)激中產(chǎn)生的熱休克蛋白70和27以及免疫刺激物ConA和LPS均可促使PCV2在PK-15或者淋巴細(xì)胞中的增殖[2-5]；令人意外的是在PK-15細(xì)胞中添加干擾素α或γ也能導(dǎo)致PCV2病毒的增殖且呈劑量依賴性關(guān)系[6-7]，而且研究表明干擾素導(dǎo)致的PCV2的增殖和該病毒的干擾素刺激元件(ISRE)有關(guān)，將其ISRE元件突變后，干擾素不能促進(jìn)PCV2病毒的增殖[8]，目前這是干擾素能促進(jìn)病毒增殖的唯一報(bào)道；但在臨床感染的在體試驗(yàn)中沒(méi)有得到相同結(jié)果，注射干擾素γ沒(méi)能促進(jìn)PCV2在豬體內(nèi)的增殖[9]。以上看似矛盾的研究結(jié)果表明干擾素和PCV2感染增殖存在密切關(guān)系，那么PCV2感染機(jī)體后是如何調(diào)控宿主細(xì)胞產(chǎn)生干擾素反應(yīng)的，對(duì)此研究將有利于更加認(rèn)清PCV2的復(fù)制和致病機(jī)制。

以往研究表明機(jī)體天然免疫能通過(guò)特定模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors，PRRs)識(shí)別病原表面相關(guān)分子(pathogen associated molecular proteins，PAMPs)，從而激活相關(guān)信號(hào)通路，進(jìn)而誘導(dǎo)干擾素和炎癥相關(guān)因子的生成，以發(fā)揮病原微生物的清除和免疫功能[10]。模式識(shí)別受體主要包括Toll樣受體、RIG-1樣受體和DAI受體，那么這些模式識(shí)別受體是否參與了PCV2感染過(guò)程中干擾素的生成，目前為止未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)擬通過(guò)建立PCV2亞臨床感染模型，以PCV2易感靶細(xì)胞巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象，探究PCV2亞臨床感染仔豬的干擾素變化及其調(diào)控，為研究PCV2的增殖和發(fā)病機(jī)制提供補(bǔ)充。

1材料與方法

1.1病毒

PCV2-Shanghai株(PCV2-HS，GenBank No.AY686763)由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部細(xì)菌學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室分離、保存，通過(guò)間接免疫熒光試驗(yàn)測(cè)定，病毒滴度為5×105TCID50·mL-1。

1.2主要儀器與試劑

主要儀器：多功能酶標(biāo)儀Infinite200(瑞士TECAN公司)，熒光定量PCR儀器ABI7500 (美國(guó)Applied Biosystems公司)，Zeiss熒光顯微鏡(德國(guó)Carl Zeiss公司)，高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)。

主要試劑：Trizol(日本TaKaRa公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光染料(諾維贊生物科技有限公司)，動(dòng)物基因組提取試劑盒(生興生物科技有限公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和使用均按照南京農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)管理?xiàng)l例進(jìn)行。15頭經(jīng)ELISA和PCR檢測(cè)血清中PCV2和PRRSV抗體和抗原均為陰性的30日齡斷奶仔豬，常規(guī)飼養(yǎng)1周以消除應(yīng)激，隨機(jī)分成三組(每組5頭)：PCV2陰性對(duì)照0 d組，PCV2亞臨床感染14 d組，PCV2亞臨床感染28 d組。對(duì)照組仔豬每頭滴鼻和肌肉注射各2 mL PBS，試驗(yàn)組仔豬每頭滴鼻和肌肉注射各2 mL 5×105TCID50·mL-1PCV2懸液。接種后第0、14和28天處以安樂(lè)死，頸靜脈注射10 mg·kg-1的3%戊巴比妥鈉注射液，采取肺和血液，部分肺組織固定于3.7%～4%甲醛溶液，血液離心后收集血清并于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4肺泡巨噬細(xì)胞的獲取

無(wú)菌摘除肺，根據(jù)以往的實(shí)驗(yàn)方法[11]，采用支氣管肺泡灌洗法分離豬肺泡巨噬細(xì)胞(AMs)，細(xì)胞純度可達(dá)99%以上，將肺泡巨噬細(xì)胞液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5血清中PCV2抗體和肺中PCV2抗原檢測(cè)

根據(jù)以往報(bào)道[12-13]，采用阻斷ELISA的方法檢測(cè)血清中PCV2抗體水平。血清阻斷率PI=(陰性O(shè)D-待檢OD)/陰性O(shè)D，當(dāng)PI≥38%，判為陽(yáng)性；PI≤30%，判為陰性；其間，判為可疑。

基因組提取試劑盒提取肺總DNA，常規(guī)PCR方法擴(kuò)增肺中抗原PCV2，引物序列：primer 1 5′-TGACCTGTCTACTGCTGTG-3′，primer 2 5′-CC-GTGGATAGTTCTGTAGCA-3′，目的大小為476 bp。實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)肺中PCV2的含量，以陽(yáng)性質(zhì)粒pT-SH(實(shí)驗(yàn)室保存)10倍倍比稀釋作為模板，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待檢樣品相應(yīng)的拷貝數(shù)，實(shí)時(shí)定量PCR引物序列：primer 1 5′-CCAGGAGGGCGTTCTGAC-3′，primer 2 5′-CGTTACCGCTGGAGAAGGAA-3′。

1.6熒光定量PCR方法檢測(cè)肺泡巨噬細(xì)胞干擾素、模式識(shí)別受體和信號(hào)通路接頭分子mRNA轉(zhuǎn)錄水平

按照Trizol操作說(shuō)明書提取肺泡巨噬細(xì)胞總mRNA，酶標(biāo)儀測(cè)定RNA濃度和純度，調(diào)整所有樣品總mRNA為同一濃度，及時(shí)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ｒ驭?actin為內(nèi)參，熒光定量PCR方法檢測(cè)肺泡巨噬細(xì)胞干擾素、模式識(shí)別受體和信號(hào)通路接頭分子mRNA轉(zhuǎn)錄水平，引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)體系為2 μL cDNA，10 μL SYBR?Green Master Mix，0.4 μL上游引物，0.4 μL下游引物，7.2 μL三蒸水。采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行基因水平變化的測(cè)定，計(jì)算公式為：目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCt

ΔΔCt=(Ct目的基因mRNA-Ctβ-actin)試驗(yàn)組-(Ct目的基因mRNA-Ctβ-actin)對(duì)照組

1.7數(shù)據(jù)分析

2結(jié)果

2.1仔豬感染PCV2測(cè)定

*.P<0.05，下圖同*.P<0.05，the same as below圖1　血清PCV2抗體檢測(cè)Fig.1　The detection of PCV2 antibody

PCV2攻毒后0～28 d每隔1 d檢測(cè)一次豬的直腸溫度，期間溫度保持正常水平，沒(méi)有體溫升高現(xiàn)象。肉眼觀察各組臟器，除感染14 d組和28 d組淋巴結(jié)有輕微腫大外其他臟器形態(tài)結(jié)構(gòu)均無(wú)明顯變化。阻斷ELISA方法檢測(cè)豬血清中PCV2抗體水平，結(jié)果顯示0 d對(duì)照組血清抗體阻斷率均≤30%，為PCV2抗體陰性，PCV2感染后7到28 d血清中抗體阻斷率均≥38%，為PCV2抗體陽(yáng)性，感染組抗體阻斷率與0 d對(duì)照組相比有顯著升高(P<0.05)(圖1)。普通PCR檢測(cè)肺中PCV2抗原，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠成像系統(tǒng)分析，0 d對(duì)照組沒(méi)有目的條帶，為PCV2抗原陰性；感染14 d組和28 d組有明顯的目的條帶，為PCV2抗原陽(yáng)性(圖2A)。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)PCV2 DNA含量，根據(jù)樣品Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算對(duì)應(yīng)病毒拷貝數(shù)，結(jié)果顯示每50 mg肺組織中PCV2病毒DNA量在14和28 d平均值分別為7.0×103copies和1.9×104copies(圖2B)。以上試驗(yàn)結(jié)果表明試驗(yàn)豬感染PCV2病毒，但沒(méi)有表現(xiàn)出典型臨床癥狀，根據(jù)J.Segalés[14]的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)(豬沒(méi)有明顯臨床癥狀；淋巴結(jié)沒(méi)有或者出現(xiàn)輕微病理?yè)p傷；可檢測(cè)到一定量PCV2抗原和抗體)，試驗(yàn)豬處于亞臨床感染狀態(tài)。2.2PCV2亞臨床感染對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞中β-actin的影響

PCV2亞臨床感染對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞中內(nèi)參β-actin的影響(圖3)。三個(gè)試驗(yàn)組分別以等量cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，得到內(nèi)參Ct值，表明對(duì)照組和試驗(yàn)組中β-actin的轉(zhuǎn)錄量處于同一水平，即PCV2感染后對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞中內(nèi)參基因β-actin的表達(dá)沒(méi)有影響。

2.3PCV2亞臨床感染對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的干擾素mRNA的影響

PCV2亞臨床感染對(duì)仔豬肺泡巨噬細(xì)胞干擾素IFN-α、IFN-β、IFN-γ mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響(圖4)。干擾素IFN-β和IFN-γ mRNA轉(zhuǎn)錄水平在14和28 d顯著高于對(duì)照組(P<0.05)； 然而IFN-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有明顯變化(P>0.05)。結(jié)果表明，PCV2亞臨床感染上調(diào)IFN-β和IFN-γ的表達(dá)，但對(duì)IFN-α沒(méi)有影響。

表1　RT-PCR測(cè)定肺泡巨噬細(xì)胞相關(guān)基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平引物序列及其參數(shù)

圖2　肺中PCV2 抗原和病毒拷貝數(shù)檢測(cè)Fig.2　The detection of PCV2 antigens and DNA copies in lungs

2.4PCV2亞臨床感染對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞模式識(shí)別受體TLRs、RLRs和DAI的影響

PCV2亞臨床感染對(duì)仔豬肺泡巨噬細(xì)胞模式識(shí)別受體(TLR3、TLR4、TLR7、TLR8、TLR9、RIG-1、MDA-5和DAI)相應(yīng)mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響見(jiàn)圖5。TLR4、TLR9、RIG-1和MDA-5 mRNA轉(zhuǎn)錄水平在14和28 d均顯著升高(P<0.05)，在28 d均有所下降，但仍顯著高于0 d對(duì)照組(P<0.05)；DAImRNA轉(zhuǎn)錄水平在14 d顯著升高(P<0.05)，但在28 d迅速下降；與陰性對(duì)照組比，TLR3、TLR7和TLR8 mRNA轉(zhuǎn)錄水平在14和

28 d沒(méi)有明顯變化。結(jié)果表明，PCV2亞臨床感染影響模式識(shí)別受體TLR4、TLR9、RIG-1、MDA-5和DAI的轉(zhuǎn)錄，但對(duì)TLR3、TLR7和TLR8轉(zhuǎn)錄無(wú)作用。

圖3　PCV2亞臨床感染對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞中內(nèi)參β-actin的影響Fig.3　Change of β-actin in AMs after piglets subclinically infected with PCV2

圖4　PCV2亞臨床感染后肺泡巨噬細(xì)胞干擾素的變化Fig.4　Changes of IFNs in AMs after piglets subclinically infected with PCV2

圖5　PCV2亞臨床感染后肺泡巨噬細(xì)胞TLRs、RLRs和DAI的變化Fig.5　Changes of TLRs，RLRs and DAI in AMs after piglets subclinically infected with PCV2

2.5PCV2亞臨床感染對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞信號(hào)通路接頭分子MyD88、MAVS、IRF3和IRF7的影響

PCV2亞臨床感染對(duì)仔豬肺泡巨噬細(xì)胞中MyD88、MAVS、IRF3和IRF7的相應(yīng)mRNA水平影響見(jiàn)圖6。MyD88和MAVSmRNA轉(zhuǎn)錄水平在14和28 d均顯著升高(P<0.05)；干擾素調(diào)節(jié)因子IRF3和IRF7 mRNA轉(zhuǎn)錄水平在14和28 d顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)果表明，PCV2亞臨床感染顯著上調(diào)了接頭蛋白MyD88、MAVS、IRF3和IRF7的基因轉(zhuǎn)錄。

圖6　PCV2亞臨床感染后肺泡巨噬細(xì)胞MyD88、MAVS、IRF3和IRF7的變化Fig.6　Changes of MyD88，MAVS，IRF3 and IRF7 in AMs after piglets subclinically infected with PCV2

3討論

以往的體外試驗(yàn)研究表明IFN-β和IFN-γ有利于PCV2的增殖[6-7]，但體內(nèi)試驗(yàn)沒(méi)能觀察到相同的現(xiàn)象，反而表明干擾素抑制病毒的增殖[9]，這相互矛盾的研究結(jié)果引起了作者對(duì)干擾素在PCV2感染過(guò)程中作用的興趣。干擾素作為機(jī)體先天性免疫中的第一道防線，在PCV2感染過(guò)程中是如何變化的，又是怎樣調(diào)控的，目前報(bào)道甚少，對(duì)此的研究將有利于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)PCV2復(fù)制和致病機(jī)制。在本試驗(yàn)中，PCV2感染仔豬14和28 d肺泡巨噬細(xì)胞中IFN-β和IFN-γ mRNA的水平明顯高于陰性對(duì)照組，這和以往的試驗(yàn)結(jié)果一致[15-16]，而IFN-α水平與對(duì)照組相比沒(méi)有差異，在以往研究同樣表明單獨(dú)PCV2感染仔豬后淋巴細(xì)胞中的IFN-α轉(zhuǎn)錄無(wú)變化或僅輕微的上調(diào)[17]。

病毒、細(xì)菌等病原微生物入侵機(jī)體后，細(xì)胞上模式識(shí)別受體能偵測(cè)到病原微生物表面模式相關(guān)分子，進(jìn)而激活干擾素生成而起抗病毒作用，或者通過(guò)NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生發(fā)生炎癥反應(yīng)，從而構(gòu)成機(jī)體抵御病原體入侵的第一道天然屏障。目前研究表明，參與病毒激活機(jī)體誘導(dǎo)干擾素生成的模式識(shí)別受體主要有Toll樣受體、RIG-1樣受體和DAI受體。

Toll樣受體被激活后，可通過(guò)髓樣分化因子(MyD88)依賴性的信號(hào)通路和MyD88非依賴性的TRIF信號(hào)通路促使NF-κB入核，從而誘導(dǎo)干擾素和細(xì)胞因子的生成。豬的TLRs主要包括定位于質(zhì)膜上的TLR2、TLR3和定位于細(xì)胞器內(nèi)的TLR4、TLR7、TLR8和TLR9，其中TLR2和TLR4主要識(shí)別病毒的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)成分，TLR3、TLR7、TLR8和TLR9主要識(shí)別病毒的核酸成分，TLR9也可識(shí)別非甲基化CpG脫氧核苷酸(CpG oligoswoxy nucleotode，CpG ODN)。在本試驗(yàn)中仔豬感染PCV2后肺泡巨噬細(xì)胞中TLR4在14 d和TLR9在14和28 d的轉(zhuǎn)錄水平明顯高于陰性對(duì)照組，而其他TLRs轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有變化，并且MyD88的表達(dá)在14和28 d明顯上調(diào)，這表明PCV2感染仔豬后激活了TLR4和TLR9，進(jìn)而激活MyD88接頭蛋白，從而可能導(dǎo)致了干擾素的產(chǎn)生。TLR4的上調(diào)可能是識(shí)別了PCV2編碼的蛋白質(zhì)(如衣殼蛋白)引起的，而TLR9上調(diào)可能是與PCV2基因組中存在65個(gè)CpG二核苷酸有關(guān)[18]。張亞群等[19]用PCV2體外感染豬肺泡巨噬細(xì)胞發(fā)現(xiàn)TLRs在處理的不同時(shí)間點(diǎn)均有不同程度的上升，而我們?cè)囼?yàn)中僅看到TLR4和TLR9轉(zhuǎn)錄的上調(diào)，這可能和PCV2感染方式、感染數(shù)量或者體內(nèi)外試驗(yàn)不同有關(guān)；另外，P.Y.Tu等[17]研究表明PCV2感染仔豬后淋巴結(jié)中TLR2上調(diào)，TLR7轉(zhuǎn)錄下調(diào)，而其他TLRs無(wú)變化，表明PCV2感染機(jī)體后在不同的免疫細(xì)胞中，激活TLRs的類型是不一樣的。值得注意的是，PCV2感染過(guò)程中不僅會(huì)產(chǎn)生干擾素，也會(huì)對(duì)其他細(xì)胞因子(如IL-1、IL-6和TNF-α)的產(chǎn)生進(jìn)行調(diào)控，而這些細(xì)胞因子的生成也需要激活NF-κB，因而PCV2感染過(guò)程中激活的TLR4和TLR9信號(hào)通路是否參與了干擾素生成以及其在干擾素生成過(guò)程中的貢獻(xiàn)大小還有待進(jìn)一步研究。

RIG-1樣受體和DAI受體是位于細(xì)胞內(nèi)另外一類受體，很多病毒感染機(jī)體后干擾素的生成和它們有關(guān)，如PRRSV、豬流感病毒、豬流行性腹瀉病毒等。RIG-1樣受體包括RIG-1和MDA-5，它們能識(shí)別病毒的RNA，激活的RIG-1和MDA-5，可通過(guò)MAVS接頭蛋白導(dǎo)致IRF3和IRF7的磷酸化或者NF-κB入核，從而最后導(dǎo)致干擾素的生成。在作者試驗(yàn)中，PCV2感染仔豬后肺泡巨噬細(xì)胞中14和28 dRIG-1和MDA-5的轉(zhuǎn)錄水平明顯上升，而且MAVS、IRF3和IRF7的轉(zhuǎn)錄水平也明顯上調(diào)，這表明PCV2激活RIG-1/MAVS/IRF3和MDA-5/MAVS/IRF3信號(hào)通路從而導(dǎo)致了干擾素的上調(diào)。PCV2雖然是單股DNA病毒，但當(dāng)感染宿主后，細(xì)胞內(nèi)的RNA聚合酶可以以病毒DNA模板合成5′-三磷酸雙鏈RNA[20]，這可能是PCV2能被RIG-1和MDA-5識(shí)別的原因。DAI是最近新發(fā)現(xiàn)的模式識(shí)別受體，它能識(shí)別病毒的DNA，從而激活I(lǐng)RF3誘導(dǎo)干擾素的生成[21]。在本試驗(yàn)中PCV2感染后肺泡巨噬細(xì)胞中DAI轉(zhuǎn)錄水平在14 d顯著上調(diào)，這表明PCV2也激活了DAI信號(hào)通路，從而調(diào)控干擾素的生成。

4結(jié)論

PCV2亞臨床感染仔豬后可導(dǎo)致肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)IFN-β和IFN-γ的上調(diào)，其上調(diào)和PCV2激活的TLR4/TLR9/MyD88信號(hào)通路以及RIG-1/MDA-5/DAI/MAVS/IRF3信號(hào)通路有關(guān)。

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(編輯白永平)

Regulation of Interferon Signaling Pathway in Alveolar Macrophages of Piglets Infected with Procine Circovirus Type 2

ZHAO Qi-ling，ZHANG Xin-chen，CHEN Meng-meng，SUN Jia-rui，BAO En-dong，ZHANG Shu-xia，Lü Ying-jun*

(CollegeofVeterinaryMedicine，NanjingAgriculturalUniversity，Nanjing210095，China)

Abstract:To understand the mechanism of PCV2 replication and pathogenesis，change and regulation of interferon in alveolar macrophages of piglets subclinically infected with procine circovirus type 2(PCV2) were studied.Fifteen 30-day-old piglets were selected as experiment animals，which were free of PCV2 and porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV) antibody and antigen.The piglets were divided into three groups：control group(0 dpi)，PCV2 infection group(14 dpi) and PCV2 infection group(28 dpi).After infection，the mRNA transcription of interferon，pattern recognition receptors(PRRs) and pathogen associated molecular proteins(PAMPs) in AMs were detected by real-time PCR.The results showed that the mRNA levels ofIFN-β andIFN-γ were significantly higher at 14 dpi and 28 dpi(P<0.05)；the mRNA expression ofRIG-1，MDA-5，TLR4 andTLR9 were significantly increased at 14 dpi and 28 dpi(P<0.05)；the mRNA level ofDAIwas significantly elevated at 14 dpi(P<0.05)，and then decreased at 28 dpi；while there were no significant change in mRNA expression ofTLR3，TLR7 andTLR8.Compared with control，the mRNA transcription ofMAVS，MyD88，IRF3 andIRF7 were significantly increased at 14 dpi and 28 dpi(P<0.05).These results demonstrate that the up-regulations ofIFN-β andIFN-γ in alveolar macrophages of PCV2 subclinical infection are relative to TLR4/TLR9/MyD88 and RIG-1/MDA-5/DAI/MAVS/IRF3 signaling pathways.

Key words:procine circovirus type2；piglet；alveolar macrophages；interferon；pattern recognition receptors

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.03.023

收稿日期：2015-08-04

基金項(xiàng)目：江蘇省自然科學(xué)基金(BK2011646)；國(guó)家自然科學(xué)基金(31101786)；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程

作者簡(jiǎn)介：趙其嶺(1989-)，男，山東臨沂人，碩士生，主要從事動(dòng)物免疫病理學(xué)研究，E-mail:2013107032@njau.edu.cn *通信作者：呂英軍，副教授，碩導(dǎo)，主要從事動(dòng)物免疫病理學(xué)研究，Tel:025-84395316,E-mail:lyj@njau.edu.cn

中圖分類號(hào)：S852.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):0366-6964(2016)03-0587-08